生產(chǎn)菌種的制備與保藏優(yōu)秀公開課件

第六章發(fā)酵工業(yè)生產(chǎn)菌種的制備1本章內(nèi)容第三節(jié)菌種保藏與復(fù)壯第一節(jié)孢子制備過程與質(zhì)量控制第二節(jié)種子制備過程與質(zhì)量控制2發(fā)酵工程最重要的就是菌種，發(fā)酵水平的高低與菌種的性能、質(zhì)量、數(shù)量有直接關(guān)系。目前工業(yè)規(guī)模的發(fā)酵罐容積已達到幾百立方米甚至上千立方米，如按5~10%接種量計算，就要投入幾十立方米或幾百立方米的種子，種子液還要有一定的菌濃和其它質(zhì)量要求。要從保藏在試管中的微生物菌種逐級擴大為生產(chǎn)用種子是一個由實驗室制備到車間生產(chǎn)的過程。3發(fā)酵工業(yè)生產(chǎn)中菌種擴大培養(yǎng)的目的為發(fā)酵罐的投料提供足夠數(shù)量的代謝旺盛的純菌種。因為發(fā)酵時間的長短和接種量的大小有關(guān)，成熟菌體接種量大，發(fā)酵時間則短。足夠數(shù)量的成熟菌種接入到發(fā)酵罐，有利于縮短發(fā)酵周期，提高發(fā)酵罐的利用率，并且也有利于減少染菌的機會。從保存的休眠體，逐步培養(yǎng)，到最后一級菌種，其培養(yǎng)基和培養(yǎng)條件逐步接近發(fā)酵罐，馴化菌種適應(yīng)發(fā)酵環(huán)境，有利于快速的大量產(chǎn)生代謝產(chǎn)物。

5發(fā)酵工業(yè)生產(chǎn)工程中作為菌種必須滿足以下條件：菌種細胞的生長活力強，移種至發(fā)酵罐后能迅速生長，遲緩期短；生理形狀穩(wěn)定；菌體總量及濃度能滿足大容量發(fā)酵罐的要求；無雜菌污染；保持穩(wěn)定的生產(chǎn)能力。6沙土孢子凍干孢子斜面孢子搖瓶液體培養(yǎng)茄瓶斜面培養(yǎng)茄瓶固體培養(yǎng)種子罐培養(yǎng)發(fā)酵罐培養(yǎng)種子制備包括兩個過程生產(chǎn)孢子的制備過程：將砂土管或冷凍干燥管保藏的菌種接種至斜面培養(yǎng)基上，成熟后挑選正常的菌落再接茄瓶斜面或固體培養(yǎng)基培養(yǎng)制備大量孢子種子。生產(chǎn)種子的制備過程：制備的孢子移接到搖瓶或種子罐在液體培養(yǎng)基進行擴大培養(yǎng)，制備大量菌絲種子。

干接法濕接法7一、孢子的制備孢子制備是種子制備的開始，是發(fā)酵生產(chǎn)的一個重要環(huán)節(jié)。孢子的質(zhì)量、數(shù)量對以后菌絲的生長、繁殖和發(fā)酵產(chǎn)量都有明顯的影響。對于產(chǎn)孢子能力強、孢子發(fā)芽快、生長繁殖快的菌種可以將固體培養(yǎng)基培養(yǎng)的孢子可直接接入種子罐作為種子；對于產(chǎn)孢子能力不強或孢子發(fā)芽慢、生長緩慢的菌種，則需要把孢子接入搖瓶中使孢子發(fā)芽，搖瓶菌絲再接入種子罐作為種子。9第一節(jié)孢子制備過程與質(zhì)量控制1、放線菌孢子的制備放線菌的孢子培養(yǎng)一般采用瓊脂斜面培養(yǎng)基，培養(yǎng)基中含有一些適合產(chǎn)孢子的營養(yǎng)成分，如麩皮、豌豆浸汁、蛋白胨和一些無機鹽等；C、N源不要太豐富(碳源約為1%，氮源不超過0.5%)，干燥和限制營養(yǎng)可直接或間接誘導(dǎo)孢子形成。C源豐富易造成生長環(huán)境呈生理酸性，不利于孢子形成；N源豐富則有利于菌絲繁殖也不利于孢子形成。放線菌斜面的培養(yǎng)溫度大多數(shù)為28℃，少數(shù)為37℃或30℃，培養(yǎng)時間一般4~7天，也有長至14天的。孢子成熟后，在2~4℃保藏備用，一般存放時間7天，少數(shù)可以存放1~3個月。10第一節(jié)孢子制備過程與質(zhì)量控制放線菌發(fā)酵生產(chǎn)的工藝過程：母斜面孢子入罐有利于防止菌種變異和染菌；采用子斜面孢子接入液體培養(yǎng)基可節(jié)約菌種用量。土霉素生產(chǎn)用龜裂鏈霉菌：培養(yǎng)基：小麥麩皮5-7%，瓊脂2.0%，調(diào)pH6.8~7.0。培養(yǎng)條件：36.5℃的恒溫培養(yǎng)3天，再置30℃恒溫培養(yǎng)1天，培養(yǎng)相對濕度50%~55%。保存菌種母斜面(孢子)子斜面(孢子)搖瓶(菌絲)種子罐發(fā)酵罐孢子進罐菌絲進罐11斜面孢子培養(yǎng)基：甘油、葡萄糖、蛋白胨等；

培養(yǎng)條件：25℃、7天，濕度50%左右；

培養(yǎng)基特點：有利于長孢子，用量少而精細。大米孢子培養(yǎng)基：大米及氮源(玉米漿)；

培養(yǎng)條件：25℃、7天，控制濕度；

培養(yǎng)基特點：成本低、米粒之間結(jié)構(gòu)疏松，提高比表面積和氧的傳質(zhì)，營養(yǎng)適當(dāng)有利于孢子的生長。

大米孢子的要求：1粒米含1.4×106個孢子。制備好的大米(小米)孢子，可放在2~4℃保存?zhèn)溆茫蛘婵粘楦芍了趾吭?0%以下保存?zhèn)溆?，一般可連續(xù)使用達半年，對穩(wěn)定生產(chǎn)很有幫助。抽干法只能用于孢子保存，而不能用于菌絲。13米孢子制備工藝流程浸泡時間及加營養(yǎng)液量應(yīng)掌握在滅菌后米粒熟透但不粘不散；分裝量應(yīng)掌握在平鋪后有2-3粒米的厚度；米粒不要碰到瓶塞；培養(yǎng)前期應(yīng)經(jīng)常搖動米粒，使微生物在米粒表面生長均勻，氣生菌絲及孢子長成后不再搖動。

保存：冰箱保存；真空干燥保存；10%-20%甘油浸泡保存14對于不產(chǎn)孢子霉菌

赤霉素生產(chǎn)菌（Gibberellinefujikuroi），也可用大米固體培養(yǎng)基在茄子瓶中培養(yǎng)菌絲體，用作種子罐種子。15谷氨酸棒桿菌AS1.299(不產(chǎn)芽孢)

培養(yǎng)基：蛋白胨1%，牛肉膏1%，氯化鈉0.5，瓊脂2%，pH7.0-7.2培養(yǎng)條件：32℃，生長18-24小時培養(yǎng)基特點：有利于菌體的生長，原料比較精細生長斜面要求：生長良好，所使用斜面連續(xù)傳代不超過3次。保存菌種試管斜面培養(yǎng)小搖瓶培養(yǎng)(搖床)大搖瓶培養(yǎng)(搖床)17孢子制備和下面要講的搖瓶菌絲制備不用種子罐，工廠這些培養(yǎng)過程一般都在菌種室完成，所用的設(shè)備為超凈工作臺、培養(yǎng)箱、搖床或小型發(fā)酵罐等實驗室常見設(shè)備，因此將這些培養(yǎng)過程稱為菌種室階段的種子制備。18實驗室階段目的：對于不產(chǎn)孢子和芽孢的微生物：獲得一定數(shù)量和質(zhì)量的菌體，如谷氨酸的種子培養(yǎng)。對于產(chǎn)孢子微生物：獲得一定數(shù)量和質(zhì)量的孢子。對于產(chǎn)孢子數(shù)量少、生長、發(fā)芽緩慢的微生物：獲得一定數(shù)量和質(zhì)量的菌絲體。培養(yǎng)基選擇的原則培養(yǎng)基的選擇應(yīng)該是有利于菌體的生長，對孢子培養(yǎng)基應(yīng)該是有利于孢子的生長。在原料方面，菌種室種子培養(yǎng)階段，規(guī)模一般比較小，因此為了保證培養(yǎng)基的質(zhì)量，培養(yǎng)基的原料一般都比較精細。19二、影響孢子質(zhì)量的因素及其控制種子質(zhì)量的優(yōu)劣，主要取決于菌種本身的遺傳特性和培養(yǎng)條件兩個方面。影響孢子質(zhì)量的因素包括培養(yǎng)基培養(yǎng)條件培養(yǎng)時間和冷藏時間接種量發(fā)酵工藝學(xué)p94，抗生素工藝學(xué)p19，2621(一)培養(yǎng)基蛋白胨、瓊脂、水質(zhì)、氨基酸生產(chǎn)過程中經(jīng)常出現(xiàn)種子質(zhì)量不穩(wěn)定的現(xiàn)象，其主要原因是原材料質(zhì)量波動。構(gòu)成孢子培養(yǎng)基的原材料，其產(chǎn)地、品種、加工方法和用量對孢子質(zhì)量都有一定的影響。例如四環(huán)素、土霉素生產(chǎn)中，配制產(chǎn)孢子斜面培養(yǎng)基用的麩皮，以及霉菌用的大（?。┟?，因小麥、大（?。┟桩a(chǎn)地、品種、加工方法及用量的不同對孢子質(zhì)量的影響也不同。蛋白胨加工方法、原料不同、如魚胨或骨胨對孢子影響也不同。22原材料中無機離子、微量元素如Mg2+、Cu2+、Ba2+能刺激孢子的形成。磷含量太多或太少也會影響孢子的質(zhì)量。瓊脂的牌號不同，對孢子質(zhì)量也有影響，這是由于不同牌號的瓊脂含有不同的無機離子造成的。水質(zhì)的影響，地區(qū)不同、季節(jié)變化和水源污染，均可造成水質(zhì)波動，影響種子質(zhì)量。菌種在固體培養(yǎng)基上可呈現(xiàn)多種不同代謝類型的菌落，氮源品種越多，出現(xiàn)的菌落類型也越多，不利于生產(chǎn)的穩(wěn)定。23（二）培養(yǎng)條件：溫度和濕度1、溫度的影響溫度對多數(shù)品種斜面孢子質(zhì)量有顯著的影響。要獲得高質(zhì)量的孢子，最適溫度區(qū)間很狹窄，一般各生產(chǎn)單位都嚴(yán)格控制孢子和斜面的培養(yǎng)溫度。如土霉素生產(chǎn)菌種龜裂鏈霉菌在高于37?C培養(yǎng)時，孢子接入發(fā)酵罐后出現(xiàn)糖代謝變慢，氨基氮回升提前，菌絲過早自溶，效價降低等現(xiàn)象。因此，龜菌斜面先在36.5℃培養(yǎng)3天，再在28.5℃培養(yǎng)1天，所得的孢子數(shù)量比在36.5℃培養(yǎng)4天所得的孢子數(shù)量增加3～7倍。對菌種生產(chǎn)能力的影響：菌體的糖代謝和氮代謝的各種酶類，對溫度的敏感性是不同的。因此，培養(yǎng)溫度不同，菌的生理狀態(tài)也不同，如果不是用最適溫度培養(yǎng)的孢子，其生產(chǎn)能力就會下降。252、濕度制備斜面孢子時，培養(yǎng)空間的濕度對孢子的形成速度、數(shù)量和質(zhì)量有較大的影響。龜裂鏈霉菌孢子制備時發(fā)現(xiàn)：北方氣候干燥地區(qū)孢子斜面長得較快，在含有少量水分的試管斜面培養(yǎng)基下部孢子長得較好，而斜面上部由于水分迅速蒸發(fā)呈干疤狀，孢子稀少。表中看出相對濕度在40~45%時孢子數(shù)量最多，且孢子顏色均勻，質(zhì)量較好。相對濕度(%)斜面外觀活孢子計數(shù)（億/支）16.5~1925~3640~45上部稀薄、下部稠略黃上部薄、中部均勻發(fā)白一片白，孢子豐富，稍皺1.22.35.7262、孢子的冷藏時間斜面冷藏對孢子質(zhì)量的影響與孢子成熟程度有關(guān)。如土霉素生產(chǎn)菌種孢子斜面培養(yǎng)4天左右即于4?C冰箱保存，發(fā)現(xiàn)冷藏7~8天菌體細胞開始自溶。而培養(yǎng)5天以后冷藏，20天未發(fā)現(xiàn)自溶。冷藏時間對孢子的生產(chǎn)能力也有影響。鏈霉素生產(chǎn)中，斜面孢子在6?C冷藏兩個月后的發(fā)酵單位比冷藏一個月降低18%，冷藏3個月后降低35%。冷藏時間因菌種不同而異，總的原則是冷藏時間宜短不宜長。29（四）接種量斜面接種量：接種量的大小影響到在一定量培養(yǎng)基中孢子的個體數(shù)量的多少，進而影響到菌體的生理狀況，接種量過大或過小均對孢子質(zhì)量產(chǎn)生影響。凡接種后菌落均勻分布整個斜面，隱約可分菌落者為正常接種。接入種子罐的孢子接種量對發(fā)酵生產(chǎn)也有影響。青霉素球狀菌進罐孢子數(shù)量過少，進罐后長出的球狀體過大，影響通氣效果；孢子數(shù)量過多，進罐后發(fā)酵時不能

很好地維持球狀體一般傳代用的斜面孢子要求菌落分布較稀，適于挑選單個菌落進行傳代培養(yǎng)。30三、孢子質(zhì)量的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)和檢查1、斜面孢子/米孢子質(zhì)量檢查(1)

外觀檢查；(2)

無菌檢查；(3)搖瓶生產(chǎn)能力檢查。2、質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)(1)無雜菌污染；(2)孢子數(shù)足夠，發(fā)芽率高；(3)生產(chǎn)能力高；(4)真空干燥后含水量小于8%。31第二節(jié)

種子制備過程與質(zhì)量控制32一、種子制備過程廣義的種子制備包括孢子制備和菌絲制備，狹義的種子制備單指：將固體培養(yǎng)基上培養(yǎng)出的孢子或菌體轉(zhuǎn)入液體培養(yǎng)基中培養(yǎng)，使其繁殖成大量菌絲或菌體的過程。種子制備所使用的培養(yǎng)基和其他工藝條件，都要有利于孢子發(fā)芽和菌絲繁殖。種子罐培養(yǎng)一方面獲得足夠數(shù)量的菌種，另一方面種子罐中的培養(yǎng)基更接近發(fā)酵培養(yǎng)液成分和培養(yǎng)條件，如通無菌空氣，攪拌形式等，以使菌體適應(yīng)發(fā)酵環(huán)境，起馴化作用。331、搖瓶種子制備某些產(chǎn)孢子能力不強或孢子發(fā)芽和菌絲繁殖速度緩慢的菌種，需將菌絲或孢子經(jīng)搖瓶培養(yǎng)成菌絲后再進入種子罐，這就是搖瓶種子。搖瓶培養(yǎng)基配方和培養(yǎng)條件與種子罐相似。種子培養(yǎng)基要求比較豐富和完全，易被菌體分解利用，氮源豐富有利于菌絲生長。原則上各種營養(yǎng)成分不宜過濃，子瓶培養(yǎng)基濃度比母瓶略高，更接近于種子罐的培養(yǎng)基配方。子瓶培養(yǎng)母瓶培養(yǎng)孢子菌絲種子罐如：灰色鏈霉菌生產(chǎn)鏈霉素

卡那鏈霉菌生產(chǎn)卡那霉素342、種子罐種子制備種子罐種子制備是指菌種室制備的孢子或液體種子移種至種子罐擴大培養(yǎng)。種子培養(yǎng)在種子罐里面進行，在工廠歸發(fā)酵車間管理，因此稱這些培養(yǎng)過程為生產(chǎn)車間階段。(1)種子罐的作用：使有限數(shù)量的孢子(菌體)發(fā)芽、生長、并繁殖成大量的菌(絲)體，滿足發(fā)酵罐內(nèi)菌體生長和產(chǎn)物合成的需要。(2)種子進入種子罐方式：孢子進罐法搖瓶菌絲進罐法35孢子進罐法：是將固體培養(yǎng)基培養(yǎng)的孢子制成孢子懸浮液直接接入種子罐的方法。

優(yōu)點：①可減少批與批之間的差異，穩(wěn)定生產(chǎn)；

②工藝過程簡單，一次可以制備大量的孢子，便于控制孢子質(zhì)量。也易于保存；

③操作簡便、不易污染雜菌。搖瓶菌絲進罐：定義你們自己做。優(yōu)點：對于生長、發(fā)芽緩慢的菌種，可以縮短種子在種子罐內(nèi)的培養(yǎng)時間，缺點：①現(xiàn)制現(xiàn)用，菌絲不易保存；②批與批之間差異，易造成生產(chǎn)波動；

③孢子制備工藝拖長，增加染菌機會。菌種入罐方法母斜面孢子入罐子斜面孢子入罐母瓶菌絲入罐子瓶菌絲入罐獲得好的發(fā)酵結(jié)果36(3)種子罐級數(shù)的確定種子罐制備種子需逐級擴大培養(yǎng)的次數(shù)稱作種子罐級數(shù)。一級種子：把孢子瓶中的孢子或搖瓶菌絲接入到種子罐中，孢子發(fā)芽并繁殖成的大量菌體(絲)。二級種子：是指把一級種子接入到體積更大的種子罐中，經(jīng)培養(yǎng)后形成更多的菌體(絲)。一級發(fā)酵：采用直接將孢子或菌絲體接入罐中發(fā)酵，稱為一級發(fā)酵。通常在進行小型罐（5~500L）實驗時。二級發(fā)酵：一級種子轉(zhuǎn)入發(fā)酵罐內(nèi)的發(fā)酵稱為二級發(fā)酵。依此類推：發(fā)酵級數(shù)

=種子罐的級數(shù)

+1。37種子罐的級數(shù)確定主要決定于種子的傳代穩(wěn)定性；孢子發(fā)芽及菌絲繁殖速度；孢子瓶中孢子的密度；發(fā)酵罐的容積和接種量的要求。細菌：生長快，種子用量比例少，級數(shù)也較少，二級發(fā)酵即可；霉菌：生長較慢，如青霉菌，采用三級發(fā)酵；放線菌：生長更慢，采用四級發(fā)酵；酵母：比細菌慢，比霉菌、放線菌快，通常用二級發(fā)酵。38谷氨酸生產(chǎn)中，采用茄瓶斜面或搖瓶種子接入種子罐于32℃培養(yǎng)7~10h，菌體濃度達108~109個/mL，即可接入發(fā)酵罐作為種子。青霉素生產(chǎn)菌種，生長較慢，其孢子液接入一級種子罐擴培于27℃培養(yǎng)40h，孢子發(fā)芽，長出短菌絲，再移至含有新鮮培養(yǎng)基的二級種子罐，于27℃培養(yǎng)10~24h，菌絲迅速繁殖，獲粗壯菌體，即可移至發(fā)酵罐作為種子。產(chǎn)鏈霉素的灰色鏈霉菌、產(chǎn)卡那霉素的卡那鏈霉菌，產(chǎn)孢子能力弱、孢子發(fā)芽慢，先將孢子接入含液體培養(yǎng)基的搖瓶中，于搖床上培養(yǎng)，獲得菌絲體，作為種子罐種子。39確定種子罐級數(shù)需注意的問題種子級數(shù)越少越好，可簡化工藝和控制，減少變異和染菌機會；但種子級數(shù)太少，接種量小，發(fā)酵時間延長，降低發(fā)酵罐的生產(chǎn)率，增加染菌機會；雖然種子罐級數(shù)隨產(chǎn)物的品種及生產(chǎn)規(guī)模而定。但也與所選用工藝條件有關(guān)。如改變種子罐的培養(yǎng)條件，加速了孢子發(fā)芽及菌體的繁殖，也可相應(yīng)地減少種子罐的級數(shù)。40種子的質(zhì)量是發(fā)酵能否正常進行的重要因素之一。1、種子質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)及判斷種子質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)因產(chǎn)品、菌種及工藝條件不同而有所不同。生產(chǎn)上常用的種子質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)：(1)細胞或菌體：看顏色、聞氣味；顯微鏡下觀察菌體形態(tài)；測定菌體濃度和粘度等。單細胞：菌體健壯、菌形一致、均勻整齊，有的還要求有一定的排列或形態(tài)；霉菌、放線菌：菌絲粗壯、對某些染料著色力強、生長旺盛、菌絲分枝情況和內(nèi)含物情況良好。菌體生長階段（種齡）：處于對數(shù)生長期后期，菌體量未達到高峰。離心沉淀法、光密度法、細胞記數(shù)法41分批發(fā)酵條件下，黃色短桿菌TK0303的菌體形態(tài)變化

5L罐延遲期（4h）

5L罐對數(shù)期（32h）

5L罐穩(wěn)定期（48h）5L罐衰亡期（68h）

搖瓶衰亡期（72h）

42產(chǎn)黃青霉在青霉素發(fā)酵時，菌絲體的生長分6個時期，Ⅰ期：分生孢子發(fā)芽。孢子先膨脹再形成小的芽管，此時原生質(zhì)未分化，具有小空孢。Ⅱ期：菌絲繁殖，原生質(zhì)嗜堿性很強，在Ⅱ期末有類脂肪小顆粒。Ⅲ期：形成脂肪粒，積累貯藏物。原生質(zhì)嗜堿性仍很強。Ⅳ期脂肪粒減少，形成中、小空孢子。原生質(zhì)嗜堿性弱。Ⅴ期形成大空孢子其中含有一個或數(shù)個染色的大顆粒。脂肪粒消失。Ⅵ期：細胞內(nèi)看不到顆粒，并出現(xiàn)個別自溶的細胞。

其中I~Ⅳ期初稱菌絲生長期。產(chǎn)生青霉素較少，而菌絲濃度增加很多。Ⅲ期適于作發(fā)酵用種子。Ⅳ~Ⅴ期稱青霉素分泌期，此時菌絲生長趨勢漸減弱。大量產(chǎn)生青霉素。Ⅵ期即菌絲自溶期，菌體開始自溶。43放線菌菌絲團霉菌菌絲442、生化指標(biāo)：種子液的糖、氮、磷的含量和pH變化。3、產(chǎn)物生成量：在抗生素發(fā)酵中，產(chǎn)物生成量是考察種子質(zhì)量的重要指標(biāo)，因為種子液中產(chǎn)物生成量的多少間接反映種子的生產(chǎn)能力和成熟程度。4、特異性酶活力：種子液中某種酶的活力，與目的產(chǎn)物的產(chǎn)量有一定的關(guān)聯(lián)，如土霉素即可通過測定種子液中淀粉酶活力判斷種子好壞。5、無雜菌污染。45二、影響種子質(zhì)量的因素及控制種子質(zhì)量的優(yōu)劣，主要取決于菌種本身的遺傳特性和培養(yǎng)條件兩個方面。孢子質(zhì)量、培養(yǎng)基、培養(yǎng)條件、種齡接種量461、培養(yǎng)基：選擇有利于孢子發(fā)芽和菌體生長的營養(yǎng)成分，使菌絲粗壯并具有較強的活力；要易于被菌體直接吸收和利用，如葡萄糖、玉米漿、磷酸鹽等；營養(yǎng)成分要比發(fā)酵培養(yǎng)基適當(dāng)豐富和完全，氮源和維生素含量要高；組分要盡可能與發(fā)酵培養(yǎng)基相近，這樣種子移入發(fā)酵罐后能比較容易適應(yīng)發(fā)酵罐的培養(yǎng)條件(馴化)。種子培養(yǎng)基的pH要比較穩(wěn)定，以適合菌的生長和繁殖。47谷氨酸發(fā)酵培養(yǎng)基成分表用途成分（%）規(guī)模保藏牛肉膏1，蛋白胨1，瓊脂粉1.8，無機鹽斜面添加0.1的口服葡萄糖，其余同上一級口服葡萄糖3，玉米漿2.4，尿素0.65，K2HPO40.11200ml/5000ml二級玉米淀粉雙酶糖2.5，玉米漿2.0，甘蔗糖蜜1.0，尿素0.35，無機鹽等1.2/2m3三級玉米淀粉雙酶糖4.0，玉米漿1.5，甘蔗糖蜜1.0液氨，復(fù)合維生素0.1mg/L，無機鹽等12/20m3發(fā)酵玉米淀粉雙酶糖13-14，玉米漿0.06-0.08，甘蔗糖蜜1.0，液氨，維生素50g，無機鹽等154/240m3482、培養(yǎng)條件種子培養(yǎng)應(yīng)選擇最適溫度，該溫度與發(fā)酵最適溫度可能不一致。

通氣攪拌的控制很重要：不同時期的需氧量不同；通氣攪拌不足可引起菌絲結(jié)團、菌絲粘壁等異?，F(xiàn)象；在種子罐中培養(yǎng)的種子除保證供給易被利用的培養(yǎng)基外，有足夠的通氣量可以提高種子質(zhì)量。青霉素生產(chǎn)菌種在制備過程中將通氣充足和不足兩種情況下得到的種子分別接入發(fā)酵罐內(nèi)，它們的發(fā)酵單位可相差1倍。土霉素生產(chǎn)菌，一級種子罐的通氣量小對發(fā)酵有利。泡沫影響正常的通氣攪拌，應(yīng)控制培養(yǎng)基的滅菌質(zhì)量，甚至考慮改變培養(yǎng)基配方，以減少發(fā)泡。493、種齡種齡：種子培養(yǎng)時間稱為種齡。菌體的生理活性因不同的生長階段而差別很大，種齡的控制就顯得非常重要。最適的種齡的選擇：在工業(yè)發(fā)酵生產(chǎn)中，一般都選在生命力極為旺盛的對數(shù)生長期，菌體量尚未達到最高峰時的培養(yǎng)時間較為合適。對數(shù)生長期的種子生長繁殖快，縮短在發(fā)酵罐中的延滯期縮短非產(chǎn)物合成時間，提高發(fā)酵罐利用率很快適應(yīng)發(fā)酵環(huán)境50前期生長緩慢，發(fā)酵周期延長種齡過于年輕造成異常發(fā)酵產(chǎn)生泡沫多菌體量過少，而菌絲結(jié)團產(chǎn)物形成時間推遲種齡過長菌種趨于老化，菌體自溶早生產(chǎn)能力下降51不同菌種或同一菌種工藝條件不同，種齡有很大差異，一般需經(jīng)過多種實驗來確定。細菌的種齡一般為7~24h，霉菌種齡一般為16~50h，放線菌種齡一般為21~64h。種齡對嗜堿性芽孢桿菌產(chǎn)生堿性蛋白酶產(chǎn)酶的影響酶活力(U/mL)52534、接種量菌種特性(繁殖速度)決定接種量的大小的因素種子質(zhì)量發(fā)酵條件不同的微生物其發(fā)酵的接種量是不同的，通常：細菌1~5%，如肌苷酸發(fā)酵為1.5~2%；酵母菌5~10%；霉菌一般為10%；多數(shù)抗生素發(fā)酵接種量為7~15%，有時可加大到20~25%。

移入種子液的體積接種量＝——————————×100%接種后培養(yǎng)液的總體積54接種量過大或者過小，均會影響發(fā)酵。嗜堿性芽孢桿菌生產(chǎn)堿性蛋白酶接種量對產(chǎn)酶的影響1%接種量產(chǎn)酶活最高，在0.5~4%之間雖有差別，但影響不大；如超過4%則酶產(chǎn)量明顯下降。55種子液中含有大量水解酶，有利于對發(fā)酵培養(yǎng)基的利用提高生產(chǎn)效益縮短發(fā)酵罐中菌體繁殖達峰的時間產(chǎn)物合成提前到來種子進入發(fā)酵罐后容易適應(yīng)較大接種量縮短發(fā)酵周期減少染菌機會產(chǎn)物合成受影響菌體生長過快，營養(yǎng)基質(zhì)缺乏接種量過大培養(yǎng)液黏度增加，引起溶氧不足過多移入代謝廢物56發(fā)酵異常菌絲量少還可能產(chǎn)生菌絲團發(fā)酵前期菌體生長緩慢，使發(fā)酵周期延長接種量過小但是，對于某些品種，較小的接種量也可以獲得較好的生產(chǎn)效果。如生產(chǎn)制霉菌素，發(fā)酵的接種量為1%時效果好于10%，0.1%的接種生產(chǎn)效果和1%相似；57近年來，生產(chǎn)上多以大接種量和豐富培養(yǎng)基作為高產(chǎn)措施，是發(fā)酵生產(chǎn)的發(fā)展趨勢。

以上三方法運用得當(dāng)，可提高發(fā)酵產(chǎn)量，卡那霉素生產(chǎn)中采用雙種比單種的發(fā)酵單位提高8%，且達到產(chǎn)量高峰的時間提前。鏈霉素：倒種法比單種法的發(fā)酵單位提高12%。但染菌機會和變異機會增多。雙種法：2個種子罐的種子接入1個發(fā)酵罐加大接種量的方法混種進罐法：以種子液和發(fā)酵液混合作為發(fā)酵罐的種子。倒種法：以適宜的發(fā)酵液倒出部分給另一發(fā)酵罐作為種子。58三、種子異常的分析種子異常往往表現(xiàn)為

(1)孢子質(zhì)量菌種生長代謝緩慢原因種子罐的培養(yǎng)條件空氣的進罐溫度較低培養(yǎng)基原材料質(zhì)量差菌種生長代謝緩慢菌絲結(jié)團三個方面菌絲粘壁應(yīng)對：培養(yǎng)基滅菌后需取樣測定C、N、P、pH值，以判斷培養(yǎng)基的滅菌質(zhì)量。培養(yǎng)基滅菌溫度太高，營養(yǎng)成分破壞多接種量太小前一級種子質(zhì)量太差泡沫多通氣差59(2)菌絲結(jié)團菌絲團：在液體培養(yǎng)條件下，繁殖的菌絲并不分散舒展而聚成團狀稱為菌絲團。一個菌絲團可以由一個孢子生長發(fā)育而來，也可由多個菌絲體聚集一起逐漸形成。在種子液中可看見白色的小顆粒。影響菌體的呼吸影響菌體對營養(yǎng)物質(zhì)的吸收菌絲團的影響攪拌效果差接種量小菌絲團產(chǎn)生的原因較多時移入發(fā)酵罐影響正常發(fā)酵放線菌分散舒展的菌絲形態(tài)60(3)菌絲粘壁菌絲粘壁：發(fā)酵過程中，菌絲粘附在罐壁上的現(xiàn)象。菌絲濃度減少形成菌絲團菌絲粘壁的后果攪拌效果差種子罐裝料系數(shù)小菌絲粘壁的原因泡沫過多61四.種子質(zhì)量的控制措施種子質(zhì)量的最終指標(biāo)是考察其在發(fā)酵罐中表現(xiàn)出來的生產(chǎn)能力。因此：

必須保證生產(chǎn)菌種的穩(wěn)定性；保證無雜菌侵入。1.菌種穩(wěn)定性的檢查方法：取少量菌種→無菌生理鹽水→梯度稀釋(以長出單菌落不至過密為宜)→平板劃線培養(yǎng)。挑出形態(tài)整齊，孢子豐滿的菌落進行搖瓶試驗，測定其生產(chǎn)能力。以不低于其原有的生產(chǎn)活力為原則，并取生產(chǎn)能力高的菌種備用。622.無菌檢查：顯微鏡觀察、肉湯或瓊脂斜面接入種子液進行無菌檢驗。種子液平板劃線、斜面培養(yǎng)用肉眼觀察是否有異常菌落、異?，F(xiàn)象及鏡檢是否有雜菌。3.生化分析：營養(yǎng)成分消耗速度、pH變化、溶解氧利用情況、色澤、氣味等。63五、發(fā)酵生產(chǎn)中種子罐的無菌接種生產(chǎn)規(guī)模種子罐的接種，包括兩個方面：從種子室搖瓶菌絲或孢子懸浮液容器中移種入一個種子罐；從一個種子罐移入另一個生產(chǎn)種子罐或發(fā)酵罐中。是通過滅菌接種管道，在壓差作用下進行的。64搖瓶菌絲或孢子懸浮液接種種子罐火焰封口法：在種子罐接種口周圍點燃酒精火焰圈，使接種口被圍在一圈火焰之中，在火焰圈中即可將菌懸液倒入種子罐中?；鹧娣饪诜▔翰罘?/p>

65壓差法

針頭法膠管法666768作業(yè)：1.什么是菌種退化？菌種退化表象？引起菌種退化原因？防止菌種退化措施？2.什么是菌種復(fù)壯？菌種復(fù)壯的方法？3.菌種保藏的意義、目的、原理、注意事項？4.各種菌種保藏方法的技術(shù)要點？69一、菌種保藏菌種是從事微生物學(xué)以及生命科學(xué)研究的基本材料。特別是利用微生物進行有關(guān)生產(chǎn)(如抗生素、氨基酸、釀造)更離不開菌種，因此菌種是國家的重要資源，菌種保藏是進行微生物學(xué)研究和微生物育種工作的重要組成部分。2、菌種保藏目的第三節(jié)

生產(chǎn)菌種的保藏與復(fù)壯①保持優(yōu)良生產(chǎn)性能的穩(wěn)定②不污染雜菌③不死亡703、菌種保藏的原理：菌種保藏主要是根據(jù)菌種的生理、生化特性，人工創(chuàng)造條件，如低溫、干燥、隔絕空氣或氧氣、缺乏營養(yǎng)物質(zhì)等，使孢子或菌體的生長代謝活動盡量降低，使菌種處于“休眠”狀態(tài)(孢子、芽孢等)

，抑制其繁殖能力，以減少其變異，達到長期保存的目的。好的保藏方法，應(yīng)能保持菌種優(yōu)良特性和較高存活率，同時也應(yīng)考慮到方法本身的經(jīng)濟、簡便。714、幾種常用菌種保藏方法方法名稱主要措施適宜菌種保藏期評價斜面低溫保藏法低溫4℃各大類1~3月簡便液體石蠟封存法低溫4℃、缺氧各大類1~2年簡便固體曲保藏法低溫或室溫，干燥霉菌放線菌1~3年簡便沙土管保藏法低溫4℃、干燥、無營養(yǎng)產(chǎn)孢子菌1~10年簡便有效冷凍干燥保藏法干燥、無氧、低溫-20℃、有保護劑各大類5~15年簡便有效液氮超低溫保藏法無氧、超低溫-150℃、有保護劑各大類永久保存簡便有效725、菌種保藏的注意事項（1）菌種在保藏前所處的狀態(tài)菌種斜面的培養(yǎng)時間和培養(yǎng)溫度影響其保藏質(zhì)量。培養(yǎng)時間過短，保存時容易死亡，培養(yǎng)時間長，生產(chǎn)性能衰退。一般以稍低于生長最適溫度培養(yǎng)至孢子成熟的菌種進行保存，效果較好。73（2）菌種保藏所用的基質(zhì)培養(yǎng)基，碳源比例應(yīng)少些，營養(yǎng)成分貧乏些較好，否則易產(chǎn)生酸，或使代謝活動增強，影響保藏時間。砂土管保藏需將砂和土充分洗凈，以防其中含有過多的有機物，影響菌的代謝或經(jīng)滅菌后產(chǎn)生一些有毒的物質(zhì)。冷凍干燥所用的保護劑，有不少經(jīng)過加熱就會分解或變性的物質(zhì)，如還原糖和脫脂乳，過度加熱往往形成有毒物質(zhì)，滅菌時應(yīng)特別注意。74（3）操作過程對細胞結(jié)構(gòu)的損害冷凍干燥時，凍結(jié)速度緩慢易導(dǎo)致細胞內(nèi)形成較大的冰晶，對細胞結(jié)構(gòu)造成機械損傷。真空干燥程度也將影響細胞結(jié)構(gòu)，加入保護劑就是為了盡量減輕冷凍干燥所引起的對細胞結(jié)構(gòu)的破壞。75二、菌種的復(fù)壯菌種衰退：菌種經(jīng)過長期人工培養(yǎng)或保藏，由于自發(fā)突變的作用而引起某些優(yōu)良特性變?nèi)趸蛳У默F(xiàn)象稱為菌種衰退。1、常見的衰退現(xiàn)象：菌落和細胞形態(tài)的改變；生長速度緩慢，產(chǎn)孢子越來越少；抵抗力、抗不良環(huán)境能力減弱等。代謝產(chǎn)物生產(chǎn)能力或其對宿主寄生能力下降；762、衰退的原因：(1)基因突變；菌種退化的主要原因是有關(guān)基因的負突變。如果控制產(chǎn)量的基因發(fā)生負突變則會引起產(chǎn)量下降，如果控制孢子生成的基因發(fā)生負突變則孢子性能就會下降。當(dāng)然，這些負突變都是自發(fā)形成的。經(jīng)常處于旺盛生長狀態(tài)的細胞比休眼狀態(tài)細胞發(fā)生突變的機率大得多。很多抗生素生物合成、產(chǎn)生氣生菌絲和色素等性狀都部分或全部受質(zhì)?；蚩刂?。當(dāng)菌株連續(xù)傳代、菌體發(fā)生質(zhì)粒脫落而出現(xiàn)大量光禿型菌落，則生產(chǎn)能力也顯著下降。77(2)變異菌株性狀分離；誘變的單菌落是由一個以上孢子或細胞形成；誘變育種時，所得到的優(yōu)良菌株的單菌落是由一個以上孢子或細胞形成。菌落由一個孢子或單個細胞形成，但它是多核細胞；單核孢子發(fā)生突變時，雙鏈DNA上僅一條鏈上某個位點發(fā)生變化；78(3)連續(xù)傳代連續(xù)傳代也是菌種退化的直接原因。個別細胞性狀改變不足以引起菌種退化，經(jīng)多次傳代，退化細胞在數(shù)量上占優(yōu)勢，于是退化性狀表現(xiàn)逐步明朗化，最終成為一株退化菌株。產(chǎn)腺苷的黃嘌呤缺陷型菌株在接種傳代過程中產(chǎn)量和回復(fù)子數(shù)量間的關(guān)系79產(chǎn)腺苷的黃嘌呤缺陷型菌株在接種傳代過程中

產(chǎn)量和回復(fù)子數(shù)量間的關(guān)系實驗移接代數(shù)每代斜面保存時間（天）回復(fù)子比數(shù)×106腺苷產(chǎn)量g/L1234560267912147133,