第7章蛋白質(zhì)分離純化

蛋白質(zhì)的分離純化與表征蛋白質(zhì)的酸堿性質(zhì)蛋白質(zhì)分子的大小與形狀蛋白質(zhì)膠體與沉淀蛋白質(zhì)分離純化的一般原則蛋白質(zhì)分離純化的方法蛋白質(zhì)含量測(cè)定與純度鑒定第七章蛋白質(zhì)的分離純化與表征現(xiàn)在是1頁(yè)\一共有65頁(yè)\編輯于星期四蛋白質(zhì)的酸堿性質(zhì)蛋白質(zhì)中可解離的基團(tuán)蛋白質(zhì)的等電點(diǎn)1－蛋白質(zhì)的酸堿性質(zhì)現(xiàn)在是2頁(yè)\一共有65頁(yè)\編輯于星期四蛋白質(zhì)中可解離的基團(tuán)-NH3+pKa=7.6~8.4-COO-pKa=3~3.2NextPage1－蛋白質(zhì)的酸堿性質(zhì)現(xiàn)在是3頁(yè)\一共有65頁(yè)\編輯于星期四蛋白質(zhì)中可解離的基團(tuán)-COO-pKa=3.0~4.7-COO-pKa=4.41－蛋白質(zhì)的酸堿性質(zhì)現(xiàn)在是4頁(yè)\一共有65頁(yè)\編輯于星期四蛋白質(zhì)中可解離的基團(tuán)pKa=5.6~7.0-NH2pKa=9.4~10.61－蛋白質(zhì)的酸堿性質(zhì)現(xiàn)在是5頁(yè)\一共有65頁(yè)\編輯于星期四蛋白質(zhì)中可解離的基團(tuán)pKa=11.6~12.6pKa=9.8~10.4pKa=9.1~10.81－蛋白質(zhì)的酸堿性質(zhì)現(xiàn)在是6頁(yè)\一共有65頁(yè)\編輯于星期四蛋白質(zhì)的等電點(diǎn)蛋白質(zhì)等電點(diǎn)蛋白質(zhì)等電點(diǎn)胃蛋白酶1.0-胰凝乳蛋白酶8.3卵清蛋白4.6-胰凝乳蛋白酶原9.1血清清蛋白4.7核糖核酸酶9.5-乳球蛋白5.2細(xì)胞色素C10.7胰島素5.3溶菌酶11.0血紅蛋白6.71－蛋白質(zhì)的酸堿性質(zhì)現(xiàn)在是7頁(yè)\一共有65頁(yè)\編輯于星期四蛋白質(zhì)分子的大小與形狀根據(jù)化學(xué)組成測(cè)相對(duì)分子量滲透壓法測(cè)相對(duì)分子量擴(kuò)散系數(shù)法測(cè)相對(duì)分子量沉降分析法測(cè)相對(duì)分子量凝膠過(guò)濾法測(cè)相對(duì)分子量SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳法測(cè)相對(duì)分子量2－蛋白質(zhì)的分子形狀與大小現(xiàn)在是8頁(yè)\一共有65頁(yè)\編輯于星期四根據(jù)化學(xué)組成測(cè)相對(duì)分子量肌紅蛋白（Mb）M.W.=(Fe原子量)/(Mb中Fe含量)*100=55.8/0.335*100=16700血紅蛋白（Hb）一分子中含有4個(gè)Fe原子，因此：MW=4*16700=668002－蛋白質(zhì)的分子形狀與大小現(xiàn)在是9頁(yè)\一共有65頁(yè)\編輯于星期四滲透壓法測(cè)相對(duì)分子量=RT(+K*c2)cMrc=RTMr+K*cc~cMr=RTlimc0cMr=10000~1000002－蛋白質(zhì)的分子形狀與大小現(xiàn)在是10頁(yè)\一共有65頁(yè)\編輯于星期四擴(kuò)散系數(shù)法測(cè)相對(duì)分子量Fick第一擴(kuò)散定律：擴(kuò)散系數(shù)D求法（Fick第二擴(kuò)散定律）dmdt=-D*A*dcdxdcdt=-Dd2cdx2c2c1=exp(-)x22-x124Dt2－蛋白質(zhì)的分子形狀與大小現(xiàn)在是11頁(yè)\一共有65頁(yè)\編輯于星期四擴(kuò)散系數(shù)法測(cè)相對(duì)分子量擴(kuò)散系數(shù)D隨蛋白質(zhì)Mr的增加而降低。蛋白質(zhì)Mr擴(kuò)散系數(shù)（107cm2s-1)核糖核酸酶A1260011.9細(xì)胞色素c1337011.4肌紅蛋白1690011.3凝乳蛋白酶原232409.5血紅蛋白645006.9過(guò)氧化氫酶2475004.1肌球蛋白5248001.12－蛋白質(zhì)的分子形狀與大小現(xiàn)在是12頁(yè)\一共有65頁(yè)\編輯于星期四沉降分析法測(cè)相對(duì)分子量蛋白質(zhì)分子在溶液中受到強(qiáng)大的離心力作用時(shí)，如果蛋白質(zhì)的密度大于溶液的密度，蛋白質(zhì)分子就會(huì)沉降。沉降速率與蛋白質(zhì)分子的大小和密度有關(guān)，而且與分子形狀、溶液的密度和粘度有關(guān)。2－蛋白質(zhì)的分子形狀與大小現(xiàn)在是13頁(yè)\一共有65頁(yè)\編輯于星期四沉降分析法測(cè)相對(duì)分子量斯維得貝格方程：Mr=RTsD(1-)s為沉降系數(shù):單位秒-1，通常將10-13秒作為一個(gè)單位用S表示為偏微比容：蛋白質(zhì)溶于水為0.74cm3/g為溶劑的密度2－蛋白質(zhì)的分子形狀與大小現(xiàn)在是14頁(yè)\一共有65頁(yè)\編輯于星期四2－蛋白質(zhì)的分子形狀與大小現(xiàn)在是15頁(yè)\一共有65頁(yè)\編輯于星期四凝膠過(guò)濾法測(cè)相對(duì)分子量洗脫液體積（mL）蛋白質(zhì)含量相對(duì)分子量MrABCD待測(cè)蛋白分子量2－蛋白質(zhì)的分子形狀與大小現(xiàn)在是16頁(yè)\一共有65頁(yè)\編輯于星期四SDS-聚丙烯酰胺

凝膠電泳法測(cè)相對(duì)分子量電泳時(shí)的遷移率取決于蛋白的凈電荷、分子大小、形狀；SDS（十二烷基硫酸鈉）與蛋白質(zhì)結(jié)合，使全部呈負(fù)電荷，同時(shí)改變蛋白質(zhì)單體分子構(gòu)象成近似球形；巰基乙醇打開(kāi)二硫鍵，使亞基分離；電泳時(shí)蛋白質(zhì)向正極移動(dòng)。分連續(xù)和不連續(xù)體系（圓盤(pán)電泳）2－蛋白質(zhì)的分子形狀與大小現(xiàn)在是17頁(yè)\一共有65頁(yè)\編輯于星期四SDS-聚丙烯酰胺

凝膠電泳法測(cè)相對(duì)分子量2－蛋白質(zhì)的分子形狀與大小現(xiàn)在是18頁(yè)\一共有65頁(yè)\編輯于星期四SDS-聚丙烯酰胺

凝膠電泳法測(cè)相對(duì)分子量ABRf=A/B2－蛋白質(zhì)的分子形狀與大小現(xiàn)在是19頁(yè)\一共有65頁(yè)\編輯于星期四蛋白質(zhì)膠體性質(zhì)膠體穩(wěn)定性的三個(gè)要素：質(zhì)點(diǎn)大小1~100nm；帶相同電荷；形成溶劑化層；穩(wěn)定親水性蛋白質(zhì)膠體的因素：水化層：雙電層：3－蛋白質(zhì)的膠體性質(zhì)現(xiàn)在是20頁(yè)\一共有65頁(yè)\編輯于星期四蛋白質(zhì)的沉淀鹽析法：NaCl、(NH4)2SO4有機(jī)溶劑沉淀：乙醇、丙酮重金屬鹽沉淀：Hg2+、Ag+生物堿與某些酸類沉淀：?jiǎn)螌幩帷CA加熱變性沉淀：3－蛋白質(zhì)的膠體性質(zhì)現(xiàn)在是21頁(yè)\一共有65頁(yè)\編輯于星期四蛋白質(zhì)分離純化的一般原則總目標(biāo)：增加蛋白質(zhì)含量與生物活性，除去不必要的雜質(zhì)蛋白；前處理：細(xì)胞破碎粗分級(jí)分離：鹽析、等電點(diǎn)沉淀、有機(jī)溶劑沉淀等細(xì)分級(jí)分離：層析、電泳、結(jié)晶4－蛋白質(zhì)的分離純化現(xiàn)在是22頁(yè)\一共有65頁(yè)\編輯于星期四蛋白質(zhì)的分離純化方法根據(jù)下列性質(zhì)將蛋白分離純化： 分子大小 溶解度 電荷 吸附性質(zhì) 對(duì)配體分子的親和力4－蛋白質(zhì)的分離純化現(xiàn)在是23頁(yè)\一共有65頁(yè)\編輯于星期四透析與超過(guò)濾4－蛋白質(zhì)的分離純化現(xiàn)在是24頁(yè)\一共有65頁(yè)\編輯于星期四透析通常是將濃縮液裝在一個(gè)用賽咯吩（cellophane）制造的透析袋內(nèi)，兩端都密封好，然后將透析袋懸浮在一個(gè)裝有很多緩沖液的容器內(nèi)進(jìn)行透析。因?yàn)橘惪┓阅な前胪ㄍ傅哪?，蛋白質(zhì)等大分子不能透過(guò)膜，仍然留在袋內(nèi)，但蛋白質(zhì)周圍的小分子可以與緩沖液進(jìn)行交換，通過(guò)多次更換透析液，就可除去小分子（如硫酸銨）。經(jīng)硫酸銨分級(jí)純化、透析的粗分級(jí)的蛋白質(zhì)樣品可以通過(guò)以下一些常用的分離純化技術(shù)和方法進(jìn)一步純化和鑒定。4－蛋白質(zhì)的分離純化現(xiàn)在是25頁(yè)\一共有65頁(yè)\編輯于星期四現(xiàn)在是26頁(yè)\一共有65頁(yè)\編輯于星期四超濾超濾是一種膜分離技術(shù)，它的特點(diǎn)是使用不對(duì)稱多孔膜，根據(jù)分子的大小來(lái)分離溶液中的大分子物質(zhì)與小分子物質(zhì)。超濾尤其適用于大分子溶液的濃縮，不同種類分子的純化以及溶劑交換等。超濾法是一種溫和的、非變性的物理分離方法。4－蛋白質(zhì)的分離純化現(xiàn)在是27頁(yè)\一共有65頁(yè)\編輯于星期四超濾離心管切向流超濾器4－蛋白質(zhì)的分離純化現(xiàn)在是28頁(yè)\一共有65頁(yè)\編輯于星期四離心技術(shù)離心技術(shù)主要用于各種生物樣品的分離和制備，生物樣品懸浮液在高速旋轉(zhuǎn)下，由于巨大的離心力作用，使懸浮的微小顆粒（細(xì)胞器、生物大分子的沉淀等）以一定的速度沉降，從而與溶液得以分離，而沉降速度取決于顆粒的質(zhì)量、大小和密度。密度梯度離心技術(shù)是利用每種蛋白質(zhì)顆粒沉降到與自身密度相等的密度梯度時(shí)即停止不前，最后各種蛋白質(zhì)在離心管中被分離成各自的區(qū)帶。常用的密度梯度有蔗糖梯度，聚蔗糖梯度等。4－蛋白質(zhì)的分離純化現(xiàn)在是29頁(yè)\一共有65頁(yè)\編輯于星期四差

速

離

心Differentialcentrifugationasafirststepinproteinpurification4－蛋白質(zhì)的分離純化現(xiàn)在是30頁(yè)\一共有65頁(yè)\編輯于星期四密度梯度（區(qū)帶）離心4－蛋白質(zhì)的分離純化現(xiàn)在是31頁(yè)\一共有65頁(yè)\編輯于星期四密度梯度（區(qū)帶）離心4－蛋白質(zhì)的分離純化現(xiàn)在是32頁(yè)\一共有65頁(yè)\編輯于星期四凝膠過(guò)濾

凝膠過(guò)濾層析是依據(jù)分子大小這一物理性質(zhì)進(jìn)行分離純化的。凝膠層析的固定相是惰性的珠狀凝膠顆粒，凝膠顆粒的內(nèi)部具有立體網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)，形成很多孔穴。當(dāng)含有不同分子大小的組分的樣品進(jìn)入凝膠層析柱后，各個(gè)組分就向固定相的孔穴內(nèi)擴(kuò)散，組分的擴(kuò)散程度取決于孔穴的大小和組分分子大小。分子越大的組分越先流出，分子越小的組分越后流出。這樣樣品經(jīng)過(guò)凝膠層析后，各個(gè)組分便按分子從大到小的順序依次流出，從而達(dá)到了分離的目的。4－蛋白質(zhì)的分離純化現(xiàn)在是33頁(yè)\一共有65頁(yè)\編輯于星期四凝膠過(guò)濾（分子排阻層析）基于分子大小4－蛋白質(zhì)的分離純化現(xiàn)在是34頁(yè)\一共有65頁(yè)\編輯于星期四利用溶解度差別的純化等電點(diǎn)沉淀（等電點(diǎn)時(shí)靜電荷為零，相鄰蛋白質(zhì)分子間沒(méi)有靜電斥力而趨于聚集沉淀）鹽析與鹽溶（中性鹽可以增加蛋白質(zhì)的溶解度，稱為鹽溶；鹽析作用主要是大量中性鹽爭(zhēng)奪蛋白質(zhì)疏水表面水分子）有機(jī)溶劑分級(jí)分離（有機(jī)溶劑降低蛋白質(zhì)表面可解離基團(tuán)的離子化程度，促進(jìn)蛋白質(zhì)的聚集和沉淀）4－蛋白質(zhì)的分離純化現(xiàn)在是35頁(yè)\一共有65頁(yè)\編輯于星期四利用溶解度差別的純化分級(jí)沉淀（鹽或有機(jī)溶劑）4－蛋白質(zhì)的分離純化現(xiàn)在是36頁(yè)\一共有65頁(yè)\編輯于星期四利用電荷差別的純化聚丙烯酰胺凝膠電泳等電聚焦離子交換層析層析聚焦4－蛋白質(zhì)的分離純化現(xiàn)在是37頁(yè)\一共有65頁(yè)\編輯于星期四聚丙烯酰胺凝膠電泳（PAGE）平板電泳4－蛋白質(zhì)的分離純化現(xiàn)在是38頁(yè)\一共有65頁(yè)\編輯于星期四聚丙烯酰胺凝膠電泳（PAGE）管狀電泳圖譜平板PAGE圖譜4－蛋白質(zhì)的分離純化現(xiàn)在是39頁(yè)\一共有65頁(yè)\編輯于星期四等電聚焦電泳蛋白質(zhì)是帶有電荷的兩性生物大分子，其正負(fù)電荷的數(shù)量隨所處環(huán)境酸堿度的變化而變化。在電場(chǎng)存在下的一定pH溶液中，帶正電的蛋白分子將向負(fù)極移動(dòng)而帶負(fù)電的蛋白分子將向正極移動(dòng)，在某一pH時(shí)，蛋白分子在電場(chǎng)中不再移動(dòng)，此時(shí)的pH值即為該蛋白質(zhì)的等電點(diǎn)。等電聚焦(IEF）電泳就是在凝膠中加入兩性電解質(zhì)從而構(gòu)成從正極到負(fù)極pH逐漸增加的pH梯度，處在其中的蛋白分子在電場(chǎng)的作用下運(yùn)動(dòng)，最后各自停留在其等電點(diǎn)的位置上，測(cè)出蛋白分子聚焦位置的pH值，便可以得到它的等電點(diǎn)。4－蛋白質(zhì)的分離純化現(xiàn)在是40頁(yè)\一共有65頁(yè)\編輯于星期四等電聚焦電泳蛋白質(zhì)在具有pH梯度的介質(zhì)中電泳4－蛋白質(zhì)的分離純化現(xiàn)在是41頁(yè)\一共有65頁(yè)\編輯于星期四等電聚焦電泳4－蛋白質(zhì)的分離純化現(xiàn)在是42頁(yè)\一共有65頁(yè)\編輯于星期四二維電泳1975年，O’Farrell首先運(yùn)用雙向電泳技術(shù)將大腸桿菌總蛋白分離出1100多個(gè)蛋白點(diǎn)。后來(lái)此技術(shù)一直用于原核生物和真核生物總蛋白的分離。目前，隨著蛋白組工程的發(fā)展，雙向電泳技術(shù)越來(lái)越廣泛的用于發(fā)現(xiàn)未知蛋白。二維電泳由第一向等電聚焦(IEF)電泳和第二向SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS)組成，第一向使等電點(diǎn)不同的蛋白得到分離，第二向使分子量不同的蛋白得到分離，兩向結(jié)合便得到高分辨率的蛋白圖譜。4－蛋白質(zhì)的分離純化現(xiàn)在是43頁(yè)\一共有65頁(yè)\編輯于星期四二維電泳IsoelectricfocusingisoftencombinedwithSDStogeneratetwodimensionalgels.4－蛋白質(zhì)的分離純化現(xiàn)在是44頁(yè)\一共有65頁(yè)\編輯于星期四二維電泳的應(yīng)用示例4－蛋白質(zhì)的分離純化現(xiàn)在是45頁(yè)\一共有65頁(yè)\編輯于星期四離子交換層析陽(yáng)離子交換劑：CM-纖維素：-O-CH2COOHP-纖維素：磷酸基陰離子交換劑：DEAE-纖維素：二乙基氨基乙基AE-纖維素：氨基乙基4－蛋白質(zhì)的分離純化現(xiàn)在是46頁(yè)\一共有65頁(yè)\編輯于星期四離子交換層析4－蛋白質(zhì)的分離純化現(xiàn)在是47頁(yè)\一共有65頁(yè)\編輯于星期四4－蛋白質(zhì)的分離純化現(xiàn)在是48頁(yè)\一共有65頁(yè)\編輯于星期四親和層析原理：依賴于蛋白質(zhì)和它的配體（ligand）之間的相互作用來(lái)分離。配體通常指的是能與另一個(gè)分子或原子結(jié)合（一般是非共價(jià)結(jié)合）的分子、基團(tuán)、離子或原子。但在親和層析中，配體是通過(guò)共價(jià)鍵先與基質(zhì)結(jié)合。配體可以是酶結(jié)合的一個(gè)反應(yīng)物或產(chǎn)物，或是一種可以識(shí)別靶蛋白的抗體，也可以是受體、核酸、細(xì)胞器等。親和層析是分離效率最高的分離方法。4－蛋白質(zhì)的分離純化現(xiàn)在是49頁(yè)\一共有65頁(yè)\編輯于星期四親和層析過(guò)程示意圖（1）4－蛋白質(zhì)的分離純化現(xiàn)在是50頁(yè)\一共有65頁(yè)\編輯于星期四親和層析過(guò)程示意圖（2）4－蛋白質(zhì)的分離純化現(xiàn)在是51頁(yè)\一共有65頁(yè)\編輯于星期四親和層析過(guò)程示意圖（3）4－蛋白質(zhì)的分離純化現(xiàn)在是52頁(yè)\一共有65頁(yè)\編輯于星期四親和層析過(guò)程示意圖（4）4－蛋白質(zhì)的分離純化現(xiàn)在是53頁(yè)\一共有65頁(yè)\編輯于星期四4－蛋白質(zhì)的分離純化現(xiàn)在是54頁(yè)\一共有65頁(yè)\編輯于星期四高效液相層析（HPLC）高效液相色譜（HPLC：HighPerformanceLiquidChromatography）與普通的色譜技術(shù)不同的是：填料密度高，洗脫液壓力加大，分離效果更好。是化學(xué)、生物化學(xué)與分子生物學(xué)、醫(yī)藥學(xué)、農(nóng)業(yè)、環(huán)保、商檢、藥檢、法檢等學(xué)科領(lǐng)域與專業(yè)最為重要的分離分析技術(shù)，是分析化學(xué)家、生物化學(xué)家等用以解決他們面臨的各種實(shí)際分離分析課題必不可缺少的工具。國(guó)際市場(chǎng)調(diào)查表明，高效液相色譜儀在分析儀器銷售市場(chǎng)中占有最大的份額，增長(zhǎng)速度最快。4－蛋白質(zhì)的分離純化現(xiàn)在是55頁(yè)\一共有65頁(yè)\編輯于星期四高效液相層析（HPLC）高效液相色譜的優(yōu)點(diǎn)是：檢測(cè)的分辨率和靈敏度高，分析速度快，重復(fù)性好，定量精度高，應(yīng)用范圍廣。適用于分析高沸點(diǎn)、大分子、強(qiáng)極性、熱穩(wěn)定性差的化合物。其缺點(diǎn)是：價(jià)格昂貴，要用各種填料柱，容量小，分析生物大分子和無(wú)機(jī)離子困難，流動(dòng)相消耗大且有毒性的居多。目前的發(fā)展趨勢(shì)是向生物化學(xué)和藥物分析及制備型傾斜。4－蛋白質(zhì)的分離純化現(xiàn)在是56頁(yè)\一共有65頁(yè)\編輯于星期四4－蛋白質(zhì)的分離純化現(xiàn)在是57頁(yè)\一共有65頁(yè)\編輯于星期四高效液相層析（HPLC）HighPressureLiquidChromatographyHighpressurelimitsdiffusionandincreasesinteractionswithchromatographymediaHPLCgivesveryhighresolutionofproteincomponents4－蛋白質(zhì)的分離純化現(xiàn)在是58頁(yè)\一共有65頁(yè)\編輯于星期四蛋白質(zhì)純化過(guò)程實(shí)例4－蛋白質(zhì)的分離純化現(xiàn)在是59頁(yè)\一共有65頁(yè)\編輯于星期四蛋白質(zhì)的含量測(cè)定凱氏定氮法雙縮脲法Folin-酚法（Lowry法，蛋白質(zhì)在堿性溶液中與銅形成復(fù)合物，此復(fù)合物及芳香族氨基酸還原磷鉬酸－磷鎢酸試劑產(chǎn)生藍(lán)色。）紫外吸收法Bradford法（考馬斯亮藍(lán)染料結(jié)合法）BCA法（bisinchoninicacidmethod）5－蛋白質(zhì)的含量測(cè)定現(xiàn)在是60頁(yè)\一共有65頁(yè)\編輯于星期四蛋白質(zhì)的純度鑒定電泳（等電聚焦、SDS、PAGE）沉降法HPLC溶解度分析N－末端分析6－蛋白質(zhì)的純度鑒定