糞便中芽孢桿菌的分開和鑒定

本文格式為Word版，下載可任意編輯——糞便中芽孢桿菌的分開和鑒定糞便中芽孢桿菌的分開和鑒定

一、試驗(yàn)原理：通過對(duì)糞便的處理，對(duì)其進(jìn)行細(xì)菌分開，選擇出芽孢桿菌。芽孢桿菌多為革蘭氏陽性菌，需氧或者兼性厭氧。通過普通培養(yǎng)基進(jìn)行細(xì)菌培養(yǎng)，觀測(cè)其菌落的形態(tài)、特征。對(duì)典型的菌落進(jìn)行革蘭氏染色和芽孢染色。之后進(jìn)行普通培養(yǎng)基、血瓊脂培養(yǎng)基、固體培養(yǎng)基培養(yǎng)。之后進(jìn)行過氧化氫、VP試驗(yàn)、淀粉水解、檸檬酸鹽利用、硝酸鹽還原、甲基紅試驗(yàn)、吲哚產(chǎn)生試驗(yàn)、苯丙氨酸脫酸試驗(yàn)、葡萄糖的水解試驗(yàn)、阿拉伯糖、木糖、甘露醇、乳糖的分解試驗(yàn)、液化明膠試驗(yàn)、硫銨水解試驗(yàn)等生理生化試驗(yàn)。對(duì)細(xì)菌進(jìn)行16srDNA序列測(cè)序，測(cè)GC堿基的所占比例、PCR測(cè)序，確定具體為何種芽孢桿菌，最終進(jìn)行小鼠毒性試驗(yàn)。

二、試驗(yàn)材料糞便

錐形瓶、燒杯、載玻片、玻璃棒、膠頭滴管玻、璃珠、培養(yǎng)皿、移液管、移液槍及槍頭小試管、試管、細(xì)玻璃棒、接種環(huán)、接種針、搪瓷缸、

水浴鍋、紗布、冰箱、搖床、酒精燈、蒸餾水、無菌水、恒溫培養(yǎng)箱、高壓鍋、電爐、pH試紙、PH計(jì)

吸水紙、顯微鏡、秒表、天平、電子稱、電子天平、溫度計(jì)、記號(hào)筆、濾紙、塞子、紗布、冰箱PCR儀、微量移液器、一次性手套、小鼠、手術(shù)刀、注射器

草酸銨結(jié)晶紫溶液、碘液、石碳酸溶液、95%酒精、堿性美藍(lán)溶液、3%過氧化氫溶液、肌酸/肌酐、40%氫氧化鉀、無菌羊血清、3%淀粉溶液、檸檬酸鈉、硫酸鎂、磷酸二氫鉀、瓊脂、磷酸一氫鉀、氯化鈉、溴麝香草酚藍(lán)酒精溶液、硝酸鉀、蛋白胨、1%氫氧化鈉、對(duì)氨基苯磺酸、5mol/L醋酸、α-萘胺、脫脂棉、二苯胺、濃硫酸、葡萄糖、、甲基紅溶液、DL-苯丙氨酸、酵母浸液、10%氯化鐵、蔗糖、麥芽糖、阿拉伯糖、木糖、乳糖、甘露醇、0.2%溴麝香草酚藍(lán)水溶液、1%溴麝香草酚藍(lán)水溶液、HL-葡萄糖培養(yǎng)管、硫胨、牛肉膏、明膠、、對(duì)位二甲氨基苯甲醛、無水乙醇、青霉素、

反應(yīng)緩沖液、2mM脫氧核苷三磷酸底物、耐熱DNA聚合酶、

三、試驗(yàn)步驟

3.1糞便的處理;取樣品1g，加至帶玻璃珠的含100mL無菌水的錐形瓶中，靜置20min后，在搖床上20r/min充分振蕩30min，將樣品液于80℃水浴15min，取10mL樣品液均勻涂布在制備好的普通營(yíng)養(yǎng)瓊脂平板上，37℃過夜培養(yǎng)3.1.1普通肉湯培養(yǎng)基

配方：牛肉膏5g、蛋白胨10g、氯化鈉5g、磷酸氫二鉀1g、蒸餾水1000mL配制：按上述要求稱量（先稱鹽類、蛋白胨、牛肉膏），至于鋁鍋或者搪瓷缸；將上述成分混合加熱溶解后，以0.1mol/L氫氧化鈉調(diào)整PH為7.4~7.63.1.2普通瓊脂培養(yǎng)基的制作

配方：普通肉湯500ml（牛肉膏、蛋白胨、氯化鈉、磷酸二氫鉀、蒸餾水）、瓊脂10g（在液體培養(yǎng)基參與瓊脂1.5%~2%為固體培養(yǎng)基、參與0.3~0.5%為半固體培養(yǎng)基）

配制：

1）將稱好的瓊脂加到普通肉湯內(nèi)，加熱煮沸待瓊脂完全溶化，分裝試管或用于制備瓊脂平板。分裝試管每管約4~5ml。分裝完畢塞好棉塞，包扎好待滅菌。

2)高壓蒸汽滅菌后，趁熱將試管口的一端放在玻璃棒上，使之有一定的濃度，凝固

后即成普通瓊脂斜面。也可直立，凝固后即成高層瓊脂。

3)剩余部分的普通瓊脂以手掌感想，若將瓊脂瓶緊緊手中感覺燙，但仍能緊握時(shí)，即為傾倒平皿的適合溫度（50~60℃）.每只滅菌培養(yǎng)皿倒入10~15ml，將培養(yǎng)皿蓋上，并將培養(yǎng)皿于桌面上輕輕回轉(zhuǎn)，使培養(yǎng)皿平鋪于皿底，即成普通瓊脂平板。3.1.3鮮血瓊脂培養(yǎng)基的制備

1）將滅菌的普通瓊脂培養(yǎng)基加熱溶化，待冷卻至50℃，參與無菌的脫纖綿羊或者家兔的鮮血5%~6%混合后，分裝滅菌試管，馬上擺成斜面或者傾注于滅菌平皿（瓊脂溫度過高參與后為紫褐色，過低時(shí)鮮血參與不凝固，不易混合。混合時(shí)切勿產(chǎn)生氣泡）。待凝固后，至37℃無菌檢驗(yàn)24h，無雜菌生長(zhǎng)方可應(yīng)用。

2）無菌血液采用無菌操作采自健康動(dòng)物，將血液加到盛有5%滅菌枸櫞酸鈉或者3%滅菌肝素的100ml三角瓶?jī)?nèi)，至冰箱待用。

3.2細(xì)菌的分開：

將上清液接種于營(yíng)養(yǎng)肉湯，37℃,200r/min培養(yǎng)24h，,取培養(yǎng)液80℃水浴15min，殺死非芽孢桿菌，接種于營(yíng)養(yǎng)肉湯，37℃，200r/min富集培養(yǎng)20h。3.3：細(xì)菌的純化：

取富集菌液梯度稀釋10-3、10-4、10-5、10-6、10-7，選擇三個(gè)適合的梯度混菌劃線分開（劃線法先將平板置于30℃（24-48h）或37℃（18-24h），無菌檢查，表面冷凝水枯燥）。每個(gè)梯度二個(gè)平皿，將平板倒置，于35℃-37℃24-48h。對(duì)長(zhǎng)出的單菌落進(jìn)行編號(hào)，選擇生長(zhǎng)快、菌落大，表面枯燥，粗糙，不透明的菌落轉(zhuǎn)接于斜面培養(yǎng)。挑取少許菌苔涂片，做芽胞染色判斷是否為芽孢桿菌。

3.3.1細(xì)菌的制涂片備：取一塊清白的載玻片，各滴一滴無菌水于載玻片中央，用接種環(huán)以無菌操作法在火焰旁從菌種上挑取少許菌體于水滴中，混勻并涂成薄膜，枯燥，固定。3.3.2革蘭氏染色

1）涂片、枯燥、固定

2）滴加草酸銨結(jié)晶紫溶液，經(jīng)1~2min，用沖洗瓶水洗，直立，枯燥。3）滴加碘液1~3min，水洗。

4）加95%酒精脫色，0.5~1min，水洗。

5）加稀釋的石碳酸復(fù)紅/黃水溶液復(fù)染10~30s，水洗。6）用吸水紙吸干，枯燥，有油鏡觀測(cè)。

結(jié)果判定：革蘭氏陽性菌呈藍(lán)紫色；革蘭氏陰性菌呈紅色。3.3.3芽孢染色

1）涂片，枯燥，固定。

2）滴加石碳酸復(fù)紅染液，加熱至產(chǎn)生蒸汽，染色5min，水洗。3）脫色：滴加95%酒精，脫色2min，至淡紅色為止，水洗。4)復(fù)染;滴加堿性美藍(lán)溶液，60s，水洗。5）枯燥，鏡檢

結(jié)果判定：芽孢呈紅色，菌體呈藍(lán)色3.4生理生化試驗(yàn)

3.4.1過氧化氫酶（觸酶）試驗(yàn)試驗(yàn)步驟：

方法一：取清白的載玻片，在上面滴一滴3%過氧化氫溶液，挑取一環(huán)斜面培養(yǎng)的試驗(yàn)菌，放在過氧化氫溶液中混勻，若有氣泡出現(xiàn)，則為過氧化氫酶試驗(yàn)陽性；無氣泡產(chǎn)生者為陰性。

方法二：取2ml3%的過氧化氫參與到清白的小試管中，用細(xì)玻璃棒蘸取試驗(yàn)菌，插入到過氧化氫液面以下，若有氣泡為陽性

方法三：將1mL3%過氧化氫滴加在生長(zhǎng)物菌落上，有氣泡產(chǎn)生為陽性。注意：試驗(yàn)菌不應(yīng)培養(yǎng)在含有血液的培養(yǎng)基，易造成假陽性反應(yīng)；不能鉑環(huán)代替玻璃棒，會(huì)反應(yīng)產(chǎn)生氣泡；每次反應(yīng)應(yīng)設(shè)立對(duì)照，陽性對(duì)照菌為金黃色葡萄球菌，陰性為鏈球菌

3.4.2VP試驗(yàn)

1、培養(yǎng)基：同MR試驗(yàn)

2、試劑：①奧美拉式試劑：0.3g肌酸或者肌酐溶于100ml40%氫氧化鉀即成②貝立脫氏試劑：甲液為6%α-萘酚酒精溶液，乙液為16%的氫氧化鈉溶液③硫酸銅試劑：1g硫酸銅溶于40ml氨水中，再加10%氫氧化鈉至1000ml

3、試驗(yàn)步驟：

1）將被檢細(xì)菌接種到葡萄糖蛋白胨水中，置37℃培養(yǎng)48h。2）在培養(yǎng)物中參與等量的奧美拉式試劑（或硫酸銅試劑），混合，或1ml培養(yǎng)物參與0.5ml貝立脫氏試劑甲液和乙液振蕩混合，觀測(cè)結(jié)果。

3）結(jié)果判定：在5min內(nèi)浮現(xiàn)粉紅色為陽性；長(zhǎng)時(shí)間無反應(yīng)，置37℃培養(yǎng)4h或室溫過夜。顏色仍不變者為陰性

3.4.3淀粉水解試驗(yàn)1、培養(yǎng)基

配方：營(yíng)養(yǎng)瓊脂90ml、無菌羊血清（只對(duì)不易生長(zhǎng)的細(xì)菌才加）5ml、無菌3%淀粉溶液配制：將瓊脂加熱溶化，冷卻至50℃時(shí)，以無菌操作法參與無菌羊血清及無菌淀粉溶液，混合均勻后傾注平板。試劑：革蘭氏碘液2、試驗(yàn)步驟：

1）將待檢菌劃線接種于上述平板上，置37℃培養(yǎng)24h

2）形成菌落后，在菌落處滴加革蘭氏碘液，以鋪滿菌落周邊為宜，觀測(cè)顏色變化。3）結(jié)果判定：培養(yǎng)基浮現(xiàn)藍(lán)色，能水解淀粉的細(xì)菌其菌落周邊出現(xiàn)無色透明圈。3.4.4檸檬酸鹽利用試驗(yàn)

1、培養(yǎng)基：西蒙式培養(yǎng)基

配方：檸檬酸鈉1g、硫酸鎂（Mgso4.7H2o）0.2g、磷酸氫二鉀1g、瓊脂20g、磷酸二氫銨1g、氯化鈉5g、1%溴麝香草酚藍(lán)酒精溶液10ml、蒸餾水1000ml

配制：將除瓊脂和溴麝香草酚藍(lán)溶液外的各成分溶解后，調(diào)解pH6.8~7.0，參與瓊脂溶化，再參與溴麝香草酚藍(lán)溶液，分裝試管，經(jīng)121℃滅菌15min，制成斜面?zhèn)溆谩?、試驗(yàn)步驟

1）將待檢菌在培養(yǎng)基上先劃線再穿刺，37℃培養(yǎng)觀測(cè)2~4d。

2)結(jié)果判定：陽性者在培養(yǎng)基斜面上生長(zhǎng)，并且西蒙式培養(yǎng)基由草綠色變?yōu)樗{(lán)色。3.4.5硝酸鹽還原試驗(yàn)

1、需氧菌培養(yǎng)基：

配方：硝酸鉀0.2g、蛋白胨5g、蒸餾水1000mL配制：將各成分溶解，調(diào)pH7.4，試管分裝，經(jīng)121℃滅菌20min試劑：甲液：將0.8g對(duì)氨基苯磺酸溶解于100mL5mol/L醋酸即成乙液：將0.5gα-萘胺徐徐加熱溶解于100mL5mol/L醋酸后，用脫脂棉過濾即可。二苯胺試劑：二苯胺0.5g溶于100ml濃硫酸中，用20mL蒸餾水稀釋。

2、試驗(yàn)步驟;

1)將待檢菌接種到培養(yǎng)基上，同時(shí)設(shè)立對(duì)照，37℃培養(yǎng)觀測(cè)4d，每天取培養(yǎng)液少許放入兩支返京的小試管中，每個(gè)試管再滴加甲液和乙液各一滴，對(duì)照管同樣處理，觀測(cè)結(jié)果。2）結(jié)果判定：如試管菌液浮現(xiàn)紅色、橙色者為陽性反應(yīng)。如無紅色出現(xiàn)，則可加一滴二苯胺試劑，此時(shí)若浮現(xiàn)藍(lán)色反應(yīng)，則表示培養(yǎng)基中有硝酸鹽的存在；若不呈藍(lán)色反應(yīng)，則表示硝酸鹽和形成的硝酸鹽已被還原成其他物質(zhì)，仍應(yīng)記為硝酸鹽還原試驗(yàn)陽性反應(yīng)。3.4.6甲基紅（MR）試驗(yàn)

1、培養(yǎng)基：

配方：蛋白胨0.7g、磷酸氫二鉀0.5g、葡萄糖0.5g、氯化鈉0.5g，蒸餾水100ml配制:將上述成分混合于蒸餾水中，加熱溶解，調(diào)解pH7.2~7.4，濾紙過濾，分裝與小試管內(nèi)，每管3~5ml，加塞包好，經(jīng)115℃滅菌20min后備用。

試劑：甲基紅0.02g、95%酒精60ml、蒸餾水40ml2、試驗(yàn)步驟：

1）將待檢菌接種于培養(yǎng)基，置37℃培養(yǎng)48h。

2）取少量培養(yǎng)液于另一小試管，參與幾滴指示劑，觀測(cè)顏色變化，若無顏色變化可繼續(xù)培養(yǎng)4~5d再進(jìn)行試驗(yàn)。

3）結(jié)果判定：培養(yǎng)液浮現(xiàn)紅色表示為陽性；浮現(xiàn)黃色為陰性。

3.4.7苯丙氨酸脫氨試驗(yàn)

1、培養(yǎng)基

配方：DL-苯丙氨酸2g、氯化鈉5g、瓊脂12g、酵母浸膏3g、磷酸氫二鈉1g、蒸餾水1000ml

配制：將上述培養(yǎng)基配方中的各成分混合于蒸餾水中，加熱溶解后，調(diào)解pH為7.4，過濾分裝，115℃滅菌20min。趁熱制成斜面?zhèn)溆?/p>

試劑：10%三氯化鐵溶液

器材：恒溫培養(yǎng)箱、高壓鍋、電爐、搪瓷缸、。接種針、ph試紙、小試管2、試驗(yàn)步驟

1）挑取大量待檢菌培養(yǎng)物，接種到上述培養(yǎng)基斜面上，37℃培養(yǎng)18~24h，在生長(zhǎng)好的細(xì)菌的培養(yǎng)基斜面上滴加0.2ml（4~5滴）10%三氯化鐵溶液2）結(jié)果判定：斜面變綠為陽性；否則陰性

3.4.8葡萄糖酵解試驗(yàn)（O/F試驗(yàn)、HL試驗(yàn)）1、培養(yǎng)基：

配方：蛋白胨0.2g、氯化鈉0.5g、磷酸氫二鉀0.03g、葡萄糖1g、瓊脂0.5g、蒸餾水100ml、1%溴麝香草酚藍(lán)水溶液0.3ml

配制：除指示劑意外，溶解以上各成分、調(diào)解pH6.8~7.0，再參與指示劑，分裝試管，115℃滅菌20min。

2、試驗(yàn)步驟：取兩支HL葡萄糖培養(yǎng)管，至沸水中10min，冷卻后將試驗(yàn)菌穿刺接種。其中一支用滅菌的液體石蠟覆蓋隔絕空氣，為封閉管，亦檢測(cè)發(fā)酵特征；另一管不加液體石蠟，為開管，暴露于空氣以檢測(cè)氧化特征

3、結(jié)果判定：若兩管均不變色，為堿型或者不活動(dòng)型，O/F試驗(yàn)為陰性；兩管均產(chǎn)酸變?yōu)辄S色為發(fā)酵型；封閉管不產(chǎn)酸顏色不變，開管產(chǎn)酸變?yōu)辄S色為氧化型3.4.9阿拉伯糖、木糖、麥芽糖、甘露醇、乳糖分解試驗(yàn)

1、需氧菌適用的培養(yǎng)基

配方：蛋白胨1g、氯化鈉0.5g、蒸餾水100ml、糖/醇物質(zhì)0.5~1g、0.2%溴麝香草酚藍(lán)水溶液1.2ml

配制：除指示劑之外，溶解各成分，調(diào)PH為7.4~7.6，參與指示劑混勻，分裝試管。管內(nèi)事先裝有倒置的小玻璃管。如在培養(yǎng)基中參與0.5~0.7瓊脂，制成半固體培養(yǎng)基，可不用倒置的小管。經(jīng)115℃滅菌20min2、試驗(yàn)步驟：

1）依照培養(yǎng)基配方，選擇培養(yǎng)基，高壓滅菌并做無菌檢驗(yàn)后備用2）取培養(yǎng)18~24h的試驗(yàn)菌，接種于培養(yǎng)基中（如為半固體應(yīng)穿刺），置37℃培養(yǎng)數(shù)小時(shí)至2周后觀測(cè)結(jié)果

3）結(jié)果記錄：指示劑由紫色變?yōu)辄S色，表示糖類產(chǎn)酸，以“+〞表示；若指示劑由紫色變?yōu)辄S色且試管內(nèi)倒置的小管有氣泡出現(xiàn)，則表示產(chǎn)酸產(chǎn)氣，以“〞表示；若指示劑未改變，則表示對(duì)糖類不發(fā)酵，以“—〞表示。（注：半固體糖發(fā)酵培養(yǎng)基做穿刺接種，除觀測(cè)產(chǎn)酸產(chǎn)氣外，尚可觀測(cè)細(xì)菌的運(yùn)動(dòng)性）3.4.10硫銨試驗(yàn)

1、培養(yǎng)基（三氯化鐵明膠培養(yǎng)基）：

配方：硫胨25g、氯化納5g、牛肉膏7.5g、明膠120g、10%三氯化鐵水溶液

配制：將除三氯化鐵水溶液以外的成分混合，加熱溶化并高溫滅菌，趁熱參與預(yù)先滅菌的10%三氯化鐵水溶液，混勻，無菌分裝小試管，直立凝固。

器材：恒溫培養(yǎng)箱、高壓鍋、電爐、搪瓷缸、小試管、pH試紙、接種針2、試驗(yàn)步驟;

用接種針取待測(cè)菌沿管壁做穿刺接種，37℃培養(yǎng)觀測(cè)2~7d。結(jié)果判定：明膠變黑為陽性，否則為陰性。

3.4.11液化明膠試驗(yàn)

1、明膠培養(yǎng)基：

配方：蛋白胨5g、牛肉膏3g、明膠120g、蒸餾水1000mL

配制：將上述成分混合，置滾動(dòng)蒸汽滅菌器內(nèi)，加熱溶解，調(diào)理pH7.0~7.2，用紗布過濾，分裝試管，121℃滅菌15min。

2、試驗(yàn)步驟;

1)挑取培養(yǎng)18~24h的待檢菌，以較大量穿刺接種于明膠高層約2/3深度。于20~22℃培養(yǎng)7~14d，明膠高層也可培養(yǎng)于36℃左右。另取一只未接種的培養(yǎng)基作對(duì)照，每天取出兩支試管，放入冰箱20~30min，再觀測(cè)結(jié)果。

2）結(jié)果判明：明膠液化為陽性；明膠凝固為陰性。3.4.12吲哚試驗(yàn)1、培養(yǎng)基

配方：蛋白胨1g、氯化鈉0.5