脂肪干細(xì)胞成脂誘導(dǎo)及鑒定程序

i試劑名稱ii濃度ii商品信息ij1.極限必須培養(yǎng)基j|(Dulbecco’SModifiedEagleMedium,DMEM)jLOLj(SH30021.01B,Hyclone)i2.胎牛血清!(FetalBovineSerum,FBS)「10%(ES-009-B,Millipore)3.青霉素/鏈霉素(Penicillin/Streptomycin)"%(TMS-AB2C,CHEMICON)4.地塞米松(Dexamethasone,DM)1pmo/L分子量：392.46I(D4902-25MG,Sigma)5.胰島素|(Insulin,IS)110pmol/L分子量：5808?(91077C—1g,Sigma)6.3-異丁基-1-甲基黃嘌吟(Isobutylmethylxanthine,IBMX)0.5mmol/L分子量：222.24(I5879-100MG,Sigma)7.吲哚美辛i(Indomethacin,ID)1200pmol/Lii分子量：357.79(I7378—5G,Sigma)—試劑準(zhǔn)備、(一)成脂分化誘導(dǎo)液(AdipogenicMedium,AM)配方【1】：(二)—成脂分化誘導(dǎo)液濃儲(chǔ)迎坦!試劑名稱！質(zhì)量!濃縮倍數(shù)！!配制方法！\1.StockA胎牛血清1ml/管1X(liquid)!分裝1ml/管X100!保存：-20°C|2.StockB|青霉素/鏈霉素||0.1ml/管||100X(liquid)|［分裝0.1ml/ifX100!保存：-20C!3.StockC!地塞米松0.0117738g1000X溶于30ml無(wú)水乙醇(0.1%)!分裝0.1ml/ifX3001保存：-20C14.StockD胰島素0.05808g100X溶于10mlHcl(0.1mol/L,PH2.0)分裝0.1ml/ifX100j保存：4C5.StockE|3-異丁基-1-甲基黃嘌吟!0.05556g200X溶于2.5mlDMSO(0.5%)分裝0.05ml/EP管X50j保存：-20C\6.StockF吲哚美辛0.07155g500X溶于2ml無(wú)水乙醇(0.2%)分裝0.02ml/管X100［保存：二20C一…一-一…一-一一…_一…一-一…一-一…一_(三)成脂分化誘導(dǎo)液工作液配制(10ml)取DMEM(L)8.72ml加入15ml離心管(BD);加1管StockA(1ml)；加1管StockB(0.1ml)；取1管StockC(0.1ml)溶解，加入0.01ml；加1管StockE(0.05ml)；加1管StockF（0.02ml）；加1管StockD（0.1ml）；測(cè)滲透壓，調(diào)pH7.2-7.4;0.22pm微孔過(guò)濾，4°C貯存，一周內(nèi)使用。（四）StromalMedium配制（10ml）⑵：取DMEM8.9ml加入15ml離心管（BD）;加入1管StockA（1ml）；加入1管StockB（0.1ml）；調(diào)pH7.2-7.4;0.22pm微孔過(guò)濾，4C貯存，一周內(nèi)使用。（五）0.5%油紅“O”配制⑴油紅“O”0.5g溶于100ml無(wú)水乙醇（50%），分裝備用，使用前0.22um過(guò)濾（六）4%多聚甲醛液配制試劑名稱質(zhì)量/體積甲醛4gPBS100ml調(diào)PH7.2-7.4，0.22M微孔過(guò)濾后使用。二、方法（一）細(xì)胞誘導(dǎo)培養(yǎng)⑷間充質(zhì)干細(xì)胞傳代培養(yǎng)至第三代，待細(xì)胞融合至80%左右，從培養(yǎng)箱內(nèi)取出細(xì)胞至垂直超凈臺(tái)；X、Y軸方向搖動(dòng)培養(yǎng)皿，3次/方向；1ml微量移液器吸棄培養(yǎng)液；加入預(yù)溫PBS，1ml/孔;X、Y軸方向搖動(dòng)培養(yǎng)皿，3次/方向；吸棄PBS；重復(fù)步驟（4）—（6），漂洗細(xì)胞，2次；加入Trypsin/EDTA消化液，1ml/孑L，5min，37C；加入等量StromalMedium，終止消化；1ml微量移液器徹底吹洗皿底，收集細(xì)胞懸液至15m］離心管內(nèi)；1400rpm,RT,5min;小心取出離心管，吸棄上清；加入StromalMedium重懸消化下來(lái)的細(xì)胞；按1x104個(gè)/ml接種到24孔板內(nèi)（此時(shí)若解凍細(xì)胞，按凍存密度5*105個(gè)/ml計(jì)算，可鋪6孔板10個(gè)孔，12孔板25個(gè)孔，24孔板50個(gè)孔），加入StromalMedium培養(yǎng)基培養(yǎng)3天，設(shè)置對(duì)照組（一直使用StromalMedium培養(yǎng)），空白組（添加DMEM覆蓋皿底即可）；3天后，實(shí)驗(yàn)組吸棄原有培養(yǎng)基，換用成脂誘導(dǎo)培養(yǎng)基（AM）；每2-3天換液一次；誘導(dǎo)2周后，初始脂肪形成時(shí)用油紅“O”染色進(jìn)行評(píng)估。（二）油紅“O”染色：從培養(yǎng)箱內(nèi)取出細(xì)胞至普通實(shí)驗(yàn)臺(tái)；X、Y軸方向搖動(dòng)培養(yǎng)皿，3次/方向；1ml微量移液器吸棄培養(yǎng)液；加入預(yù)溫PBS,lml/孔，；X、Y軸方向搖動(dòng)培養(yǎng)皿，3次/方向；吸棄PBS；重復(fù)步驟（4）—（6），漂洗細(xì)胞，2次；加入4%多聚甲醛液（覆蓋所有細(xì)胞即可）固定1h，室溫（或4°C過(guò)夜），蒸餾水洗滌3次；用0.5%的油紅“O”染色1h（覆蓋所有細(xì)胞即可），室溫；放入70%的乙醇中分化至間質(zhì)清晰，然后再用蒸餾水洗滌3次；蘇木素染液復(fù)染（覆蓋所有細(xì)胞即可），1-2min，蒸餾水洗滌3次⑸；染色的細(xì)胞可以用肉眼在相差顯微鏡下進(jìn)行觀察確認(rèn)（為避免皿內(nèi)干燥影響觀察，可留少許液體，且觀察時(shí)間不宜超過(guò)15min或用甘油封蓋后可長(zhǎng)時(shí)間保存）。三、結(jié)果脂肪呈鮮紅色，細(xì)胞核呈藍(lán)色，間質(zhì)無(wú)色。小鼠脂肪組織來(lái)源的脂肪干細(xì)胞（經(jīng)成脂誘導(dǎo)2周后）脂肪細(xì)胞油紅O染色（X200）⑹⑴⑸ZukPA,ZhuM,MizunoH,HuangJ,FutrellJW,KatzAJ,BenhaimP,LorenzHP,HedrickMH.Multilineagecellsfromhumanadiposetissue:implicationsforCell-Basedtherapies,TissueEng.2001,7(2):211-228.【2】【4】YuG,WuX,KilroyG,HalvorsenYD,GimbleJM,FloydZE.Isolationofmurineadipose-derivedstemcells.MethodsMolBiol.2011;702:29-36.【3】田玉旺，李琳，李麗，胡海介紹一種改良的油紅O脂肪染色法，中國(guó)組織化學(xué)與細(xì)胞化學(xué)雜志，2007,16（6）.【6】LuF,GaoJH,Ogaw