浙江大學(xué)細(xì)胞培養(yǎng)-基礎(chǔ)知識(shí)

一、細(xì)胞培養(yǎng)物的生長(zhǎng)生物學(xué)按生長(zhǎng)方式粘附型細(xì)胞上皮細(xì)胞型成纖維細(xì)胞型游走細(xì)胞型多型細(xì)胞型各種實(shí)體瘤細(xì)胞懸浮型細(xì)胞造血系統(tǒng)腫瘤細(xì)胞體外細(xì)胞培養(yǎng)物的生長(zhǎng)類型第一頁(yè)，共130頁(yè)。成纖維細(xì)胞：梭形、三角形、2-3個(gè)突起上皮細(xì)胞：扁平、多角形、圓核可連成單層第二頁(yè)，共130頁(yè)。(1)上皮型細(xì)胞(2)成纖維型細(xì)胞(3)游走型細(xì)胞(4)多形型細(xì)胞

1234第三頁(yè)，共130頁(yè)。（一）貼附(粘附)型細(xì)胞

粘附:是大多數(shù)有機(jī)體細(xì)胞在體內(nèi)生存和生長(zhǎng)發(fā)育的基本存在方式含義：細(xì)胞與細(xì)胞間接觸，細(xì)胞與細(xì)胞外基質(zhì)結(jié)合。結(jié)果：細(xì)胞與細(xì)胞之間相互結(jié)合形成組織，使細(xì)胞與其周?chē)h(huán)境間始終保持聯(lián)系，使有機(jī)體內(nèi)幾乎不存在“自由”的細(xì)胞。培養(yǎng)時(shí)：這些細(xì)胞被放到體外環(huán)境中以后,同樣需要粘附于某一固相表面才能生存和生長(zhǎng)，因而屬于粘附型細(xì)胞。第四頁(yè)，共130頁(yè)。++++++++++++細(xì)胞的貼附過(guò)程貼附物質(zhì)帶正電荷細(xì)胞帶負(fù)電荷第五頁(yè)，共130頁(yè)。細(xì)胞呈扁平不規(guī)則多角形，中央有圓形核，細(xì)胞彼此緊密相連成單層膜。生長(zhǎng)時(shí)呈膜狀移動(dòng)，處于膜邊緣的細(xì)胞總與膜相連，很少單獨(dú)行動(dòng)。起源于內(nèi)、外胚層的細(xì)胞如皮膚表皮及其衍生物、消化管上皮、肝、胰、肺泡上皮等皆成上皮型形態(tài)。來(lái)源：來(lái)源于外胚層，內(nèi)胚層細(xì)胞如：皮膚及其衍生物，乳腺 外胚層消化道，呼吸道上皮 內(nèi)胚層內(nèi)皮 中胚層上皮性腫瘤形態(tài)：類似體內(nèi)的上皮細(xì)胞，但不完全相同上皮細(xì)胞型

第六頁(yè)，共130頁(yè)。易相連成片相靠—緊密相連—成薄層—鋪石狀生長(zhǎng)時(shí)呈膜狀移動(dòng)很少脫離細(xì)胞群而單個(gè)活動(dòng)上皮細(xì)胞型—生長(zhǎng)特點(diǎn)第七頁(yè)，共130頁(yè)。成纖維細(xì)胞型

名稱：凡在培養(yǎng)中形態(tài)與成纖維細(xì)胞類似的來(lái)源：由中胚層間充質(zhì)組織起源的組織如：真正的成纖維細(xì)胞心肌，平滑肌，成骨細(xì)胞，血管內(nèi)皮形態(tài)：似體內(nèi)成纖維細(xì)胞的形態(tài)，梭形或不規(guī)則三角形，胞質(zhì)向外伸出2—3個(gè)長(zhǎng)短不等的突起，中有卵圓形核。第八頁(yè)，共130頁(yè)。排列成放射狀，漩渦狀不緊靠連成片，細(xì)胞與細(xì)胞接觸易斷開(kāi)而單獨(dú)行動(dòng)游離的單獨(dú)的成纖維樣細(xì)胞，常有幾個(gè)伸長(zhǎng)的細(xì)胞突起成纖維細(xì)胞型—生長(zhǎng)特點(diǎn)第九頁(yè)，共130頁(yè)。體外培養(yǎng)的大鼠主動(dòng)脈平滑肌細(xì)胞第十頁(yè)，共130頁(yè)。具有類似巨噬細(xì)胞樣的特征。經(jīng)常處于較活躍的變形及游走狀態(tài)，因此外形不規(guī)則且不斷變化。當(dāng)細(xì)胞密度增大相互連接成片時(shí)，游走受限，形狀上類似上皮型細(xì)胞或成纖維細(xì)胞型的細(xì)胞。表現(xiàn)這種形態(tài)的細(xì)胞主要是具有吞噬作用的單核巨噬細(xì)胞系統(tǒng)的細(xì)胞，如顆粒性白細(xì)胞、淋巴細(xì)胞、單核細(xì)胞、巨噬細(xì)胞、肝枯否細(xì)胞(Kupffercell)以及某些腫瘤細(xì)胞等。

游走型細(xì)胞第十一頁(yè)，共130頁(yè)。多形型細(xì)胞是一些形態(tài)上不規(guī)則的細(xì)胞，細(xì)胞一般分胞體和胞突兩部分：其胞突為細(xì)長(zhǎng)形，似絲狀偽足。胞體雖略呈多角形，但沒(méi)有成纖維細(xì)胞型那樣不規(guī)則。體外培養(yǎng)中呈現(xiàn)多形型的細(xì)胞最常見(jiàn)的類型是神經(jīng)元和神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞。多形型細(xì)胞第十二頁(yè)，共130頁(yè)。細(xì)胞形態(tài)并非固定不變，可隨培養(yǎng)條件、生長(zhǎng)時(shí)期、細(xì)胞數(shù)量等而變化細(xì)胞形態(tài)只是對(duì)培養(yǎng)物判斷或識(shí)別的參考指標(biāo)若要確定某一培養(yǎng)物的確切細(xì)胞類型，必須借助更為特異的鑒定方法，如進(jìn)行組織化學(xué)或免疫細(xì)胞化學(xué)染色鑒定。注意：第十三頁(yè)，共130頁(yè)。培養(yǎng)細(xì)胞形態(tài)不穩(wěn)定第十四頁(yè)，共130頁(yè)。（二）懸浮生長(zhǎng)型概念

培養(yǎng)時(shí)不貼附于基質(zhì)而呈懸浮狀態(tài)生長(zhǎng)，或以機(jī)械方法使保持懸浮狀態(tài)下生長(zhǎng)來(lái)源

自血，脾或骨髓，尤其血中白細(xì)胞，癌腫細(xì)胞也可能特點(diǎn)

在懸浮中生長(zhǎng)良好，細(xì)胞圓形，單個(gè)或小細(xì)胞團(tuán)第十五頁(yè)，共130頁(yè)。優(yōu)點(diǎn)

生存空間大，提供數(shù)量多傳代方便(不需消化)易于收獲可獲得穩(wěn)定狀態(tài)缺點(diǎn)觀察不方便很多細(xì)胞不能懸浮生長(zhǎng)(尤其正常細(xì)胞)

第十六頁(yè)，共130頁(yè)。二、培養(yǎng)細(xì)胞的生長(zhǎng)和增殖過(guò)程分裂增殖和生長(zhǎng)發(fā)育是體外培養(yǎng)細(xì)胞的兩大生命特征增殖能力一般與該種細(xì)胞在體內(nèi)的增殖能力相仿第十七頁(yè)，共130頁(yè)。（一）組織培養(yǎng)細(xì)胞生命期

(LifeSpanofCultureCells)在培養(yǎng)中持續(xù)增殖和生長(zhǎng)的時(shí)間。原代培養(yǎng)期、傳代培養(yǎng)期、衰退期。第十八頁(yè)，共130頁(yè)。1、原代培養(yǎng)期(PrimaryCulturestage)也稱初代培養(yǎng)，即從體內(nèi)取出組織接種培養(yǎng)到第一次傳代階段，一般持續(xù)1-4周。特點(diǎn)：細(xì)胞呈活躍移動(dòng)，可見(jiàn)細(xì)胞分裂，但不旺盛。與體內(nèi)原組織在形態(tài)結(jié)構(gòu)和功能活動(dòng)上相似性大。第十九頁(yè)，共130頁(yè)。2、傳代期(passagestage)特點(diǎn)：在全生命期中此期的持續(xù)時(shí)間最長(zhǎng)，細(xì)胞增殖旺盛，并能維持二倍體核型。傳代：體內(nèi)細(xì)胞生長(zhǎng)在動(dòng)態(tài)平衡環(huán)境中，而組織培養(yǎng)細(xì)胞的生存環(huán)境是培養(yǎng)瓶、皿或其它容器，生存空間和營(yíng)養(yǎng)是有限的。當(dāng)細(xì)胞增殖達(dá)到一定密度后，則需要分離出一部分細(xì)胞和更新?tīng)I(yíng)養(yǎng)液，否則將影響細(xì)胞的繼續(xù)生存，這一過(guò)程叫傳代。初代培養(yǎng)的細(xì)胞一經(jīng)傳代后便改稱做細(xì)胞系（CellLine）。第二十頁(yè)，共130頁(yè)。原代培養(yǎng)傳代培養(yǎng)鏡下觀察選取生長(zhǎng)良好的細(xì)胞加入胰蛋白酶消化液倒去酶液，加入培養(yǎng)液反復(fù)吹打制成細(xì)胞懸液按比例分裝后培養(yǎng)第二十一頁(yè)，共130頁(yè)。一代貼附生長(zhǎng)細(xì)胞的生長(zhǎng)過(guò)程游離期貼壁期潛伏期對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期停止期（平臺(tái)期）第二十二頁(yè)，共130頁(yè)。體外培養(yǎng)細(xì)胞一代生存期潛伏期指數(shù)增生期停滯期所謂細(xì)胞的“一代”是指從細(xì)胞接種到分離再培養(yǎng)的一段時(shí)間。第二十三頁(yè)，共130頁(yè)。2.1游離期：細(xì)胞接種后在培養(yǎng)液中呈懸浮狀態(tài)，也稱懸浮期。此時(shí)細(xì)胞質(zhì)回縮，胞體呈圓球形。

10min-4h第二十四頁(yè)，共130頁(yè)。第二十五頁(yè)，共130頁(yè)。2.2貼壁期：細(xì)胞附著于底物上，游離期結(jié)束。細(xì)胞株平均在10分鐘--4小時(shí)貼壁。

底物：膠原、玻璃、塑料、其它細(xì)胞等血清中有促使細(xì)胞貼壁的冷析球蛋白和纖粘素、膠原等糖蛋白（生長(zhǎng)基質(zhì)），這些帶正電荷的糖蛋白的促貼壁因子先吸附于底物上，懸浮細(xì)胞再與吸附有促貼壁因子的附著。進(jìn)口塑料培養(yǎng)瓶涂有生長(zhǎng)基質(zhì)（化學(xué)合成的功能基團(tuán)）第二十六頁(yè)，共130頁(yè)。2.3潛伏期：

此時(shí)細(xì)胞有生長(zhǎng)活動(dòng)，而無(wú)細(xì)胞分裂。細(xì)胞株潛伏期一般為6～24h。2.4對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期：細(xì)胞數(shù)隨時(shí)間變化成倍增長(zhǎng)，活力最佳，最適合進(jìn)行實(shí)驗(yàn)研究。2.5停止期（平臺(tái)期）：細(xì)胞長(zhǎng)滿瓶壁后，細(xì)胞雖有活力但不再分裂機(jī)制：接觸抑制、密度依賴性第二十七頁(yè)，共130頁(yè)。a.貼附b.接觸抑制c.密度抑制培養(yǎng)細(xì)胞的生長(zhǎng)特點(diǎn)第二十八頁(yè)，共130頁(yè)。3、衰退期特點(diǎn)：此期細(xì)胞仍然生存，但增殖很慢或不增殖，最后衰退凋亡。第二十九頁(yè)，共130頁(yè)。細(xì)胞周期M期（有絲分裂期）間期G1期（DNA合成前期）S期（DNA合成期）G2期（DNA合成后期）（二）單個(gè)細(xì)胞的生長(zhǎng)過(guò)程第三十頁(yè)，共130頁(yè)。三、培養(yǎng)細(xì)胞的生存條件培養(yǎng)皿或培養(yǎng)瓶

溫度、濕度和氣體由CO2恒溫孵育箱提供

生長(zhǎng)培養(yǎng)液10％～20％的血清

維持培養(yǎng)液2％～5％的血清

營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)糖、氨基酸、維生素、無(wú)機(jī)離子、微量元素等第三十一頁(yè)，共130頁(yè)。（一）細(xì)胞的營(yíng)養(yǎng)需要

--培養(yǎng)基第三十二頁(yè)，共130頁(yè)。培養(yǎng)基的基本要求基本營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)：氨基酸、維生素、碳水化合物及一些無(wú)機(jī)離子促生長(zhǎng)因子、激素、血清等物質(zhì)滲透壓：因細(xì)胞的類型及種族而異。人血漿滲透壓約為290mmol/L，可視為體外培養(yǎng)人類細(xì)胞的理想滲透壓。鼠細(xì)胞滲透壓在320mM左右。對(duì)于大多數(shù)哺乳動(dòng)物細(xì)胞，滲透壓在260-320mM。pH：大多數(shù)細(xì)胞的適宜pH為7.2-7.4.無(wú)毒、無(wú)污染第三十三頁(yè)，共130頁(yè)。培養(yǎng)基的種類天然培養(yǎng)基：血清合成培養(yǎng)基：第三十四頁(yè)，共130頁(yè)。主要是牛血清

胎牛血清：取自破腹產(chǎn)的胎牛

新生牛血清：取自出生24h的新生牛

小牛血清：取自出生10-30d的小牛主要成分血漿蛋白、多肽、脂肪、碳水化合物、生長(zhǎng)因子、激素、無(wú)機(jī)物等血清：第三十五頁(yè)，共130頁(yè)。主要作用

1）提供基本營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)2）提供貼壁和擴(kuò)展因子3）提供激素及各種生長(zhǎng)因子4）提供結(jié)合蛋白5）對(duì)培養(yǎng)中的細(xì)胞提供某些保護(hù)作用血清：第三十六頁(yè)，共130頁(yè)。主要缺點(diǎn)

1）改變某種細(xì)胞在體內(nèi)的正常狀態(tài)2）血清中含有的某些物質(zhì)對(duì)細(xì)胞有毒害作用3）每個(gè)批次血清的成分不能保持一致4）取材過(guò)程中可能污染支原體、病毒等，對(duì)培養(yǎng)細(xì)胞產(chǎn)生潛在影響血清：第三十七頁(yè)，共130頁(yè)。使用前處理

56oC滅活30min。儲(chǔ)存條件一般儲(chǔ)存于-20oC，避免反復(fù)凍融，購(gòu)買(mǎi)大包裝后，先滅活，然后分裝凍存，使用前4oC融化。使用濃度一般為5-20%，最常用為10%。血清：第三十八頁(yè)，共130頁(yè)。低限量Eagle培養(yǎng)基，僅含有12種2必需氨基酸、谷氨酰胺，8種維生素及必要的無(wú)機(jī)鹽。成分簡(jiǎn)單，易于添加某種特殊成分適應(yīng)某些特殊細(xì)胞的培養(yǎng)。MEM(minimumessentialmedium)：由Dulbecco等人研制，在MEM基礎(chǔ)上增加了各成分的用量，分為高糖型（葡萄糖4500g/L）和低糖型(葡萄糖1000g/L)，高糖型有利于細(xì)胞停泊在一個(gè)位置生長(zhǎng)，適合于生長(zhǎng)較快。附著較困難的腫瘤細(xì)胞。DMEM(Dulbecco'smodifiedEaglemedium)：第三十九頁(yè)，共130頁(yè)。由Iscove等人在DMEM基礎(chǔ)上增加了許多非必需氨基酸及一些維生素，增加了HEPES，葡萄糖含量為高糖型。適合于細(xì)胞密度較低，細(xì)胞生長(zhǎng)較困難的情況，如雜交瘤細(xì)胞的篩選培養(yǎng)，DNA轉(zhuǎn)化后細(xì)胞的培養(yǎng)。IMDM(Iscove'smodifiedDulbecco'smedium)：由Moor等人為培養(yǎng)小鼠的白血病細(xì)胞而設(shè)計(jì)，特別適合懸浮細(xì)胞，尤其是淋巴細(xì)胞的培養(yǎng)，組分較簡(jiǎn)單，目前配方適合多種細(xì)胞的生長(zhǎng)。RPMI1640：第四十頁(yè)，共130頁(yè)。由Morgan等人為培養(yǎng)雞胚組織而設(shè)計(jì)，幾乎含有所有氨基酸、維生素、生長(zhǎng)激素、核酸衍生物等。109比199效果更好。199、109medium：由Ham針對(duì)小鼠二倍體細(xì)胞克隆化培養(yǎng)而設(shè)計(jì)，并逐步改良后也適合人二倍體細(xì)胞的培養(yǎng)，F(xiàn)12在F10配方基礎(chǔ)上增加了一些微量元素和無(wú)機(jī)離子，特別適合進(jìn)行單細(xì)胞分離培養(yǎng)。HamF10、HamF12medium：第四十一頁(yè)，共130頁(yè)。由MeCoy等人專為肉瘤細(xì)胞研制的培養(yǎng)液，后發(fā)現(xiàn)特別適合原代細(xì)胞培養(yǎng)，尤其是較難培養(yǎng)的細(xì)胞生長(zhǎng)。MeCoy's5Amedium：第四十二頁(yè)，共130頁(yè)。一般以HamF12和DMEM按1:1混合作為基礎(chǔ)培養(yǎng)液；在基礎(chǔ)培養(yǎng)液中添加促貼壁物質(zhì)、促生長(zhǎng)因子及激素、酶抑制劑、結(jié)合蛋白和轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白、微量元素等。無(wú)血清培養(yǎng)基：第四十三頁(yè)，共130頁(yè)。均不含有動(dòng)物蛋白；CDM培養(yǎng)基中添加了一些已知結(jié)構(gòu)和功能的小分子化合物，如短肽、植物激素等。無(wú)蛋白培養(yǎng)基(proteinfreemedium,PFM)限定化學(xué)成分培養(yǎng)基(chemicaldefinedmedium,CDM)：第四十四頁(yè)，共130頁(yè)。培養(yǎng)基的選擇1）建立某種細(xì)胞株所用的培養(yǎng)基應(yīng)是首選，可查閱文獻(xiàn)或向賣(mài)家咨詢；2）本實(shí)驗(yàn)室慣用的培養(yǎng)基，許多培養(yǎng)基可適合于多種細(xì)胞；3）根據(jù)細(xì)胞株的特點(diǎn)、實(shí)驗(yàn)的需要選擇培養(yǎng)基；

如小鼠細(xì)胞株多選RPMI1640，進(jìn)行細(xì)胞雜交、轉(zhuǎn)染可選IMDM4）用多種培養(yǎng)基分別培養(yǎng)目的細(xì)胞，根據(jù)其生長(zhǎng)狀態(tài)選擇培養(yǎng)基。第四十五頁(yè)，共130頁(yè)。培養(yǎng)基的配制1）認(rèn)真閱讀說(shuō)明書(shū)；說(shuō)明書(shū)中注明干粉中不包含的成分，如NaHCO3，谷氨酰胺、丙酮酸鈉、HEPES等2）配制時(shí)要保證充分溶解。NaHCO3、谷氨酰胺等物質(zhì)要在培養(yǎng)基完全溶解后才能添加；3）配制所用的水為雙蒸水或三蒸水，離子濃度很低；4）所用器皿應(yīng)潔凈無(wú)菌；5）配制好的培養(yǎng)基應(yīng)馬上過(guò)濾除菌，存于-20oC或4oC。第四十六頁(yè)，共130頁(yè)。制備1000mlRPMI-1640培養(yǎng)基RPMI

1640

干粉培養(yǎng)基10.4g（1包）+

蒸餾水

400ml

↓

磁力攪拌至完全溶解

↓

加三蒸餾水定容至1000ml

↓濾過(guò)除菌，并分裝成200ml/瓶，-20℃凍存

第四十七頁(yè)，共130頁(yè)。酚紅大多數(shù)培養(yǎng)液中使用酚紅作為pH指示(黃--紅--紫)0.4％酚紅溶液：稱取0.4g酚紅，置玻璃研缽中細(xì)研，逐滴加入0.1mol/LNaOH邊滴邊研至酚紅完全溶解，記好加NaOH的量，共加11.28ml，將研好的酚紅液用吸管移入燒瓶中加三蒸水88.72ml，高壓滅菌。在一些特殊培養(yǎng)液中不含酚紅哺乳細(xì)胞培養(yǎng)液：酚紅能模擬類固醇激素（尤其是雌激素）樣作用流式檢測(cè)細(xì)胞培養(yǎng)液：酚紅干擾檢測(cè)第四十八頁(yè)，共130頁(yè)。維持液與生長(zhǎng)液維持液：合成培養(yǎng)基中不加血清或加低濃度（如2％）血清，僅能維持細(xì)胞生存，細(xì)胞不能很好生長(zhǎng)。生長(zhǎng)液：合成培養(yǎng)基中加入10-20％血清，有利于細(xì)胞生長(zhǎng)。第四十九頁(yè)，共130頁(yè)。［附］RPMI-1640生長(zhǎng)液和維持液配法

維持液：RPMI-164095％小牛血清2％谷氨酸胺（100×）1％雙抗（100×）1％用NaHCO3調(diào)pH至7.0-7.2。生長(zhǎng)液：RPMI-164088％小牛血清10％谷氨酸胺（100×）1％雙抗（100×）1％用NaHCO3調(diào)pH至7.0-7.2。第五十頁(yè)，共130頁(yè)。其它培養(yǎng)用液平衡鹽溶液消化液pH調(diào)整液抗生素液谷氨酰胺補(bǔ)充液第五十一頁(yè)，共130頁(yè)。幾種常用的平衡鹽溶液的配方(g/L)第五十二頁(yè)，共130頁(yè)。胰酶(trypsin)溶液一般濃度為0.1-0.5%，配制時(shí)用平衡鹽溶液，溶解的最佳pH是8-9，充分溶解后過(guò)濾除菌，可再調(diào)整pH至7.5或不調(diào)。EDTA溶液一般濃度為0.02%，配制時(shí)加堿助溶，可過(guò)濾除菌，也可高壓滅菌。膠原酶溶液一般為0.1-0.3mg/L或20萬(wàn)U/L，最佳pH為6.5，膠原酶不受Ca2+、Mg2+及血清的抑制，配制時(shí)可用PBS。消化液第五十三頁(yè)，共130頁(yè)。常用濃度為0.25%（0.1%-0.5%）稱取所需胰蛋白酶，用少許D-Hanks液調(diào)成糊狀再補(bǔ)足D-Hanks液，攪拌混勻，置室溫4h或冰箱過(guò)夜，不斷攪拌振蕩次日，濾過(guò)除菌，分裝，-20℃凍存胰蛋白酶液配制第五十四頁(yè)，共130頁(yè)。消化液--EDTA·2Na溶液一種化學(xué)螯合劑，對(duì)細(xì)胞有一定的離散作用，而且毒性小，價(jià)格低廉，使用方便常用工作液濃度為0.02%。

注意：使用EDTA處理細(xì)胞后，要用平衡鹽液沖洗干凈，因殘留的EDTA會(huì)影響細(xì)胞生長(zhǎng)EDTA溶液配制：用D-Hanks液溶解后，高壓蒸汽滅菌，小瓶分裝，4℃保存第五十五頁(yè)，共130頁(yè)。pH調(diào)整液為了營(yíng)養(yǎng)成分穩(wěn)定和延長(zhǎng)貯存時(shí)間，在配制營(yíng)養(yǎng)液時(shí)一般不預(yù)先加入NaHCO3，而在使用前再加入。故NaHCO3都是單獨(dú)配制，高壓滅菌。此外，為了維持培養(yǎng)液恒定的pH，以利于細(xì)胞的生長(zhǎng)和增殖，還可利用Hepes強(qiáng)緩沖液。第五十六頁(yè)，共130頁(yè)。pH調(diào)整液---NaHCO3溶液常用濃度為7.5%。配制時(shí)用三蒸水溶解后，濾過(guò)除菌或高壓滅菌，分裝，4℃保存調(diào)節(jié)pH時(shí)，NaHCO3要逐滴加入，并不時(shí)搖動(dòng)培養(yǎng)液，以防止加入過(guò)量。當(dāng)pH值過(guò)高后，可用滅菌的10％醋酸溶液或通入CO2氣體調(diào)節(jié)。第五十七頁(yè)，共130頁(yè)。pH調(diào)整液---Hepes液一種弱酸，中文名為4-羥乙基哌嗪乙硫磺酸，分子式為：C8H18O4N2S，分子量為238.31。主要作用:防止培養(yǎng)基pH迅速變動(dòng)。使用終濃度一般為10-50mmol/L常配成1M儲(chǔ)存液：用100ml雙蒸水溶解23.8gHepes，濾過(guò)除菌或高壓滅菌，分裝小瓶，4℃保存。使用時(shí)可向100ml培養(yǎng)液中加入1mlHepes儲(chǔ)存液，終濃度為10mmol/L第五十八頁(yè)，共130頁(yè)。青鏈霉素溶液

俗稱雙抗溶液，青霉素對(duì)G+菌有效，使用終濃度為10萬(wàn)U/L，鏈霉素對(duì)G-菌有效，使用終濃度為0.1g/L。一般配成100倍濃縮液，可用PBS或培養(yǎng)基配制。抗生素液第五十九頁(yè)，共130頁(yè)。各種抗生素使用情況第六十頁(yè)，共130頁(yè)。

使用終濃度為2mM。一般配成100倍濃縮液，配制時(shí)加溫至30oC，充分溶解后過(guò)濾除菌，分裝后-20oC儲(chǔ)存。谷氨酰胺補(bǔ)充液第六十一頁(yè)，共130頁(yè)。（二）細(xì)胞培養(yǎng)的設(shè)備條件第六十二頁(yè)，共130頁(yè)。一定的密閉性通風(fēng)透氣良好，但不會(huì)因此造成室內(nèi)污染適合于消毒方便進(jìn)出但不會(huì)因此而影響無(wú)菌室的“無(wú)菌性”，保證工作空間的“絕對(duì)”無(wú)菌一般包括：準(zhǔn)備室、培養(yǎng)室和緩沖室無(wú)菌室的條件第六十三頁(yè)，共130頁(yè)。準(zhǔn)備室：用于進(jìn)行培養(yǎng)器皿的清洗、包裝、培養(yǎng)物質(zhì)的準(zhǔn)備和消毒以及供應(yīng)物品的保藏等。培養(yǎng)室：用于進(jìn)行細(xì)胞培養(yǎng)和各種無(wú)菌操作的實(shí)驗(yàn)室。其基本條件是：清潔、無(wú)菌、干燥、不通風(fēng)，并具有適宜的光線。緩沖室：（更衣室）第六十四頁(yè)，共130頁(yè)。緩沖室單間培養(yǎng)實(shí)驗(yàn)室布局示意圖第六十五頁(yè)，共130頁(yè)。專用培養(yǎng)實(shí)驗(yàn)室布局示意圖第六十六頁(yè)，共130頁(yè)。普通細(xì)胞培養(yǎng)室內(nèi)走廊第六十七頁(yè)，共130頁(yè)。寬敞的細(xì)胞培養(yǎng)區(qū)第六十八頁(yè)，共130頁(yè)。第六十九頁(yè)，共130頁(yè)。第七十頁(yè)，共130頁(yè)。超凈工作臺(tái)，CO2培養(yǎng)箱，倒置顯微鏡干燥箱，濾器，自動(dòng)雙重純水蒸餾器，純水儀，壓力蒸汽消毒器離心機(jī)及天平冰箱，細(xì)胞冷凍存儲(chǔ)器(液氮容器或低溫冰箱)常用培養(yǎng)器皿：培養(yǎng)瓶，培養(yǎng)皿，多孔培養(yǎng)板，吸管，加樣器其它用品：離心管，凍存管，酸缸，細(xì)胞計(jì)數(shù)板/儀，燒杯，注射器，量筒等無(wú)菌室內(nèi)的設(shè)備第七十一頁(yè)，共130頁(yè)。培養(yǎng)設(shè)備

第七十二頁(yè)，共130頁(yè)。常用培養(yǎng)器皿玻璃培養(yǎng)器皿為主，一次性培養(yǎng)器皿為輔。玻璃器皿

玻璃瓶、培養(yǎng)瓶、培養(yǎng)皿、移液管和吸管、離心管、其它塑料器皿培養(yǎng)瓶、培養(yǎng)皿、多孔培養(yǎng)板、移液管、離心管、注射器、其它第七十三頁(yè)，共130頁(yè)。超凈工作臺(tái)(cleanbench)利用鼓風(fēng)機(jī)驅(qū)動(dòng)空氣通過(guò)高效濾器除去空氣中的塵埃顆粒，使空氣得到凈化。凈化空氣以微流方式徐徐通過(guò)工作臺(tái)面，使工作臺(tái)內(nèi)構(gòu)成無(wú)菌環(huán)境。注意檢查是否堵塞?。淳凭珶簦┩饬魇剑ɑ静挥茫﹤?cè)流式直流式第七十四頁(yè)，共130頁(yè)。

超凈工作臺(tái)結(jié)構(gòu)和模式圖第七十五頁(yè)，共130頁(yè)。生物安全柜第七十六頁(yè)，共130頁(yè)。CO2培養(yǎng)箱CO2培養(yǎng)箱設(shè)定的條件為37℃，5％CO2，85%濕度。使用CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng)細(xì)胞時(shí)應(yīng)注意的問(wèn)題：用螺旋口瓶培養(yǎng)細(xì)胞時(shí)，需將瓶蓋微松，以保證通氣。保持培養(yǎng)箱內(nèi)空氣干凈，定期消毒（紫外線、酒精）。箱內(nèi)水槽中加滅菌蒸餾水3L以保持箱內(nèi)濕度，避免培養(yǎng)液蒸發(fā)。第七十七頁(yè)，共130頁(yè)。學(xué)生正在進(jìn)行細(xì)胞觀察倒置顯微鏡

倒置顯微鏡第七十八頁(yè)，共130頁(yè)。第七十九頁(yè)，共130頁(yè)。用于烘干和干熱消毒玻璃器皿（160℃，2h）。電熱干燥箱第八十頁(yè)，共130頁(yè)。濾器Zeiss濾器：過(guò)濾除菌，大多數(shù)培養(yǎng)用液，如人工合成培養(yǎng)基、血清、酶液等均采用濾過(guò)法除菌第八十一頁(yè)，共130頁(yè)。自動(dòng)雙重純水蒸餾器純水儀第八十二頁(yè)，共130頁(yè)。紫外燈紫外線消毒。主要用于培養(yǎng)室空氣、操作臺(tái)、塑料培養(yǎng)皿和培養(yǎng)板等表面消毒第八十三頁(yè)，共130頁(yè)。大容量高壓蒸汽滅菌器全自動(dòng)手提式滅菌器第八十四頁(yè)，共130頁(yè)。移液器第八十五頁(yè)，共130頁(yè)。含有兩個(gè)室，每個(gè)室被劃分為9個(gè)方陣，其中4個(gè)方陣有16個(gè)小方格，為0.1mm3或1×10-4ml，細(xì)胞濃度取決于已知體積中的細(xì)胞數(shù)。細(xì)胞計(jì)數(shù)板第八十六頁(yè)，共130頁(yè)。精密pH計(jì)微孔板震蕩器第八十七頁(yè)，共130頁(yè)。磁力攪拌器第八十八頁(yè)，共130頁(yè)。高速離心機(jī)超速離心機(jī)第八十九頁(yè)，共130頁(yè)。液氮罐第九十頁(yè)，共130頁(yè)。四、細(xì)胞培養(yǎng)物的污染及防止凡混入培養(yǎng)環(huán)境中對(duì)細(xì)胞生存有害的成分和造成細(xì)胞不純的異物，都應(yīng)視為污染。第九十一頁(yè)，共130頁(yè)。污染對(duì)細(xì)胞的影響

根據(jù)污染物和污染程度的不同，對(duì)細(xì)胞的影響不同在細(xì)胞受有害物污染時(shí)間短、污染程度輕、并能及時(shí)排除污染物的情況下，細(xì)胞有可能恢復(fù)。當(dāng)污染物持續(xù)存在于培養(yǎng)環(huán)境中時(shí)，輕者細(xì)胞增殖生長(zhǎng)緩慢、分裂相減少、細(xì)胞變得粗糙、細(xì)胞輪廓增強(qiáng)，重者細(xì)胞停止增殖，分裂相消失，細(xì)胞質(zhì)中出現(xiàn)大量堆積物，細(xì)胞變圓或崩潰從瓶壁脫落。

第九十二頁(yè)，共130頁(yè)。無(wú)毒：無(wú)毒是培養(yǎng)細(xì)胞的必需條件。凡與細(xì)胞直接或間接接觸的東西都必須是無(wú)毒的。無(wú)污染不同細(xì)胞類型的交叉污染微生物的污染細(xì)菌霉菌支原體等空氣/器材/操作/血清/組織樣本污染途徑第九十三頁(yè)，共130頁(yè)。污染來(lái)源不潔的動(dòng)物組織標(biāo)本很多動(dòng)物組織本該是無(wú)菌的，但取材時(shí)不小心也會(huì)有污染的機(jī)會(huì)。組織本身含有細(xì)菌，如取材時(shí)不用濃的抗生素洗液洗滌浸泡，也會(huì)帶菌，造成細(xì)胞污染。空氣如果操作室與外界隔離不嚴(yán)或消毒不充分，很容易造成污染。另外，凈化工作臺(tái)使用過(guò)久，濾板未定期更換或長(zhǎng)久不更換，濾網(wǎng)受塵埃堵塞，工作時(shí)不帶口罩或外界氣流過(guò)強(qiáng)，污染空氣進(jìn)入操作區(qū)，也會(huì)導(dǎo)致污染。春夏季南方地區(qū)多雨，空氣濕度大，含菌量多，工作不注意也易污染。第九十四頁(yè)，共130頁(yè)。污染來(lái)源清洗消毒培養(yǎng)用物品、材料洗刷不凈，滅菌不徹底也會(huì)引入微生物和有毒物質(zhì)。操作--來(lái)自操作者的污染主要有以下幾方面：器材和溶液使用前未仔細(xì)檢查是否污染過(guò)，或者是否已經(jīng)消毒滅菌處理過(guò)，或者雖經(jīng)處理，時(shí)隔已久又末重新處理操作者未戴口罩、帽子，呼氣中排出細(xì)菌和支原體。培養(yǎng)瓶口未用75%酒精擦和燒灼操作者不當(dāng)心，動(dòng)作不正確而將吸管或無(wú)菌器具碰到了污染的物品，如手上皮膚和瓶子外壁等操作者操作時(shí)大聲說(shuō)話，來(lái)回走動(dòng)揚(yáng)起灰塵等第九十五頁(yè)，共130頁(yè)。污染的類型--細(xì)菌污染細(xì)菌污染是實(shí)驗(yàn)室細(xì)胞培養(yǎng)中常見(jiàn)的污染，即使在細(xì)胞培養(yǎng)液中加入了抗菌素(一般為預(yù)防劑量)，也可能因?yàn)椴僮鞑簧鞫鹞廴?。最常?jiàn)的有G+菌，其中又以白色葡萄球菌較常見(jiàn)，其次枯草桿菌，大腸桿菌、假單胞菌等G-菌。受細(xì)菌污染后，培養(yǎng)液會(huì)出現(xiàn)變混濁，pH改變。也有的培養(yǎng)液肉眼觀察無(wú)多少改變，只能在鏡下發(fā)現(xiàn)菌體才知污染。所以，每天應(yīng)仔細(xì)觀察。污染后細(xì)胞發(fā)生病理改變，胞內(nèi)顆粒增多、增粗，最后變圓脫落死亡，造成試驗(yàn)失敗和細(xì)胞株(系)丟失。第九十六頁(yè)，共130頁(yè)。污染的類型--真菌污染真菌污染是細(xì)胞培養(yǎng)過(guò)程中最常見(jiàn)的一種，尤其在霉雨季節(jié)進(jìn)行細(xì)胞培養(yǎng)更易污染。最常見(jiàn)的真菌有煙曲霉、黑曲菌、孔子霉、毛霉菌、白色念珠菌和酵母菌。培養(yǎng)細(xì)胞受真菌污染后，可見(jiàn)培養(yǎng)液中漂浮著白色或淺黃色的小點(diǎn)，有的散在生長(zhǎng)，培養(yǎng)液一般不發(fā)生混濁；倒置顯微鏡下可見(jiàn)絲狀、管狀或樹(shù)枝狀的菌絲縱橫交錯(cuò)在細(xì)胞之間或培養(yǎng)基中，有的呈鏈狀排列。念珠菌和酵母菌呈卵圓形散在細(xì)胞周邊和細(xì)胞之間。個(gè)體細(xì)小，有增多趨勢(shì)。鏡下看時(shí)，要將培養(yǎng)瓶用酒精棉球擦干凈，以防止與瓶外尤其瓶底外面生長(zhǎng)的菌絲相混淆。真菌污染后，細(xì)胞生長(zhǎng)變慢，但最后由于營(yíng)養(yǎng)耗盡及毒性作用而使細(xì)胞脫落死亡。第九十七頁(yè)，共130頁(yè)。污染的類型--病毒污染用組織細(xì)胞培養(yǎng)法生產(chǎn)疫苗，如沒(méi)有除去潛在病毒的組織培養(yǎng)物，會(huì)產(chǎn)生病毒污染。目前，從原代猴腎細(xì)胞的培養(yǎng)中已發(fā)現(xiàn)不少于20種血清性病毒。盡管病毒污染的細(xì)胞不影響原代培養(yǎng)，但生產(chǎn)疫苗是不安全的。若二倍體細(xì)胞系有SV40或多發(fā)瘤病毒，B淋巴細(xì)胞含EB病毒，細(xì)胞會(huì)發(fā)生變異、轉(zhuǎn)化，形成異倍體細(xì)胞系。潛在病毒是細(xì)胞大量生產(chǎn)疫苗、干擾素等生物制品中的難題。第九十八頁(yè)，共130頁(yè)。污染的類型--支原體污染培養(yǎng)細(xì)胞受支原體污染后，部分敏感細(xì)胞可見(jiàn)細(xì)胞生長(zhǎng)增殖變慢，部分細(xì)胞變圓，從瓶壁脫落。但多數(shù)細(xì)胞污染后無(wú)明顯變化，或略有變化，若不及時(shí)處理，還會(huì)產(chǎn)生交叉污染。污染的類型--非同種細(xì)胞污染由于細(xì)胞培養(yǎng)操作時(shí)各細(xì)胞株所需的器材和溶液沒(méi)有嚴(yán)格分開(kāi)，操作不當(dāng)，往往會(huì)使一種細(xì)胞被另一種細(xì)胞污染。第九十九頁(yè)，共130頁(yè)。真菌感染支原體污染

電鏡照片

細(xì)菌污染第一百頁(yè)，共130頁(yè)。熒光染色法(33258)顯示染色體，細(xì)胞周?chē)咙c(diǎn)為支原體第一百零一頁(yè)，共130頁(yè)。Giemsa染色法，附于胞質(zhì)上黑點(diǎn)為支原體第一百零二頁(yè)，共130頁(yè)。掃描電鏡法顯示支原體，附于細(xì)胞表面眾多的圓形顆粒為支原體第一百零三頁(yè)，共130頁(yè)。污染的鑒別--細(xì)菌、真菌污染的檢測(cè)肉眼觀察細(xì)菌、真菌污染常在傳代、換液、加樣等開(kāi)放性操作之后發(fā)生，而且增生迅速，若有污染，在48小時(shí)內(nèi)可明顯觀察到。如培養(yǎng)液變混濁，或略加振蕩有很多漂浮物漂起。鏡下觀察在倒置顯微鏡的高倍鏡下可見(jiàn)培養(yǎng)液中有大量圓球狀顆粒漂浮，即為細(xì)菌污染。若細(xì)胞之間有絲狀、管狀、樹(shù)枝狀或卵形的物質(zhì)常為真菌污染。接種觀察采用普通肉湯接種或用未加雙抗藥物的培養(yǎng)液接種，也可發(fā)現(xiàn)是否有污染。第一百零四頁(yè)，共130頁(yè)。污染的鑒別--支原體污染的檢測(cè)相差顯微鏡觀察將細(xì)胞接種于事先放置于培養(yǎng)瓶?jī)?nèi)的支持物(一般用長(zhǎng)形蓋玻片)，24小時(shí)后取出支持物，用相差油鏡觀察；若不用支持物培養(yǎng)法，直接取少許培養(yǎng)液滴在載物片上，再蓋上蓋片觀察亦可。支原體在鏡下呈暗色微小顆粒，多位于細(xì)胞與細(xì)胞之間。第一百零五頁(yè)，共130頁(yè)。污染的鑒別--支原體污染的檢測(cè)熒光染色法觀察熒光染料Hoechst33258能與DNA特異地結(jié)合，可使支原體內(nèi)的DNA著色，熒光顯微鏡觀察。染色方法：將細(xì)胞接種在蓋片上，在細(xì)胞匯合前取出玻片，用不含酚紅的Hanks液漂洗，1:3醋酸甲醇固定10min，再用生理鹽水漂洗后置于50g/mL的Hoechst33258(生理鹽水配制)中染色10min，蒸餾水漂洗1-2min，向細(xì)胞面滴加數(shù)滴pH5.5磷酸緩沖液，然后置熒光顯微鏡下觀察。熒光顯微鏡下支原體呈綠色小點(diǎn)，散在于細(xì)胞周?chē)蚋接诩?xì)胞表面。第一百零六頁(yè)，共130頁(yè)。污染的鑒別--支原體污染的檢測(cè)電鏡檢測(cè)用掃描電鏡或透射電鏡觀察。一般在細(xì)胞培養(yǎng)48-72h，細(xì)胞接近匯合前，用胰酶消化細(xì)胞制成細(xì)胞懸液后進(jìn)行。需經(jīng)過(guò)固定、包埋、切片后才能進(jìn)行觀察。培養(yǎng)檢測(cè)將2.5×109/L細(xì)胞懸液5mL加入45mL支原體肉湯培養(yǎng)基，培養(yǎng)14d后觀察肉湯培養(yǎng)有無(wú)霧狀沉淀，然后取0.5ml加入已冷卻到50℃的培養(yǎng)基中，再用瓊脂培養(yǎng)基做分離培養(yǎng)，37℃培養(yǎng)3d觀察有無(wú)“荷包蛋”菌落出現(xiàn)。第一百零七頁(yè)，共130頁(yè)。污染的清除培養(yǎng)細(xì)胞一經(jīng)污染，多數(shù)較難處理。污染細(xì)胞價(jià)值不大，宜棄之；有細(xì)胞株留存的或可購(gòu)置的，可在尋找原因后徹底消毒操作室，復(fù)蘇或重新購(gòu)置細(xì)胞，再培養(yǎng)。若污染細(xì)胞價(jià)值較大，又難于重新得到，可采取以下辦法清除。使用抗生素加溫處理使用支原體特異性血清其他方法動(dòng)物體內(nèi)接種除菌法、巨噬細(xì)胞吞噬法、污染培養(yǎng)瓶中加溴尿嘧啶再用光照射的方法及過(guò)濾法等，但均較麻煩，且效果不確定。所以一旦支原體污染，除非有特別重要價(jià)值，一般均棄之重新培養(yǎng)。第一百零八頁(yè)，共130頁(yè)。污染的清除--使用抗生素抗生素對(duì)殺滅細(xì)菌較有效。聯(lián)合用藥比單獨(dú)用藥效果好。預(yù)防用藥比污染后再用藥效果好。預(yù)防用藥一般用雙抗生素(青霉素100u/mL加鏈霉素100g/mL)污染后清除用藥需采用大于常用量5-10倍的沖洗法，于加藥后作用24-48h，再換常規(guī)培養(yǎng)液。此法在污染早期可能有效。所用抗生素品種除青霉素、鏈霉素外，還可用慶大霉素、卡那霉素、多粘菌素、四環(huán)素、制霉菌素等。第一百零九頁(yè)，共130頁(yè)。巨噬細(xì)胞在體外培養(yǎng)條件下仍然可吞噬微生物并將其消化。利用96孔培養(yǎng)板將極少量的培養(yǎng)細(xì)胞與巨噬細(xì)胞共培養(yǎng)，可以在高度稀釋培養(yǎng)細(xì)胞、極大地降低微生物污染程度的同時(shí)，更有效地發(fā)揮巨噬細(xì)胞清除污染的效能。本方法與抗生素聯(lián)合應(yīng)用效果更佳。污染的清除--與巨噬細(xì)胞共培養(yǎng)第一百一十頁(yè)，共130頁(yè)。污染的清除---加溫處理將污染的組織培養(yǎng)物在41℃培養(yǎng)18h，可殺死支原體，但對(duì)細(xì)胞有不良影響。所以在處理前要進(jìn)行預(yù)試驗(yàn)，確定能最大限度殺死支原體又對(duì)細(xì)胞影響最小的加熱時(shí)間。此法有時(shí)不可靠。若先用藥物處理后，再以41℃加溫處理效果更佳污染的清除---使用支原體特異性血清用5%的兔支原體抗血清(血凝效價(jià)1:320以上)可去除支原體污染，因特異抗體可抑制支原體生長(zhǎng)，故經(jīng)抗血清處理后11天即轉(zhuǎn)為陰性，并且5個(gè)月后仍為陰性。此法比較麻煩，不如用抗生素方便、經(jīng)濟(jì)。第一百一十一頁(yè)，共130頁(yè)。污染的預(yù)防預(yù)防是防止細(xì)胞培養(yǎng)過(guò)程中發(fā)生污染的最好辦法。只有預(yù)防工作做在前，才能將發(fā)生污染的可能性降到最小程度一般預(yù)防可從以下幾方面著手：從物品、用品消毒滅菌著手從操作者做起防止細(xì)胞交叉污染重在預(yù)防，排除困難！第一百一十二頁(yè)，共130頁(yè)。污染的預(yù)防--從操作者做起操作者責(zé)任心要強(qiáng)，要細(xì)心穩(wěn)重，操作技術(shù)要熟練。進(jìn)無(wú)菌室前要用肥皂洗手或用5%新潔爾滅浸泡5min，按規(guī)定穿隔離衣。進(jìn)入后關(guān)好門(mén)，坐下來(lái)盡量少走動(dòng)。實(shí)驗(yàn)進(jìn)行前，無(wú)菌室及無(wú)菌操作臺(tái)以紫外燈照射0.5-1h滅菌，以70%乙醇擦拭無(wú)菌操作臺(tái)面，開(kāi)啟無(wú)菌操作臺(tái)風(fēng)扇約運(yùn)轉(zhuǎn)10min。事先要嚴(yán)格檢查器材、溶液和培養(yǎng)物，不要把污染品或未經(jīng)消毒的物品帶入無(wú)菌室內(nèi)，更不能隨便使用，以免造成大批污染。先用75%酒精棉球擦手、擦瓶口和燒灼瓶口。操作者動(dòng)作要輕，必須在火焰周?chē)鸁o(wú)菌區(qū)內(nèi)打開(kāi)瓶口，并將瓶口轉(zhuǎn)動(dòng)燒灼。操作時(shí)盡量不要談話，若打噴嚏或咳嗽應(yīng)轉(zhuǎn)向背面。實(shí)驗(yàn)完畢及時(shí)收拾，保持實(shí)驗(yàn)室清潔整齊，最后用消毒水浸泡的紗布擦臺(tái)面。第一百一十三頁(yè)，共130頁(yè)。污染的預(yù)防--防止接觸細(xì)胞物品污染無(wú)菌操作工作區(qū)域應(yīng)保持清潔及寬敞，必要物品（試管架、吸管或吸管盒等）可以暫時(shí)放置，其它實(shí)驗(yàn)用品用完即應(yīng)移出，以利于氣流之流通。實(shí)驗(yàn)用品以70%乙醇擦拭后帶入無(wú)菌操作臺(tái)內(nèi)。小心取用無(wú)菌之實(shí)驗(yàn)物品，避免造成污染。勿碰觸吸管尖頭部或是容器瓶口，亦不要在打開(kāi)之容器正上方操作實(shí)驗(yàn)，實(shí)驗(yàn)操作都應(yīng)該在酒精燈的周?chē)M(jìn)行。容器打開(kāi)后，以手夾住瓶蓋并握住瓶身，傾斜約45°取用，盡量勿將瓶蓋蓋口朝上放置桌面。操作時(shí)要常更換吸管，切勿一根吸管做到底。一旦發(fā)現(xiàn)吸管口接觸了手和其他污染物品應(yīng)棄去。第一百一十四頁(yè)，共130頁(yè)。污染的預(yù)防--防止細(xì)胞交叉污染在進(jìn)行多種細(xì)胞培養(yǎng)操作時(shí)，所用器具要嚴(yán)格區(qū)分，最好做上標(biāo)記便于辨別。并按順序進(jìn)行操作，避免一起進(jìn)行時(shí)易發(fā)生混亂。所有細(xì)胞一旦購(gòu)置，或從別處引入，或自己建立，均應(yīng)及早留種凍存，一旦發(fā)生污染可棄之復(fù)蘇，重新培養(yǎng)。每次操作只處理一株細(xì)胞株，即使培養(yǎng)基相同亦不共享培養(yǎng)基，以避免失誤混淆或細(xì)胞間污染。實(shí)驗(yàn)完畢后，將實(shí)驗(yàn)物品帶出工作臺(tái)，以70%乙醇擦拭無(wú)菌操作臺(tái)面。操作間隔應(yīng)讓無(wú)菌操作臺(tái)運(yùn)轉(zhuǎn)10min以上，再進(jìn)行下一個(gè)細(xì)胞株之操作。第一百一十五頁(yè)，共130頁(yè)。根據(jù)建筑材料的差異選擇合理的消毒方法。每日（使用前）紫外照射(1-2h)，每周甲醛、乳酸或氧乙酸熏蒸（2h）和每月新潔爾滅擦拭地面和墻壁一次。防止無(wú)菌室的污染。3.1無(wú)菌室造成污染的可能原因：送入無(wú)菌室的風(fēng)沒(méi)有被過(guò)濾除菌進(jìn)入無(wú)菌室時(shí)使外界空氣直接對(duì)流進(jìn)無(wú)菌室的操作間在操作間開(kāi)啟被污染的培養(yǎng)器皿或?qū)⑽廴疽后w、器物灑落在操作間無(wú)菌室有未被消毒的死角等。第一百一十六頁(yè)，共130頁(yè)。側(cè)流式、直流式：在凈化氣流與外界氣流的界面處無(wú)菌程度較低；外流式：氣流直接流向操作者。3.2超凈臺(tái)超凈臺(tái)的使用和保養(yǎng)：安裝在無(wú)菌室內(nèi)；臺(tái)面內(nèi)風(fēng)速不宜過(guò)大或過(guò)?。皇褂们伴_(kāi)啟紫外燈照射15min左右，然后讓超凈臺(tái)預(yù)工作10-15min；使用完畢，用70%酒精擦拭臺(tái)面和臺(tái)內(nèi)四周；定期用福爾馬林熏蒸超凈臺(tái)。第一百一十七頁(yè)，共130頁(yè)。3.3培養(yǎng)用品的清洗在組織細(xì)胞培養(yǎng)中，體外細(xì)胞對(duì)任何有害物質(zhì)都非常敏感,均能影響培養(yǎng)細(xì)胞的生長(zhǎng)。微生物產(chǎn)品附帶雜物上次細(xì)胞殘留物非營(yíng)養(yǎng)成分的化學(xué)物質(zhì)需要清洗的培養(yǎng)用品玻璃器皿的清洗膠塞的清洗塑料制品的清洗第一百一十八頁(yè)，共130頁(yè)。1）玻璃器皿的清洗浸泡：清水浸泡，軟化和溶解附著物。新器皿用自來(lái)水簡(jiǎn)單刷洗，然后5%鹽酸浸泡過(guò)夜；用過(guò)的器皿在用后應(yīng)立即浸入清水中；刷洗：將浸泡后的器皿放入洗滌劑（不能用含砂粒的洗衣粉）水中，用軟毛刷反復(fù)刷洗，然后洗凈洗滌劑，晾干。浸酸：將晾干的器皿浸泡到酸液中不少于6h，應(yīng)充滿并完全覆蓋；取出時(shí)應(yīng)瀝干并將器皿放入合適容器運(yùn)輸。清洗：手工清洗浸酸后的每件器皿都至少重復(fù)“灌滿-倒空”15次以上，然后用蒸餾水浸洗2-3次，烘干后包裝。第一