糖的分析優(yōu)秀課件

糖的分析生命科學(xué)與生物醫(yī)學(xué)工程4/7/20231一、糖的概念（一）糖類的存在與來源糖是自然界分布很廣的一類化合物，幾乎所有的動(dòng)物、植物和微生物體內(nèi)都含有糖類。地球上糖類物質(zhì)的根本來源是綠色細(xì)胞進(jìn)行的光合作用。4/7/20232糖類的主要生物學(xué)作用1．可作為生物體的結(jié)構(gòu)物質(zhì)，如纖維素。2．可轉(zhuǎn)變?yōu)樯匦璧钠渌镔|(zhì)，如脂類、蛋白質(zhì)等。3．是生物體主要的能量來源。4．可作為細(xì)胞識(shí)別的信息分子。4/7/20233（三）糖結(jié)構(gòu)的測(cè)定寡糖與多糖的結(jié)構(gòu)復(fù)雜：三個(gè)相同的氨基酸只能形成一種形式的三肽，而三個(gè)相同的己糖卻能構(gòu)成176種異構(gòu)體！測(cè)量的結(jié)構(gòu)包括：分子量糖鏈中糖殘基的種類和數(shù)量糖殘基結(jié)合的位置-連接點(diǎn)構(gòu)型4/7/20235測(cè)定方法早期測(cè)定方法：顯色分析法滴定分析法基于比重的分析法現(xiàn)代分析法：自動(dòng)化液相色譜法流動(dòng)注射分析離子色譜毛細(xì)管電泳分離分析法核磁共振質(zhì)譜分析法……4/7/202366.1糖的結(jié)構(gòu)單糖：寡糖：多糖是構(gòu)成各種糖分子的基本單位，按其分子中所含碳原子的數(shù)目，又分為丙、丁、戊、己和庚糖。由2～6個(gè)單糖縮合而成，二糖最為重要，如麥芽糖、蔗糖。由多個(gè)單糖分子縮合失水而成的高分子聚合物，分子量很大，如淀粉和纖維素等。結(jié)晶、溶于水、具有甜味不溶于水，無甜味4/7/20237D-2-脫氧核糖b-D-2-脫氧核糖a-D-2-脫氧核糖a-D-(+)-葡萄糖a-D-(+)-甲基葡萄糖苷五碳糖（核糖）糖苷鍵4/7/20239淀粉直鏈淀粉

分子量約1萬-200萬，250-260個(gè)葡萄糖分子，以（14）糖苷鍵聚合而成。呈螺旋結(jié)構(gòu)，遇碘顯紫藍(lán)色。支鏈淀粉中除了（14）糖苷鍵構(gòu)成糖鏈以外，在支點(diǎn)處存在（16）糖苷鍵，分子量較高。遇碘顯紫紅色。4/7/2023106.2糖的化學(xué)分析法一羰基的反應(yīng)是糖許多定性和定量分析方法的基礎(chǔ)還原法：糖類化合物的醛基和酮基在溶液中以游離和烯醇兩種形式存在，烯醇式糖類是具有一定活性的還原劑。最常見的還原反應(yīng)是將Cu2+還原為Cu+，在堿性溶液中形成黃色CuOH，在加熱的情況下繼續(xù)轉(zhuǎn)化為不溶性Cu2O。4/7/202311醛糖和酮糖與芳香胺的反應(yīng)醛糖和酮糖在冰乙酸中與不同的芳香胺發(fā)生縮合反應(yīng)生成有色物質(zhì)。常用的芳香胺有鄰茴香胺、對(duì)氨基水楊酸、對(duì)氨基苯甲酸、二苯胺和對(duì)氨基苯酚等。芳香胺類化合物對(duì)于某一種或者某一類的糖的反應(yīng)具有選擇性。但是芳香胺類化合物具有致癌性不適合于實(shí)驗(yàn)室使用。羰基的反應(yīng)4/7/202313與強(qiáng)酸和酚的反應(yīng)：戊糖和己糖與強(qiáng)酸和酚一起加熱，反應(yīng)時(shí)會(huì)分別產(chǎn)生呋喃或羥甲基呋喃衍生物，醛基然后與酚縮合產(chǎn)生有顏色的化合物4/7/202314糖糠醛或糠醛衍生物紫色濃HCL或H2SO4脫水α-萘酚4/7/2023156.2.2多糖的結(jié)構(gòu)分析化學(xué)分析法：寡聚多糖與碘的反應(yīng)可以作為一些多糖定性分析的基礎(chǔ)碘與淀粉藍(lán)色碘與糖原和糊精紅色碘與纖維素?zé)o色4/7/202317過氧化反應(yīng)糖類被強(qiáng)氧化劑如高碘酸氧化時(shí)，碳鏈會(huì)發(fā)生斷裂pH5.0條件下加入高碘酸鈉于4℃進(jìn)行24小時(shí)，然后加入乙二醇破壞過量的高碘酸。通過所消耗的高碘酸的量可以推測(cè)多糖分子中所存在的相鄰羥基的數(shù)目。反應(yīng)中所消耗的高碘酸可以通過滴定或光譜法測(cè)定。4/7/202318質(zhì)譜分析法：關(guān)鍵問題是離子化：快原子轟擊（FAB)、電噴霧離子化（ESI)和基體協(xié)助激光解吸離子化（MALDI)軟電離技術(shù)都適用于糖類分析。飛行時(shí)間質(zhì)譜（TOF-MS)和傅立葉變換質(zhì)譜（FT-MS)測(cè)大分子糖的分子量要比光散射法或凝膠滲透法精度高得多，特別是LC/MS和MS/MS分析法更有用。4/7/202319步驟酶降解糖復(fù)合物，切割寡糖鏈；HPLC分離純化質(zhì)譜分析得出結(jié)論后，用其他方法核證，如GC/MS,MS/MS和NMR等4/7/2023216.3糖的酶法分析當(dāng)化學(xué)分析法達(dá)不到分析特異性的要求，采用酶分析法通?？梢栽诟鞣N異構(gòu)體的混合物中實(shí)現(xiàn)對(duì)某一種的選擇性測(cè)定，并能區(qū)分α和β構(gòu)型常用的酶：β-半乳糖苷酶、α-葡萄糖苷酶、α-半乳糖苷酶等4/7/2023226.3.1基于葡萄糖氧化酶的葡萄糖分析β-D-葡萄糖+O2+H2OD-葡糖酸+H2O2α-D-葡萄糖被氧化的反應(yīng)速率低于β-D-葡萄糖的1%α-D-葡萄糖與β-D-葡萄糖兩種異構(gòu)體以平衡的形式存在，在變旋酶的作用下α向β不斷轉(zhuǎn)化，最終使得反應(yīng)進(jìn)行完全。4/7/2023236.3.2

基于葡萄糖脫氫酶或己糖激酶的葡萄糖分析法葡萄糖脫氫酶β-D-葡萄糖+NAD+/NADP+葡萄糖酸內(nèi)酯+NADH/NADPH利用動(dòng)力學(xué)法或固定時(shí)間法測(cè)定產(chǎn)物NADH在340nm處的吸收分析時(shí)要用變旋酶加速α型向β型D-葡萄糖的變化葡萄糖脫氫酶4/7/202325己糖激酶葡萄糖+ATP己糖激酶葡萄糖-6-磷酸+ADP葡萄糖-6-磷酸+NADP+G-6-P脫氫酶6-磷酸葡萄糖酸+NADPH++H+己糖激酶對(duì)于普通帖并不具有專一性，但是第二個(gè)反應(yīng)對(duì)葡萄糖-6-磷酸具有很高的專一性。4/7/2023266.4.1紙色譜及薄層色譜糖的樣本一般溶于異丙醇中，質(zhì)量濃度大約為2g/L，點(diǎn)樣量一般為10μl定義葡萄糖的Rf值為100分離之后一般要經(jīng)過顯色反應(yīng)以確定糖的位置，使用不同的顯色劑有助于未知斑點(diǎn)的鑒定顯色是采用噴霧或浸入，在100℃下加熱5～10分鐘4/7/2023296.4.2氣相色譜法當(dāng)要鑒定或定量一種或多種糖類化合物，特別是量比較小時(shí)，用氣相或液相色譜法可以分離結(jié)構(gòu)十分相近的糖類化合物糖類需衍化為揮發(fā)性衍生物后方可用氣相色譜法，常見的衍生物類型有o-三甲基硅（TMS)。4/7/202330

1·阿拉伯糖arabinose;2.半乳糖galactose;3.葡萄糖glucose;4.甘露糖mannose羊肚菌多糖的氣相色譜圖

可以看出,羊肚菌多糖MEP-SP2是由甘露糖、葡萄糖、阿拉伯糖和半乳糖殘基為重復(fù)單元組成的,摩爾比為1.75∶4.13∶0.71∶0.684/7/2023316.4.3高效液相色譜不需要衍生為氣化物質(zhì)用分配或者離子交換色譜分離，檢測(cè)使用紫外或折光率檢測(cè)器通常使用鍵合固定相，以反向色譜方式分離，洗脫用乙腈和水（80：20），其中含0.1mol/L的乙酸。4/7/2023326.4.4高效毛細(xì)管電泳法（HPCE)用化學(xué)衍生法為糖類帶上具有紫外吸收或發(fā)熒光的基團(tuán)：還原氨基化多數(shù)糖分子在通常情況下難以電離，通過衍生化其電離能力和疏水性也發(fā)生了相應(yīng)的變化。堿性硼酸體系是電泳的首選介質(zhì)，一般地，硼酸濃度在50～