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i試劑名稱ii濃度ii商品信息ij1.極限必須培養(yǎng)基j|(Dulbecco’SModifiedEagleMedium,DMEM)jLOLj(SH30021.01B,Hyclone)i2.胎牛血清!(FetalBovineSerum,FBS)「10%(ES-009-B,Millipore)3.青霉素/鏈霉素(Penicillin/Streptomycin)"%(TMS-AB2C,CHEMICON)4.地塞米松(Dexamethasone,DM)1pmo/L分子量:392.46I(D4902-25MG,Sigma)5.胰島素|(Insulin,IS)110pmol/L分子量:5808?(91077C—1g,Sigma)6.3-異丁基-1-甲基黃嘌吟(Isobutylmethylxanthine,IBMX)0.5mmol/L分子量:222.24(I5879-100MG,Sigma)7.吲哚美辛i(Indomethacin,ID)1200pmol/Lii分子量:357.79(I7378—5G,Sigma)—試劑準(zhǔn)備、(一)成脂分化誘導(dǎo)液(AdipogenicMedium,AM)配方【1】:(二)—成脂分化誘導(dǎo)液濃儲(chǔ)迎坦!試劑名稱!質(zhì)量!濃縮倍數(shù)!!配制方法!\1.StockA胎牛血清1ml/管1X(liquid)!分裝1ml/管X100!保存:-20°C|2.StockB|青霉素/鏈霉素||0.1ml/管||100X(liquid)|[分裝0.1ml/ifX100!保存:-20C!3.StockC!地塞米松0.0117738g1000X溶于30ml無(wú)水乙醇(0.1%)!分裝0.1ml/ifX3001保存:-20C14.StockD胰島素0.05808g100X溶于10mlHcl(0.1mol/L,PH2.0)分裝0.1ml/ifX100j保存:4C5.StockE|3-異丁基-1-甲基黃嘌吟!0.05556g200X溶于2.5mlDMSO(0.5%)分裝0.05ml/EP管X50j保存:-20C\6.StockF吲哚美辛0.07155g500X溶于2ml無(wú)水乙醇(0.2%)分裝0.02ml/管X100[保存:二20C一…一-一…一-一一…_一…一-一…一-一…一_(三)成脂分化誘導(dǎo)液工作液配制(10ml)取DMEM(L)8.72ml加入15ml離心管(BD);加1管StockA(1ml);加1管StockB(0.1ml);取1管StockC(0.1ml)溶解,加入0.01ml;加1管StockE(0.05ml);加1管StockF(0.02ml);加1管StockD(0.1ml);測(cè)滲透壓,調(diào)pH7.2-7.4;0.22pm微孔過(guò)濾,4°C貯存,一周內(nèi)使用。(四)StromalMedium配制(10ml)⑵:取DMEM8.9ml加入15ml離心管(BD);加入1管StockA(1ml);加入1管StockB(0.1ml);調(diào)pH7.2-7.4;0.22pm微孔過(guò)濾,4C貯存,一周內(nèi)使用。(五)0.5%油紅“O”配制⑴油紅“O”0.5g溶于100ml無(wú)水乙醇(50%),分裝備用,使用前0.22um過(guò)濾(六)4%多聚甲醛液配制試劑名稱質(zhì)量/體積甲醛4gPBS100ml調(diào)PH7.2-7.4,0.22M微孔過(guò)濾后使用。二、方法(一)細(xì)胞誘導(dǎo)培養(yǎng)⑷間充質(zhì)干細(xì)胞傳代培養(yǎng)至第三代,待細(xì)胞融合至80%左右,從培養(yǎng)箱內(nèi)取出細(xì)胞至垂直超凈臺(tái);X、Y軸方向搖動(dòng)培養(yǎng)皿,3次/方向;1ml微量移液器吸棄培養(yǎng)液;加入預(yù)溫PBS,1ml/孔;X、Y軸方向搖動(dòng)培養(yǎng)皿,3次/方向;吸棄PBS;重復(fù)步驟(4)—(6),漂洗細(xì)胞,2次;加入Trypsin/EDTA消化液,1ml/孑L,5min,37C;加入等量StromalMedium,終止消化;1ml微量移液器徹底吹洗皿底,收集細(xì)胞懸液至15m]離心管內(nèi);1400rpm,RT,5min;小心取出離心管,吸棄上清;加入StromalMedium重懸消化下來(lái)的細(xì)胞;按1x104個(gè)/ml接種到24孔板內(nèi)(此時(shí)若解凍細(xì)胞,按凍存密度5*105個(gè)/ml計(jì)算,可鋪6孔板10個(gè)孔,12孔板25個(gè)孔,24孔板50個(gè)孔),加入StromalMedium培養(yǎng)基培養(yǎng)3天,設(shè)置對(duì)照組(一直使用StromalMedium培養(yǎng)),空白組(添加DMEM覆蓋皿底即可);3天后,實(shí)驗(yàn)組吸棄原有培養(yǎng)基,換用成脂誘導(dǎo)培養(yǎng)基(AM);每2-3天換液一次;誘導(dǎo)2周后,初始脂肪形成時(shí)用油紅“O”染色進(jìn)行評(píng)估。(二)油紅“O”染色:從培養(yǎng)箱內(nèi)取出細(xì)胞至普通實(shí)驗(yàn)臺(tái);X、Y軸方向搖動(dòng)培養(yǎng)皿,3次/方向;1ml微量移液器吸棄培養(yǎng)液;加入預(yù)溫PBS,lml/孔,;X、Y軸方向搖動(dòng)培養(yǎng)皿,3次/方向;吸棄PBS;重復(fù)步驟(4)—(6),漂洗細(xì)胞,2次;加入4%多聚甲醛液(覆蓋所有細(xì)胞即可)固定1h,室溫(或4°C過(guò)夜),蒸餾水洗滌3次;用0.5%的油紅“O”染色1h(覆蓋所有細(xì)胞即可),室溫;放入70%的乙醇中分化至間質(zhì)清晰,然后再用蒸餾水洗滌3次;蘇木素染液復(fù)染(覆蓋所有細(xì)胞即可),1-2min,蒸餾水洗滌3次⑸;染色的細(xì)胞可以用肉眼在相差顯微鏡下進(jìn)行觀察確認(rèn)(為避免皿內(nèi)干燥影響觀察,可留少許液體,且觀察時(shí)間不宜超過(guò)15min或用甘油封蓋后可長(zhǎng)時(shí)間保存)。三、結(jié)果脂肪呈鮮紅色,細(xì)胞核呈藍(lán)色,間質(zhì)無(wú)色。小鼠脂肪組織來(lái)源的脂肪干細(xì)胞(經(jīng)成脂誘導(dǎo)2周后)脂肪細(xì)胞油紅O染色(X200)⑹⑴⑸ZukPA,ZhuM,MizunoH,HuangJ,FutrellJW,KatzAJ,BenhaimP,LorenzHP,HedrickMH.Multilineagecellsfromhumanadiposetissue:implicationsforCell-Basedtherapies,TissueEng.2001,7(2):211-228.【2】【4】YuG,WuX,KilroyG,HalvorsenYD,GimbleJM,FloydZE.Isolationofmurineadipose-derivedstemcells.MethodsMolBiol.2011;702:29-36.【3】田玉旺,李琳,李麗,胡海介紹一種改良的油紅O脂肪染色法,中國(guó)組織化學(xué)與細(xì)胞化學(xué)雜志,2007,16(6).【6】LuF,GaoJH,Ogaw
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