酶學(xué)與酶工程酶的固定化優(yōu)秀公開課件

第六章酶、細(xì)胞、原生質(zhì)體的固定化一、固定化酶（ImmobilizedEnzyme）1.定義：固定化酶是指將水溶性的酶用物理或化學(xué)的方法處理，使之成為不溶于水的，但是仍具有生物活性的酶。催化反應(yīng)后的酶可以回收重復(fù)使用。第一節(jié)酶的固定化固定化酶優(yōu)點(diǎn)：極易將固定化酶與底物、產(chǎn)物分開，簡化了提純工藝；可以在較長時間內(nèi)進(jìn)行反復(fù)分批反應(yīng)和連續(xù)反應(yīng)，酶的使用效率提高，成本降低；在大多數(shù)情況下，能夠提高酶的穩(wěn)定性；酶反應(yīng)過程能夠加以嚴(yán)格控制；較游離酶更適合于多酶反應(yīng)；可以增加產(chǎn)物的收率，提高產(chǎn)物的質(zhì)量。。必須注意維持酶的催化活性及專一性應(yīng)該有利于生產(chǎn)自動化、連續(xù)化應(yīng)有最小的空間位阻酶與載體必須結(jié)合牢固，從而使固定化酶能回收貯存，利于反復(fù)使用固定化酶應(yīng)有最大的穩(wěn)定性，所選載體不與廢物，產(chǎn)物或反應(yīng)液發(fā)生化學(xué)反應(yīng)固定化酶成本要低，以利于工業(yè)使用二、固定化酶的制備原則酶的固定化：采用各種方法，將酶與水不溶性的載體結(jié)合，制備固定化酶的過程稱為酶的固定化。固定化方法有很多，但對任何酶都適用的方法是沒有的，必須經(jīng)過試驗研究才能確定。酶固定化的方法主要有吸附法、包埋法、結(jié)合法、交聯(lián)法和熱處理法。三、固定化方法1.吸附法利用各種固體吸附劑將酶或含酶菌體吸附在其表面上，而使酶固定化的方法稱為物理吸附法，簡稱吸附法。物理吸附法常用的固體吸附劑有活性炭、氧化鋁、硅藻土、多孔陶瓷、多孔玻璃、硅膠、羥基磷灰石等。操作簡便，條件溫和，不會引起酶變性失活，載體廉價易得，而且可反復(fù)使用于靠物理吸附作用，結(jié)合力較弱，酶與載體結(jié)合不牢固而容易脫落，1）凝膠包埋法

凝膠包埋法是應(yīng)用最廣泛的固定化方法

主要用包埋載體：瓊脂凝膠，海藻酸鈣凝膠，角叉菜膠，明膠，聚丙烯酰胺凝膠2）微膠囊法微膠囊固定化酶通常為直徑幾微米到幾百微米的球狀體，比凝膠包埋顆粒要小得多，底物和產(chǎn)物擴(kuò)散阻力較小，但是反應(yīng)條件要求高，制備成本也高。界面沉淀法或稱相分離法利用某些聚合物在水相和有機(jī)相溶解度極低而形成薄膜將酶包埋。界面聚合法利用親水性單體和疏水性單體在界面發(fā)生聚合的原理包埋酶二級乳化法脂質(zhì)體包埋法由表面活性劑和卵磷脂等形成液膜包埋酶1）離子鍵結(jié)合法在適宜的pH和離子強(qiáng)度條件下，酶通過離子鍵結(jié)合于具有離子交換基的水不溶性載體的固定化方法，因而也稱離子交換吸附法。離子結(jié)合法的優(yōu)點(diǎn)是：操作簡單，處理條件溫和，酶的高級結(jié)構(gòu)和活性中心的氨基酸殘基不易被破壞，能得到酶活回收率高的固定化酶。缺點(diǎn)是：載體和酶的結(jié)合力比較弱，容易受緩沖液種類或pH的影響，在離子強(qiáng)度高的條件下進(jìn)行反應(yīng)時，酶往往會從載體上脫落。2)共價結(jié)合法共價結(jié)合法是指借助共價鍵將酶的活性非必需側(cè)鏈基團(tuán)和載體的功能基團(tuán)進(jìn)行偶聯(lián)的固定化方法。載體有：天然高分子衍生物，如纖維素、葡聚糖凝膠、瓊脂糖等；人工合成的高聚物，如聚丙烯酰膠、多聚氨基酸、乙烯與順丁烯二酸酐的共聚物、聚苯乙烯、尼龍等

酶和載體的偶聯(lián)反應(yīng)有多種，取決于載體上的功能基團(tuán)與酶分子上的非必需側(cè)鏈基團(tuán)。載體上的功能基團(tuán)和酶分子上的非必需側(cè)鏈基團(tuán)間不具有直接反應(yīng)的能力，所以要通過兩類方法來解決：一是將載體有關(guān)基團(tuán)活化，然后與酶有關(guān)基團(tuán)發(fā)生偶聯(lián)反應(yīng)；另一種是在載體上接上一個雙功能試劑，然后將酶偶聯(lián)上去。溴化氰法：對于帶羥基的載體如纖維素、葡聚糖和瓊脂糖等來說，這是最常用的反應(yīng)。芳香烴化反應(yīng)：含羥基的載體也可在堿性條件下和三氯均三嗪等反應(yīng)，在引入活潑的鹵素后能直接與酶的氨基、酚基或巰基等偶聯(lián)。疊氮反應(yīng)：適用于含羥基、羧甲基等的載體，如CM—纖維素、葡聚糖、聚氨基酸、乙烯－順丁烯二酸酐共聚物等。保護(hù)措施：應(yīng)選擇適宜的固定化方法與相應(yīng)的載體，例如，采用重氮法時要注意載體的親水性與疏水性，嚴(yán)格控制反應(yīng)條件，提高反應(yīng)的專一性，例如使反應(yīng)局限于α-氨基，保護(hù)ε-氨基，應(yīng)用可逆抑制劑或底物，封閉或牽制酶的活性中心與必需基團(tuán)，避免試劑影響酶的活性構(gòu)型和相應(yīng)基團(tuán)。4.交聯(lián)法交聯(lián)法是指利用雙功能或多功能試劑在酶分子間、酶分子與惰性蛋白間或酶分子與載體間進(jìn)行交聯(lián)反應(yīng)，以共價鍵制備固定化酶的方法。它與共價結(jié)合法的不同之處是它不使用載體。

交聯(lián)法的優(yōu)點(diǎn)是操作簡便，其缺陷則是交聯(lián)反應(yīng)的過程往往比較激烈，許多酶易在固定化過程中失效，酶回收率不高。

1)采用某些保護(hù)措施

2)盡可能降低交聯(lián)劑濃度和縮短反應(yīng)時間，有利于固定化酶比活力的提高。5.熱處理法6.各種固定化酶方法的優(yōu)缺點(diǎn)比較3．酶的最適溫度4．酶的最適pH5．酶的動力學(xué)特征6．酶的作用專一性1．酶的活力固定化酶(細(xì)胞)的活力即是固定化酶(細(xì)胞)催化某一特定化學(xué)反應(yīng)的能力，其大小可用在一定條件下它所催化的某一反應(yīng)的反應(yīng)初速度來表示。固定化酶(細(xì)胞)的單位可定義為：每毫克干重固定化酶(細(xì)胞)每分鐘轉(zhuǎn)化底物(或生產(chǎn)產(chǎn)物)的量，四、固定化酶的評價指標(biāo)測定方法分為間歇測定和連續(xù)測定兩種1)間歇測定

在攪拌或振蕩反應(yīng)器中，與溶液酶同樣測定條件下(如均勻懸浮于保溫的介質(zhì)中)進(jìn)行，然后間隔一定時間取樣，過濾后按常規(guī)酶活測定方法進(jìn)行測定。

2)連續(xù)測定

將固定化酶裝入具有恒溫水夾套的柱中，以不同流速流過底物，測定酶柱流出液。2．蛋白總量(1)雙辛可寧酸法(BCA法)

(2)考馬斯亮藍(lán)法3．偶聯(lián)率及相對活力偶聯(lián)率＝(加入蛋白活力一上清液蛋白活力)／加入蛋白活力X100％

活力回收＝固定化酶總活力／加入酶的總活力×100％

相對活力＝固定化酶總活力／(加入酶的總活力一上清液中未偶聯(lián)酶活力)X100％4．半衰期固定化酶(細(xì)胞)的半衰期是指在連續(xù)測定條件下，固定化酶(細(xì)胞)的活力下降為最初活力一半所經(jīng)歷的連續(xù)工作時間，以t1/2表示。將細(xì)胞限制或定位于特定空間位置的方法稱為細(xì)胞固定化技術(shù)。被限制或定位于特定空間位置的細(xì)胞稱為固定化細(xì)胞。第二節(jié)細(xì)胞、原生質(zhì)體固定化一、固定化細(xì)胞的特點(diǎn)具有固定化酶的特定，同時又具有自身的優(yōu)勢：固定化細(xì)胞保持了細(xì)胞的完整結(jié)構(gòu)和天然狀態(tài)，穩(wěn)定性好保持了細(xì)胞內(nèi)的酶系統(tǒng)、輔酶體系和代謝調(diào)控體系，可以按照原來的代謝途徑進(jìn)行新陳代謝，并進(jìn)行有效的代謝調(diào)節(jié)控制發(fā)酵穩(wěn)定性好，可以反復(fù)使用或者連續(xù)使用較長的一段時間固定化細(xì)胞密度提高，可以提高產(chǎn)率提高固定化工程菌的質(zhì)粒穩(wěn)定性缺點(diǎn)：必須保持菌體的完整，防止菌體的自溶，否則影響產(chǎn)物的純度必須抑制細(xì)胞內(nèi)蛋白酶對目的酶的分解胞內(nèi)多酶的存在，會形成副產(chǎn)物載體、細(xì)胞膜或細(xì)胞壁會造成底物擴(kuò)散的障礙等二、固定化細(xì)胞的分類分類方法類型細(xì)胞類型微生物、植物、動物生理狀態(tài)死細(xì)胞；完整細(xì)胞，細(xì)胞碎片，細(xì)胞器活細(xì)胞：增殖細(xì)胞，靜止細(xì)胞饑餓細(xì)胞三、細(xì)胞固定化方法1．包理法操作簡便包埋條件溫和形成的凝膠有一定的機(jī)械強(qiáng)度2.吸附法四、固定化細(xì)胞的性質(zhì)

一方面固定化對酶產(chǎn)生的某些影響同樣對細(xì)胞起作用由于細(xì)胞內(nèi)環(huán)境的相對恒定和細(xì)胞的“緩沖作用”，固定化對細(xì)胞胞內(nèi)酶產(chǎn)生的影響在某些方面不像對游離的自然酶那樣