基因組學概述課件

第11章基因組與比較基因組學

11.1人工染色體構建11.2高通量DNA序列分析技術11.3新的測序策略--全基因組鳥槍法測序11.4全基因組序列分析--基因組學的新內容

11.5人類基因組計劃11.6比較基因組學(Comparativegenomics)

11.1人工染色體構建

1983年，美國的Dana-Farber癌癥研究所和哈佛大學醫(yī)學院的教授首次在Nature上發(fā)表文章，報道了構建YAC（YeastArtificialChromosome）庫的過程。1987年，Burke等人發(fā)現(xiàn)，僅僅帶有ARS序列(autonomousreplicatingsequence)的載體雖然能夠被復制，但極易在有絲分裂時丟失。即使在選擇培養(yǎng)基上，也只有5%-20%的子代細胞帶有ARS載體。加入Centromeres（CEN）能顯著提高ARS質粒在有絲分裂時的穩(wěn)定性，90%以上子代細胞帶有該載體。CEN還能顯著降低拷貝數(shù)，從20-50/細胞降為1-2/細胞。（Science,236:806-812）。

人工染色體含有三種必需成分：著絲粒、端粒和復制起點。

著絲粒(CEN)位于染色體中央，呈紐扣狀結構，在有絲分裂時結合微管并調控染色體的運動，也是姐妹染色單體配對時的最后位點，接收細胞信號而使姐妹染色體分開。

端粒（TEL）：主要功能是防止染色體融合、降解、確保其完整復制。端粒酶以其自身RNA為模板，在染色體端部添加上端粒重復序列，并參與端粒長度和細胞增殖的調控。

復制起點：DNA復制通常由起始蛋白與特定的DNA序列相互作用開始。載體的概念：1.要把一個有用的基因（目的基因——研究或應用基因）通過基因工程手段送到生物細胞（受體細胞），需要運載工具（交通工具）攜帶外源基因進入受體細胞，這種運載工具就叫做載體（vector）。

2.凡來源于質?；蚴删w的DNA分子，可以插入或克隆DNA片段統(tǒng)稱為vector。3.基因工程所用的vector實際上是DNA分子，是用來攜帶目的基因片段進入受體細胞的DNA。說明：1.穿梭載體（sbuttlevector）

指在兩種宿主生物體內復制的載體分子，因而可以運載目的基因（穿梭往返兩種生物之間，如：YEP,DIDB2192.YAC

YeastArtificialChromsome由酵母基因和PBR322質粒衍生物構成，對克隆大的真核基因十分有用，在HGP中發(fā)揮主要作用。3.BAC

細菌人工染色體。YAC的主要缺點

1．存在高比例的嵌合體，即一個YAC克隆含有兩個本來不相連的獨立片段；

2．部分克隆子不穩(wěn)定，在轉代培養(yǎng)中可能會發(fā)生缺失或重排；

3．難與酵母染色體區(qū)分開，因為YAC與酵母染色體具有相似的結構。

4．操作時容易發(fā)生染色體機械切割。

以細菌寄主系統(tǒng)為基礎的克隆載體形成嵌合體的頻率較低，轉化效率高，又易于分離?？茖W家用"染色體建造"法用F質粒及其調控基因構建細菌載體，克隆大片段DNA。該質粒主要包括oriS，repE（控制F質粒復制）和parA、parB（控制拷貝數(shù)）等成分。

有人把人類染色體端粒DNA上單個α-衛(wèi)星DNA單元多聚化形成1Mb左右的大片段并與人類基因組DNA混合，產(chǎn)生了能被復制、能正常分裂并得到長期穩(wěn)定保存的人工合成的染色體，長度約為6-10Mb，稱為MAC或HAC。

人類基因組線粒體基因組(16.6kb)核基因組(3200Mb)基因外序列基因和基因有關序列約10%約90%專一或中等重復序列Non-codingDNA假基因內含子基因片段<10%>90%專一的或低拷貝數(shù)序列中度至高度重復序列20~30%70~80%分散重復序列串聯(lián)重復序列/成簇重復序列約60%約40%蛋白編碼基因rRNA基因tRNA基因CodingDNA在大規(guī)模DNA測序中，目標DNA分子的長度可達上百萬個bp。現(xiàn)在還不能直接測定整個分子的序列，然而，可以得到待測序列的一系列序列片段。序列片段是DNA雙螺旋中的一條鏈的子序列（或子串）。這些序列片段覆蓋待測序列，并且序列片段之間也存在著相互覆蓋或者重疊。在一般情況下，對于一個特定的片段，我們不知道它是屬于正向鏈還是屬于反向鏈，也不知道該片段相對于起點的位置。另外，這樣的序列片段中還可能隱含錯誤的信息。序列片段的長度范圍300－1000bp，而目標序列的長度范圍是3100萬bp，總的片段數(shù)目可達上千個。DNA序列片段組裝（sequenceassembly)，又稱序列拼接）的任務就是根據(jù)這些序列片段，重建目標DNA序列。如果能夠得到DNA一條鏈的序列，那么根據(jù)互補原則，另一條鏈的序列也就得到了。11.2高通量DNA序列分析技術完整基因組的測序過程一般包括三個步驟：（1）建立克隆的物理圖譜：如酵母人工染色體YAC（YeastArtificialChromosome）克隆、細菌人工染色體BAC（BacterialArtificialChromosome）克隆等；（2）測定每個克隆的序列；（3）序列拼裝和注釋：當?shù)玫揭欢蜠NA序列之后，可以利用序列分析工具，進行序列的拼接；繼而通過與數(shù)據(jù)庫序列的比較，得到與該序列相關的信息，如基因、調控元件、重復區(qū)域等，進而對序列的生物學特性進行注釋。

雜交測序法質譜法單分子測序法原子探針顯微鏡測序法DNA芯片法經(jīng)典方法:Sanger雙脫氧鏈終止法(Sanger,1977)Maxam-GilbertDNA化學降解法(Maxam&Gilbert,1977)新技術方法:Sanger雙脫氧鏈終止法原理：

雙脫氧鏈終止法要求使用一種單鏈的DNA模板和一種適當?shù)腄NA合成引物。利用DNA聚合酶的兩種酶催化反應的特性：第一，DNA聚合酶能夠利用單鏈的DNA為模板，合成出準確的DNA互補鏈；第二，DNA聚合酶能夠利用2’，3’-雙脫氧核苷三磷酸作底物，使之參入到寡核苷酸鏈的3’-末端，從而終止DNA鏈的延長。*少一個－OH脫氧核甘酸與雙脫氧核甘酸結構比較Sanger第一步：加入復制終止劑熒光檢測探頭電泳，看誰跑得快Sanger第二步：熒光檢測GelElectrophoresis

DNAFragmentSizeDeterminationDNA帶負電DNA在電泳膠中的遷移率與其片段大小有關堿基特異性化學切割反應：硫酸二甲酯（DMS）：使DNA分子中鳥嘌呤（G）上的N7原子甲基化。肼：使DNA分子中胸腺嘧啶（T）和胞嘧啶（C）的嘧啶環(huán)斷裂；但高鹽條件下，只C斷裂，而不與T反應。哌啶：從修飾甲基處斷裂核苷酸鏈。在不同的酸、堿、高鹽和低鹽條件下，三種化學試劑按不同組合可以特異地切割核苷酸序列中特定的堿基。G反應：DMS使G在中性和高溫條件下脫落。G+A反應：酸性條件（如甲酸）可使A和G嘌呤環(huán)上的N原子質子化，利用哌啶使A、G脫落。T+C反應：肼（低鹽）C反應：肼（高鹽）測定DNA長度~250bp?；瘜W裂解法測定DNA的核苷酸序列雜交法SBH（Sequencingbyhybridization）用特定長度的具有所有可能堿基序列的寡核苷酸探針與未知序列的DNA片段雜交。根據(jù)某些探針形成的完全雙鏈，推知目的DNA的堿基序列。

步驟：

1.將待測的靶DNA分子與一組已知核苷酸序列的寡核苷酸探針進行雜交2.對能與待測DNA雜交的探針之間的堿基重疊關系作比較分析，據(jù)此推算靶DNA的核苷酸序列。

兩種操作方式：

1.將不同的寡核苷酸與固定在濾膜上的靶DNA序列樣品進行雜交2.應用寡核苷酸矩陣芯片的DNA雜交測序法全基因組鳥槍法測序的主要步驟

第一，建立高度隨機、插入片段大小為2kb左右的基因組文庫。克隆數(shù)要達到一定數(shù)量，即經(jīng)末端測序的克隆片段的堿基總數(shù)應達到基因組5倍以上。第二，高效、大規(guī)模的末端測序。對文庫中每一個克隆，進行兩端測序，TIGR在完成流感嗜血桿菌的基因組時，使用了14臺測序儀，用三個月時間完成了必需的28,463個測序反應，測序總長度達6倍基因組。第三，序列集合。TIGR發(fā)展了新的軟件，修改了序列集合規(guī)則以最大限度地排除錯誤的連鎖匹配。第四，填補缺口。有兩種待填補的缺口，一是沒有相應模板DNA的物理缺口，二是有模板DNA但未測序的序列缺口。他們建立了插入片段為15-20kb的λ文庫以備缺口填補。

鳥槍法測序的缺點隨著所測基因組總量增大，所需測序的片段大量增加，造成重復測定，也易丟失某些序列，且數(shù)據(jù)處理分析工作量大。高等真核生物（如人類）基因組中有大量重復序列，導致判斷失誤。鳥槍法測序的缺點

對鳥槍法的改進

(1)Clonecontig法。首先用稀有內切酶把待測基因組降解為數(shù)百kb以上的片段，再分別測序。(2)靶標鳥槍法(diretedshotgun)。首先根據(jù)染色體上已知基因和標記的位置來確定部分DNA片段的相對位置，再逐步縮小各片段之間的缺口。一些常見的縮寫

SSLPs,simplesequencelengthpolymorphisms;

STRs,simpletandemrepeats;

SNPs,singlenucleotidepolymorphisms.

LINEs,longinterspersednuclearelements;

SINEs,shortinterspersednuclearelements;

LTR,longterminalrepeat.

FISH,FluorescentinsituHybridization;

STS,SequenceTaggedSite

EST,EndSequenceTag.DNA全序列切成小段小段和載體結合結合后進行測序MapfragmentsSequenceoverlapping

fragmentsAssembled

sequence基因組DNA序列測定示意圖通過隨機剪切得到的大分子DNA片段克隆到載體上。繪制出這些重疊片段的圖譜，并對重疊片段進行測序，通過“拼裝”得到基因組序列。另一種方法不是根據(jù)片段的染色體位置，而是根據(jù)其重疊部分進行“拼裝”。Sequenceallfragmentsandassemble11.4全基因組序列分析--基因組學的新內容1．數(shù)據(jù)存放。

2．堿基百分含量分析。無論是GC富含區(qū)還是AT富含區(qū)，都可能是一些特殊功能的區(qū)域。

肺炎支原體GC百分含量高和GC百分含量低的區(qū)域對應于重組值較低的區(qū)域，包括著絲粒和端粒，而尿殖道支原體GC百分含量最低的區(qū)域對應于rRNA和tRNA。流感嗜血桿菌GC百分含量高的區(qū)域也對應于6個rRNA基因。

3.ORF分析。首先要用多個不同的軟件來要找到并估測基因組中的每一個ORF。通過比較確知其功能的；

在數(shù)據(jù)庫中有相匹配的蛋白質序列，但不知其能的；

在數(shù)據(jù)庫中找不到任何相匹配蛋白質序列的新基因。

1995年，J.C.Venter所領導的TIGR（TheInstituteofGenomicReseach）完成了第一個單細胞自由生物基因組，流感嗜血桿菌(HaemopophilusinfluenzaeRd)全序列測定。1996年他們又完成了擁有最小基因組的單細胞生物尿殖道支原體(Mycoplasmagenitalium)和一種不同于原核、真核生物的單細胞生物--產(chǎn)甲烷古細菌(Methanococcusjannaschi)的全序列測定。德國人則測定了肺炎支原體(Mycoplasmapneumoniae)基因組全序列。與此同時，歷時七年(1989-1996年)的第一個真核生物釀酒酵母(Saccharomycescevevisiae)基因組計劃在歐共體及美、日、加、英等各國實驗室共同努力下得以完成。1997年大腸桿菌(Escherichia.ColiS)的基因組計劃完成，美麗隱桿線蟲(caenothabditiselegans)的基因組計劃也于1998年完成。

最受矚目的人類基因組計劃(HGP,HumanGenomeProject)也于2000年底前完成。

DNA序列分析的內容

確定開放讀碼內含子與外顯子DNA序列拼接

基因組學

Genomics基因

合成有功能的蛋白質或RNA所必需的全部DNA序列，即一個基因不僅包括編碼蛋白質或RNA的核酸序列，還應包括為保證轉錄所必需的調控序列?；蚪M(genome)泛指一個有生命體、病毒或細胞器的全部遺傳物質；在真核生物，基因組是指一套染色體（單倍體）DNA。

基因組學概念及范疇基因組學(genomics)就是發(fā)展和應用DNA制圖、測序新技術以及計算機程序，分析生命體（包括人類）全部基因組結構及功能。基因組學包括3個不同的亞領域結構基因組學(structuralgenomics)功能基因組學(functionalgenomics)比較基因組學(comparativegenomics)基因組學概念*結構基因組學結構基因組學(structuralgenomics)是通過HGP的實施來完成的。HGP的內容就是制作高分辨率的人類遺傳圖和物理圖，最終完成人類和其它重要模式生物全部基因組DNA序列測定，因此HGP屬于結構基因組學范疇。11.5人類基因組計劃

humangenomeproject，HGP1、HGP簡介人類基因組計劃是由美國科學家于1985年率先提出、于1990年正式啟動的。美國、英國、法國、德國、日本和我國科學家共同參與了這一價值達30億美元的人類基因組計劃。這一計劃旨在為30多億個堿基，編碼了5萬-6萬個基因。對構成的人類基因組精確測序，發(fā)現(xiàn)所有人類基因并搞清其在染色體上的位置，破譯人類全部遺傳信息。為什么選擇人類的基因組進行研究？

人類是在“進化”歷程上最高級的生物認識自身掌握生老病死規(guī)律疾病的診斷和治療了解生命的起源在人類基因組計劃中，包括對五種生物基因組的研究：大腸桿菌、酵母、線蟲、果蠅和小鼠，稱之為人類的五種“模式生物”。HGP的誕生1984年12月Utah州的Alta,WhiteR受美國能源部的委托，主持召開了一個小型會議，討論DNA重組技術的發(fā)展及測定人類整個基因組的DNA序列的意義。1985年6月，在美國加州舉行了一次會議，美國能源部提出了“人類基因組計劃”的初步草案。1986年6月，在新墨西哥州討論了這一計劃的可行性。隨后美國能源部宣布實施這一草案。1987年初，美國能源部與國家醫(yī)學研究院（NIH）為“人類基因組計劃”下?lián)芰藛咏?jīng)費約550萬美元，1987年總額近1.66億美元。同時，美國開始籌建人類基因組計劃實驗室。1989年美國成立“國家人類基因組研究中心”。諾貝爾獎金獲得者J.Waston出任第一任主任。1990年，歷經(jīng)5年辯論之后，美國國會批準美國的“人類基因組計劃”于10月1日正式啟動。美國的人類基因組計劃總體規(guī)劃是：擬在15年內至少投入30億美元，進行對人類全基因組的分析。2000年，人類基因組草圖完成。2003年，人類基因組計劃完成。

人類基因組計劃的科學意義確定人類基因組所攜帶的全部遺傳信息，認識自我，揭開人來生長發(fā)育的奧秘，追求健康，戰(zhàn)勝疾病，是人類基因組計劃的最終目標。人類基因組計劃的科學意義在于：

確定人類基因組中約5萬個編碼基因的序列及其再基因組中的物理位置，研究基因的產(chǎn)物及其功能。了解轉錄核剪接調控元件的結構與位置，從整個基因這樣結構的宏觀水平上理解基因轉錄與轉錄后調節(jié)。從整體上了解染色體結構，包括各種重復序列以及非轉錄“框架序列”的大小和組織，了解各種不同序列在形成染色體結構、DNA復制、基因轉錄及表達調控中的影響與作用。研究空間結構對基因調節(jié)的作用。從三維空間的角度來研究真核基因的表達調控規(guī)律。發(fā)現(xiàn)與DNA復制、重組等有關的序列。研究DNA突變、重排和染色體斷裂等，了解疾病的分子機制，包括遺傳性疾病、易感性疾病甚至感染性疾病引發(fā)的分子病理學改變及其進程，為這些疾病的診斷、預防和治療提供理論依據(jù)。確定人類基因組中轉座子、逆轉座子和病毒殘余粗劣，研究其周圍序列的性質。研究染色體和個體之間的多態(tài)性。2、HGP的主要任務遺傳圖譜物理圖譜轉錄圖譜序列圖譜遺傳圖遺傳圖（genotiomap）又稱為連鎖圖（linkagemap）：是指基因或DNA標志在染色體上的相對位置與遺傳距離，通常以基因或DNA片段在染色體交換過程中的分離頻率厘摩（cM1%的重組率稱為1cM。）來表示。cM值越大，兩者之間距離越遠。連鎖分析是經(jīng)典遺傳學的重要內容，實質是通過分析同一遺傳位點在不同個體中等位基因的不同（多態(tài)性）來研究同一染色體上兩個位點之間的相互關系?？茖W上用兩個位點之間的交換或重組頻率來表示其“遺傳學距離”經(jīng)典的遺傳標記是可被電泳或免疫技術檢出的蛋白質標記，如紅細胞ABO血型位點標記，白細胞HLA位點標記等。例如，在ABO血型基因中，位于9號染色體長臂3區(qū)4帶（9q34）的基因IA，決定抗原A的存在，表現(xiàn)A型血性狀。由于ABO血型的廣泛存在，所以可用它作遺傳標記。當在某一家庭中，觀察到了指甲髕骨綜合征與A型血相伴遺傳時，科學家就認為，這種病的致病基因NP與IA基因相連鎖，也位于9q34區(qū)段。進一步的觀察發(fā)現(xiàn)，這個家庭的后代中，有1/10為A型血而無指甲髕骨綜合征，這表明基因IA和NP發(fā)生了交換，交換率（重組率）為1/10。這時就可說，基因IA和NP相距較近，連鎖圖上的距離為10厘摩（重組率1％即為1厘摩）。

如果只用已知定位的少數(shù)幾個基因作遺傳標記，由于遺傳標記的數(shù)目太少，很難繪制完整的連鎖圖。DNA技術的建立為人類提供了大量新的遺傳標記。

第一代DNA遺傳標記是RFLP（RestrictionFragmentLengthPolymorphism，限制性片段長度多態(tài)性）。DNA序列上的微小變化，甚至1個核苷酸的變化，也能引起限制性內切酶切點的丟失或產(chǎn)生，導致酶切片段長度的變化。由于核苷酸序列的改變遍及整個基因組，特別是進化中選擇壓力不是很大的非編碼序列之中，RFLP的出現(xiàn)頻率遠遠超過了經(jīng)典的蛋白質多態(tài)性。而且，只要選擇得當，生物體內出現(xiàn)共顯性RFLP及RAPD分子標記的頻率較高。RFLP分子表集中的顯性與共顯多肽性分子機制第二代DNA遺傳標記利用了存在于人類基因組中的大量重復序列，包括重復單位長度在15-65個核苷酸左右的小衛(wèi)星DNA（minisatelliteDNA），重復單位長度在2-6個核苷酸之間的微衛(wèi)星DNA（microsatelliteDNA），后者又稱為簡短串聯(lián)重復（STR、STRP或SSLP，shorttandemrepeatpolymorphism或者simplesequencelengthpolymorphism）。STRP有兩個最突出的優(yōu)點，即作為遺傳標記的“多態(tài)性”與“高頻率”。人類基因組中的遺傳多態(tài)性大多表現(xiàn)在重復序列上，特別是短串聯(lián)重復序列，如小衛(wèi)星DNA核微衛(wèi)星DNA上，其多態(tài)性主要來自重復序列拷貝數(shù)的變化。小衛(wèi)星DNA一般不超過20kb，由15-65bp的基本單位串聯(lián)重復而成。有高度變異性但卻按照孟德爾的規(guī)律遺傳，所以，他們是很好的DNA多態(tài)性標記，被廣泛應用于基因定位、DNA指紋分析和遺傳病的連鎖診斷。

第三代DNA遺傳標記，可能也是最好的遺傳標記，是分散于基因組中的單個堿基的差異。這種差異包括單個堿基的缺失和插入，但更常見的是單個核苷酸的替換，即單核苷酸的多態(tài)性（SNP，singlenucleotidepolymorphism）。SNP與RFLP核STRP標記的主要不同之處在于，它不再以DNA片段的長度的變化作為檢測手段，直接以序列變異作為標記。SNP遺傳標記分析完全屏棄了經(jīng)典的凝膠電泳，代以最新的DNA芯片技術，是人類基因組“遺傳圖”發(fā)展方向。人類基因組中的SNP作為一穿標記的分子機制

“遺傳圖”的建立為人類疾病相關基因的分離克隆奠定了基礎。擁有5000多個遺傳學位點，相當于把整個人類基因組劃分為5000多個小區(qū)，并分別設置了“標牌”。這些標牌將在搜索功能基因的過程中發(fā)揮獨特的作用。把多態(tài)性的疾病基因位點（該位點至少包括“正?！奔啊爸虏　眱蓚€等位基因）與上述遺傳標記進行分析比較時，如果在家系中證實該基因與某個標記不連鎖（重組率為50%），表明該基因不在這一標記附近；如果發(fā)現(xiàn)該基因與某個標記有一定程度的“連鎖”（重組率小于50%但大于0），表明它可能位于這個標記附近；如果該基因與某標記間不發(fā)生重組（重組率等于0），我們就推測該標記與所研究的疾病基因可能非常接近。

遺傳圖所表現(xiàn)的，是通過連鎖分析確定的各基因間的相對位置；物理圖則表現(xiàn)染色體上每個DNA片段的實際順序。物理圖是指以已知核苷酸序列的DNA片段（序列標簽位點，sequence-taggedsite，STS）為“路標”，以堿基對（bp，kb，Mb）作為基本測量單位（圖距）的基因組圖。

物理圖（PhysicalMap）用STS標簽技術制作基因組的物理圖轉錄圖分離純化mRNA（或cDNA），就是抓住了基因組的主要成分（可轉錄部分）。人類的基因轉錄圖（expressionprofiling）（cDNA圖），或者基因的cDNA片段圖，即表達序列標簽圖（EST，expressedsequencetag）是人類基因組圖的雛形。人類基因組中，只有1%-5%的序列編碼了蛋白質，最多可能有（5-7）萬個蛋白質編碼基因。生產(chǎn)EST的主要程序如下：分離特定組織再某以發(fā)展階段或某種生理條件下的總mRNA，合成cDNA并進行序列分析。將基因表達譜中的已知基因按照其功能核亞細胞定位分成若干類，主要包括蛋白質合成相干蛋白、細胞骨架蛋白、細胞漿蛋白、核蛋白、膜蛋白、分泌蛋白、未定位或功能未知蛋白。根據(jù)不同的細胞表型吧各類蛋白分成若干亞類，如胞漿蛋白就被分為與能了代謝相關蛋白、溶酶體蛋白、信號轉導蛋白等。人類基因組的序列圖人類基因組的核苷酸序列圖（human