第八章 分子標(biāo)記及其應(yīng)用

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1)分子標(biāo)記的種類與特點

1.遺傳標(biāo)記的種類與特點

遺傳標(biāo)記：指可以穩(wěn)定遺傳的、易于識別的特別遺傳多態(tài)性形式。Minisatellites：小衛(wèi)星序列遺傳標(biāo)記的種類與特點

1）形態(tài)標(biāo)記：肉眼可見的特征性狀，簡單實用，但數(shù)目少，受發(fā)育階段與環(huán)境影響。

2）細胞標(biāo)記：染色體核型與帶型，受環(huán)境影響小，穩(wěn)定可靠，但耗時耗力，信息量不足。

3）生化標(biāo)記：貯藏蛋白、同工酶等，信息量較大，取材便利，但不能反映基因組非編碼區(qū)信息，仍受發(fā)育階段與環(huán)境影響。

4）DNA分子標(biāo)記：基因組DNA水平的變異，理想的遺傳標(biāo)記。2.DNA分子標(biāo)記

DNA分子標(biāo)記：簡稱分子標(biāo)記，指基因組DNA水平上的任何差異，來自缺失、插入、置換、顛換、重復(fù)等，尋常以分子雜交或凝膠電泳圖譜的形式表達。2.1分子標(biāo)記的優(yōu)點

1）數(shù)量多，廣泛整個基因組，理論上檢測位點近乎無限；2）穩(wěn)定遺傳，不受環(huán)境、發(fā)育階段和是否表達等限制;3）多態(tài)性高，自然存在，無須專門創(chuàng)造；4）表現(xiàn)為“中性〞，即不影響性狀的表達；

5）大量為共顯性，能鑒別雜合與純合，提供完整的遺傳信息。2.2分子標(biāo)記的類型分三大類:

1)基于核酸分子雜交:第一代，1980s,RFLP（Restrictionfragmentlength

polymorphism），限制性片段長度多態(tài)性

2)基于PCR或限制酶切+PCR:其次代，1990s,RAPD、AFLP、SSR、ISSR、

SCAR、STS等

3)基于DNA測序:第三代，近年來SNP和EST,反轉(zhuǎn)錄轉(zhuǎn)座子等

第三節(jié)分子標(biāo)記的應(yīng)用

1.RFLP標(biāo)記

RFLP(RestrictionFragmentLengthPolymorphism)：限制性片段長度多態(tài)性，1980，Botstein。

基本原理：不同基因組DNA經(jīng)特定限制酶消化后產(chǎn)生大小不等的片段，再經(jīng)電泳分開、Southern印跡雜交和檢測后，得到特異的RFLP標(biāo)記，它反映不同DNA對所用探針限制性酶切片段長度的多態(tài)性，實際是酶切位點的變化和分布狀況。關(guān)鍵因素：

限制酶：用一種酶切產(chǎn)生的多態(tài)性有限，常用6~8種酶來篩選多態(tài)性。探針：常用單拷貝或低拷貝gDNA或cDNA克隆，否則條帶模糊（smear），不易觀測。

RFLP標(biāo)記的優(yōu)缺點優(yōu)點：1）共顯性；

2）存在于整個基因組，位點數(shù)不受限制，?？蓹z測到1~4個基因座；缺點：

1）篩選多態(tài)性探針較困難，需一系列探針；

2）DNA樣本量要求大，操作較繁雜，耗時費資，同位素污染，現(xiàn)已發(fā)展地高辛等標(biāo)記。2.RAPD標(biāo)記

RAPD(RandomamplifiedpolymorphicDNA)：隨機擴增多態(tài)性DNA。1990年提出。

基本原理:單引物PCR標(biāo)記；不同基因組DNA在隨機引物Arbitaryprimer（8~10bp）結(jié)合位點以及2個結(jié)合位點之間的距離可能不同，導(dǎo)致擴增片段數(shù)目和長度不同，經(jīng)電泳分開顯示出來，反映基因組相應(yīng)區(qū)域DNA的多態(tài)性。

步驟：退火溫度36℃左右，其余同普通PCR。RAPD標(biāo)記的優(yōu)缺點優(yōu)點：

1）簡單快速，模板用量少，無需同位素；2）無需基因組序列信息，引物通用；3）成本低。缺點：

1）顯性標(biāo)記，不能鑒別雜合子與純合子；

2）穩(wěn)定性和重復(fù)性較差；受好多因素影響：退火延伸溫度，模板濃度，Mg2+濃度，試劑污染，應(yīng)舍重復(fù)

3）序列不同但長度一致的片段共遷移，使多態(tài)性檢測受限制.只能分開片段長度不同的dna片段，對于長度一致但堿基組成不同的就分不出來3.AFLP標(biāo)記

AFLP(Amplifiedfragmentlengthpolymorphism)：擴增片段長度多態(tài)性，1992年提出，RFLP與PCR相結(jié)合的產(chǎn)物。

基本原理:基因組DNA限制酶切（1種為常見6堿基切點，另1種為4堿基稀有識別位點，常為EcoRI（6）/MseI（4）），酶切后DNA片段連接雙鏈人工接頭（14~18bp，核心順序+限制酶識別序列，隨機設(shè)計），以接頭和相鄰的限制酶位點作為引物結(jié)合位點，進行雙引物PCR擴增，產(chǎn)物用高分辯力測序膠分開。此多態(tài)性主要來自引物3`端選擇性核苷酸的變化。AFLP關(guān)鍵技術(shù)：引物的設(shè)計與組合。引物由三部分組成:1)5`端與人工接頭互補;

2)中間部分與限制酶識別位點互補;3)3`端為1~3個選擇性核苷酸。AFLP圖譜

常用2~3個選擇性堿基，每個泳道50~100條帶AFLP標(biāo)記的優(yōu)缺點優(yōu)點：

1）兼具PCR的高效性與RFLP的確鑿性；2）常擴增50~100條帶，多態(tài)性高，信息量大；

3）通過設(shè)計不同接頭就可得到不同的引物，無需基因組序列信息。缺點:

1）步驟多，流程長，重復(fù)性不夠好；

2）需放射性同位素或熒光素等標(biāo)記引物，但目前已發(fā)展銀染技術(shù)；3）顯性標(biāo)記。4.SSR標(biāo)記

SSR（simplesequencerepeat）：簡單序列重復(fù)，也稱微衛(wèi)星(microsatelite)DNA，真核基因組中普遍存在，隨機分布，主要位于非編碼區(qū)；重復(fù)單元2~5bp，串聯(lián)重復(fù)10~60次，多態(tài)性主要來自串聯(lián)重復(fù)次數(shù)的不同。

SSR標(biāo)記的原理:不同基因型某一特定位點的SSR長度不同,但其側(cè)翼序列往往是保守的單一序列，據(jù)此側(cè)翼序列設(shè)計雙引物，經(jīng)PCR擴增即可得到長度不同的SSR片段，產(chǎn)物經(jīng)PAGE或高濃度瓊脂糖凝膠電泳，即可顯示不同基因型在此位點的多態(tài)性。

注：一般檢測的是單一位點的復(fù)等位基因，農(nóng)作物中多數(shù)SSR位點的復(fù)等位基因數(shù)多達十幾甚至幾十個，多態(tài)性高。SSR側(cè)翼序列的獲得：（作為設(shè)計引物的模板）一般程序：

1）建立基因組DNA的質(zhì)粒文庫；

2）根據(jù)預(yù)得到的SSR類型設(shè)計并合成探針，如預(yù)獲得(AT)n/(TA)n，則合成(AT)n探針；

3）用探針篩庫，獲得陽性克??；4）對陽性克隆DNA插入序列進行測序。SSR標(biāo)記的優(yōu)缺點優(yōu)點：

1)序列短，多數(shù)小于200bp，易擴增；2)有高度多態(tài)性，信息量大；

3)共顯性。缺點：

須獲得側(cè)翼序列設(shè)計引物，步驟多、費用高；引物具有物種特異性。5.SNP標(biāo)記

SNP(singlenucleotidepolymorphism)：單核苷酸多態(tài)性，指不同基因組DNA中某一特定位置上單個核苷酸的差異，包括單堿基的轉(zhuǎn)換、顛換、插入和缺失等，而且其在群體中出現(xiàn)的頻率大于1%（如低于1%，則視為點突變，不可能作為標(biāo)記）。

SNP的分布與遺傳效應(yīng)

1）分布于編碼區(qū)：即cSNP，功能性變異，可能會影響蛋白產(chǎn)物的氨基酸序列和功能。

2）分布于非編碼區(qū)：即調(diào)理區(qū)/基因周邊SNPs，可能影響基因的表達水平。SNP是決定人類疾病易感性和藥物反應(yīng)差異的主要因素，有些疾病和性狀與SNP有關(guān)，如人鐮刀型細胞貧血癥。SNP的檢測方法：

有近百種，包括雜交法、熔解法、電泳法、酶學(xué)法、化學(xué)法、物理法、測序法（最直接）以及它們的組合方法，綜合利用納米材料技術(shù)、多重PCR技術(shù)、各種熒光探針設(shè)計技術(shù)和各種熒光標(biāo)記技術(shù)等。

DNA芯片技術(shù)在高通量檢測SNP方面顯示出獨特的優(yōu)勢，最理想、最具有發(fā)展?jié)摿?，但仍存在成本高、重?fù)性不夠好等問題。SNP標(biāo)記的優(yōu)缺點優(yōu)點：

是覆蓋全基因組、標(biāo)記數(shù)量最大，多態(tài)性最