藥品微生物限度與無(wú)菌檢查

風(fēng)險(xiǎn)管理風(fēng)險(xiǎn)調(diào)查/評(píng)估微生物實(shí)驗(yàn)室技術(shù)能力藥品微生物控制風(fēng)險(xiǎn)管理、風(fēng)險(xiǎn)調(diào)查/評(píng)估第一頁(yè)，共87頁(yè)。藥品微生物檢驗(yàn)的過(guò)程控制環(huán)境保證培養(yǎng)基保證無(wú)菌性檢查靈敏度檢查有效的方法方法驗(yàn)證SOP操作有效的結(jié)果可靠的結(jié)論結(jié)果判斷過(guò)程控制第二頁(yè)，共87頁(yè)。LuzhouInstitutesforFoodandDrugControlUSP35部分章節(jié)《中國(guó)藥典》2015年版<51>AntimicrobialEffectivenessTesting抑菌效力檢查法<55>BiologicalIndicators-ResistancePerformanceTests生物指示劑抗性檢查法<61>MicrobiologicalExaminationofNonsterileProducts:MicrobialEnumerationTests非無(wú)菌產(chǎn)品微生物檢查：微生物計(jì)數(shù)法<62>MicrobiologicalExaminationofNonsterileProducts:TestsforSpecifiedMicroorganisms非無(wú)菌產(chǎn)品微生物檢查：控制菌檢查法<1111>MicrobiologicalAttributesofNonsterilePharmaceuticalProduct非無(wú)菌藥品微生物限度標(biāo)準(zhǔn)<63>MycoplasmaTests支原體檢查法<71>SterilityTests無(wú)菌檢查法<1035>BiologicalIndicatorsforSterilization滅菌用生物指示劑指導(dǎo)原則<1112>AplicationofWaterActivityDeterminationtoNonsterilePharmaceuticalProducts水活度檢查法用于非無(wú)菌藥品微生物評(píng)價(jià)<1113>MicrobialCharacterization,Identification,andStrainTyping微生物鑒定指導(dǎo)原則<1116>MicrobiologicalEvalutionofCleanRoomsandOtherControlledEnvironments藥品潔凈實(shí)驗(yàn)室微生物監(jiān)測(cè)和控制指導(dǎo)原則<1117>MicrobiologicalBestLaboratoryPractices藥品微生物實(shí)驗(yàn)室質(zhì)量管理指導(dǎo)原則<1208>SterilityTesting-ValidationofIsolatorSystems無(wú)菌檢查用隔離器系統(tǒng)驗(yàn)證指導(dǎo)原則<1211>SterilizationandSterilityAssuranceofCompendialArticles滅菌法<1223>ValidationofAlternativeMicrobiologicalMethods藥品微生物檢驗(yàn)替代方法驗(yàn)證指導(dǎo)原則/非無(wú)菌藥品微生物限度檢測(cè)指導(dǎo)原則/（日本藥典收載）中藥飲片微生物限度檢查法？第三頁(yè)，共87頁(yè)。藥品微生物檢驗(yàn)的過(guò)程控制環(huán)境保證培養(yǎng)基保證無(wú)菌性檢查靈敏度檢查有效的方法方法驗(yàn)證SOP操作有效的結(jié)果可靠的結(jié)論結(jié)果判斷無(wú)菌檢查用隔離系統(tǒng)驗(yàn)證指導(dǎo)原則藥品微生物實(shí)驗(yàn)室質(zhì)量管理指導(dǎo)原則藥品潔凈實(shí)驗(yàn)室微生物檢測(cè)和控制指導(dǎo)原則微生物鑒定指導(dǎo)原則藥品微生物檢驗(yàn)替代方法驗(yàn)證指導(dǎo)原則對(duì)照培養(yǎng)基第四頁(yè)，共87頁(yè)。al

Institutes

forFood

andDrug

Control案例陽(yáng)性結(jié)果與玻璃安瓿表面采樣菌高度相似Nation第五頁(yè)，共87頁(yè)。LuzhouInstitutesforFoodandDr無(wú)菌檢查過(guò)程微生物控制

空氣微生物浮游菌沉降菌

表面微生物樣品包裝表面操作人員手部第六頁(yè)，共87頁(yè)。④易折方式影響折斷力色環(huán)：通過(guò)在瓶頸噴涂與玻璃膨脹系數(shù)不同的色釉產(chǎn)生應(yīng)力，從而使斷面平整⑤灌裝工藝落后造成折斷力差為防止灌裝中安瓿斷頭安瓿折斷后，斷面應(yīng)平整。LuzhouInstitutesforFoodandDrugControl國(guó)家藥用包裝容器（材料）標(biāo)準(zhǔn)YBB00332002點(diǎn)刻痕易折玻璃安瓿點(diǎn)刻痕易折安瓿的色點(diǎn)應(yīng)標(biāo)記在刻痕的上方中心與中心線的偏差不得過(guò)±1.0mm①刻痕工藝控制不好深淺、長(zhǎng)短、高低位置不一色點(diǎn)和刻痕位置偏離②規(guī)格尺寸不規(guī)范瓶身外徑精度不夠刻痕不易控制瓶頸壁厚不均勻折斷后斷面不平整③玻璃材質(zhì)不佳低硼硅玻璃：48.6%中性硼硅玻璃：7.7%我國(guó)90%以上低硼硅玻璃第七頁(yè)，共87頁(yè)。玻璃安瓿表面消毒方案比較? 殺孢子劑（過(guò)氧乙酸）噴灑后立即（3min、5min、10min）用75%乙醇鈍化，再用濕棉簽擦拭取樣? 酒精燈過(guò)火1秒鐘（3秒鐘、5秒鐘、10秒鐘）后直接用濕棉簽擦拭取樣表面消毒方案作用時(shí)間殘留菌落數(shù)菌屬類(lèi)型殺孢子劑立即2cfuBacillus3min0cfu/5min0cfu/10min0cfu/棉簽擦拭&過(guò)火1秒鐘4cfuBacillus、Brevibacillus3秒鐘10cfuBacillus、Paenibacillus、Brevibacillus5秒鐘0cfu/10秒鐘0cfu/第八頁(yè)，共87頁(yè)。微生物檢驗(yàn)的過(guò)程控制環(huán)境保證培養(yǎng)基保證無(wú)菌性檢查靈敏度檢查有效的方法方法驗(yàn)證SOP操作有效的結(jié)果可靠的結(jié)論結(jié)果判斷過(guò)程控制第九頁(yè)，共87頁(yè)。微生物實(shí)驗(yàn)室工作流程第十頁(yè)，共87頁(yè)。環(huán)境保障WHOGPML各區(qū)域等級(jí)第十一頁(yè)，共87頁(yè)。微生物限度&無(wú)菌檢查環(huán)境要求無(wú)菌檢查：環(huán)境潔凈度B級(jí)背景下的局部A級(jí)潔凈度的單向流空氣區(qū)域內(nèi)或隔離系統(tǒng)中B+A or 隔離系統(tǒng)《中國(guó)藥典2010版》萬(wàn)級(jí)下的百級(jí)《中國(guó)藥典2015版》藥品潔凈實(shí)驗(yàn)室微生物監(jiān)測(cè)和控制指導(dǎo)原則無(wú)菌檢查用隔離系統(tǒng)驗(yàn)證指導(dǎo)原則92059206微生物限度檢查：受控潔凈環(huán)境下的局部潔凈度不低于B級(jí)的單向流空氣區(qū)域內(nèi)D+BSCⅡ生物安全柜第十二頁(yè)，共87頁(yè)。潔凈室/臺(tái)工作原理層流Laminarflow混流Conventional(mixedflow)cleanroom第十三頁(yè)，共87頁(yè)。LuzhouInstitutesforFoodandDrugControl相關(guān)潔凈標(biāo)準(zhǔn)比較ISO14644討論了潔凈室和受控環(huán)境的設(shè)計(jì)與建設(shè)按ISO14644的分類(lèi)是建立在環(huán)境中每單位體積的總體粒子數(shù)的基礎(chǔ)上分類(lèi)不區(qū)分非生物粒子或生物粒子第十四頁(yè)，共87頁(yè)。相關(guān)潔凈標(biāo)準(zhǔn)比較2010版GMP潔凈度級(jí)別標(biāo)準(zhǔn)“靜態(tài)”百級(jí)，“動(dòng)態(tài)”萬(wàn)級(jí)第十五頁(yè)，共87頁(yè)。相關(guān)潔凈標(biāo)準(zhǔn)比較2015版建議的潔凈實(shí)驗(yàn)室環(huán)境監(jiān)測(cè)頻次及項(xiàng)目按ISO14644的定級(jí)是建立在環(huán)境中每單位體積的總體粒子數(shù)的基礎(chǔ)上定級(jí)不區(qū)分非生物粒子或生物粒子受控區(qū)域潔凈級(jí)別采樣頻次檢測(cè)項(xiàng)目粒子相鄰?fù)獠棵堪肽炅Ｗ?、浮游菌、沉降菌、表面菌粒子B級(jí)每周粒子、浮游菌、沉降菌、表面菌粒子D級(jí)每半年粒子、浮游菌、沉降菌、表面菌第十六頁(yè)，共87頁(yè)。LuzhouInstitutesforFoodandDrugC“B級(jí)”與“C級(jí)”的異同ontrol第十七頁(yè)，共87頁(yè)。懸浮粒子與環(huán)境微生物非生物粒子數(shù)量和活的微生物濃度之間的關(guān)系在科學(xué)上未達(dá)成絕對(duì)的一致當(dāng)操作人員是粒子的來(lái)源時(shí)，以下的結(jié)論是成立的，即潔凈室中的粒子越少，空氣中微生物存在的可能性就越小。實(shí)驗(yàn)設(shè)備運(yùn)行時(shí)大量產(chǎn)生的粒子污染和人員產(chǎn)生的粒子污染之間是無(wú)法明確區(qū)分的大量的藥物除了微生物以外還有粒子限度的要求幾乎肯定的是，部分懸浮粒子與微生物有關(guān)因此，潔凈室監(jiān)測(cè)應(yīng)包括微生物與粒子數(shù)兩方面第十八頁(yè)，共87頁(yè)。潔凈室使用次數(shù)與浮游菌數(shù)關(guān)系416#浮游菌數(shù)201月 2月 3月 4月 5月 6月 7月 8月 9月 10月11月12月681016141213#使用次數(shù)13#浮游菌數(shù)16#使用次數(shù)第十九頁(yè)，共87頁(yè)。近8年無(wú)菌室C級(jí)浮游菌高限圖9080706050403020100200720082009201020112012201320147月8月9月硬件差異軟件差異第二十頁(yè)，共87頁(yè)。潔凈區(qū)微生物監(jiān)測(cè)水平USP35＜15cfu信息性，非標(biāo)準(zhǔn)性第二十一頁(yè)，共87頁(yè)。監(jiān)控基于風(fēng)險(xiǎn)評(píng)估120100806040200法規(guī)標(biāo)準(zhǔn)OOT行動(dòng)限OOE警戒限常規(guī)波動(dòng)WHOgood

practices

for

pharmaceutical

microbiology

laboratoriesAppendix

4Examples

ofequipment

qualification

and

monitoring第二十二頁(yè)，共87頁(yè)。環(huán)境微生物歸屬第二十三頁(yè)，共87頁(yè)。LuzhouInstitutes

forFood

andDrug

Control欣弗事件欣弗培養(yǎng)物潔凈環(huán)境常見(jiàn)菌：頭狀葡萄球菌（Staphylococcuscapitis）溶血葡萄球菌（Staphylococcushaemolyticus）緩癥鏈球菌（Streptococcusmitis）科氏葡萄球菌（Staphylococcuscohnii）藤黃微球菌（Micrococcusluteus）山羊葡萄球菌（Staphylococcuscaprae）肺炎克雷伯巨大芽孢桿菌粘質(zhì)沙雷菌×奪命的欣弗編號(hào)鑒定結(jié)果0206L1、肺炎克雷伯（K.pneumoniae

）；2、粘質(zhì)沙雷菌（S.marcescens）0206G1、肺炎克雷伯（K.pneumoniae

）；2、粘質(zhì)沙雷菌（S.marcescens）298L；298G1、肺炎克雷伯（K.

pneumoniae

）；2、粘質(zhì)沙雷菌（S.marcescens）303L；303G1、肺炎克雷伯（K.pneumoniae

）；2、陰溝腸桿菌（Enter.

cloacae）305L；305G1、肺炎克雷伯（K.

pneumoniae

）；2、粘質(zhì)沙雷菌（S.marcescens）306L/6G肺炎克雷伯（K.pneumoniae

）307G肺炎克雷伯（K.pneumoniae

）308L糞產(chǎn)堿桿菌（Al.faecalis）309L糞產(chǎn)堿桿菌（Al.faecalis）304G嗜麥芽寡養(yǎng)單胞菌（S.maltophilia）第二十四頁(yè)，共87頁(yè)。不同生物安全水平對(duì)設(shè)施的要求第二十五頁(yè)，共87頁(yè)。不同保護(hù)類(lèi)型及生物安全柜的選擇I級(jí)安全柜適用于一級(jí)，二級(jí)和三級(jí)安全實(shí)驗(yàn)室，II級(jí)和III級(jí)安全柜則適用于所有級(jí)別安全實(shí)驗(yàn)室。保護(hù)類(lèi)型生物安全柜的選擇個(gè)體防護(hù)，針對(duì)生物危險(xiǎn)等級(jí)1～3級(jí)微生物Ⅰ級(jí)、Ⅱ級(jí)生物安全柜個(gè)體防護(hù)，針對(duì)生物危險(xiǎn)等級(jí)4級(jí)微生物，手套箱型實(shí)驗(yàn)室Ⅲ級(jí)生物安全柜個(gè)體防護(hù)，針對(duì)生物危險(xiǎn)等級(jí)4級(jí)微生物，防護(hù)服型實(shí)驗(yàn)室Ⅰ級(jí)、Ⅱ級(jí)生物安全柜實(shí)驗(yàn)對(duì)象保護(hù)Ⅱ級(jí)生物安全柜，柜內(nèi)氣流是層流的Ⅲ級(jí)生物安全柜少量揮發(fā)性放射性核素∕化學(xué)品的防護(hù)Ⅱ級(jí)B1型生物安全柜，外排風(fēng)式Ⅱ級(jí)A2型生物安全柜揮發(fā)性放射性核素∕化學(xué)品的防護(hù)Ⅰ級(jí)、Ⅱ級(jí)B2型、Ⅲ級(jí)生物安全柜第二十六頁(yè)，共87頁(yè)。LuzhouInstitutesforFoodandDrugControlClassI生物安全柜適用于樣品不需保護(hù)的工作1、從前窗口吸入的負(fù)壓氣流，用以保護(hù)人員的安全；2、排出的氣流經(jīng)HEPA過(guò)濾器過(guò)濾，用以保護(hù)環(huán)境，不受污染；3、對(duì)受試樣本，不能提供切實(shí)可靠的保護(hù)。第二十七頁(yè)，共87頁(yè)。無(wú)外接風(fēng)道 有外接風(fēng)道ContaminatedairundernegativepressureContaminatedairunderpositivepressureHEPA-filteredairRoomairLuzhouInstitutesforFoodandDrugControlII級(jí)A2型生物安全柜

前窗進(jìn)風(fēng)氣流平均流速≥0.50m/s

生物安全柜排風(fēng)管道接口與建筑物排風(fēng)系統(tǒng)相連接

可以從事少量的的揮發(fā)性有毒化學(xué)物質(zhì)或放射性的工作。第二十八頁(yè)，共87頁(yè)。LuzhouInstitutesforFoodandDrugControl第二十九頁(yè)，共87頁(yè)。在生物安全柜上工作干凈的物品工作臺(tái)擺放被污染的區(qū)域廢棄物托盤(pán)垃圾袋第三十頁(yè)，共87頁(yè)。無(wú)菌隔離系統(tǒng)與傳統(tǒng)潔凈技術(shù)的對(duì)比項(xiàng)目消毒/滅菌方法潔凈環(huán)境的控制對(duì)操作人員的防護(hù)物料傳送方式人員進(jìn)出運(yùn)行所需能耗誤操作導(dǎo)致的無(wú)菌環(huán)境污染的風(fēng)險(xiǎn)傳統(tǒng)潔凈技術(shù)消毒劑擦拭/熏蒸/紫外線照射等方法受空間等諸多因素影響效果難以驗(yàn)證易受人員、物料等諸多因素影響，易受污染，難以控制；取決于操作人員自身技術(shù)和熟練程度；傳統(tǒng)的傳遞窗，易導(dǎo)致無(wú)菌室環(huán)境破壞和物料的污染；需復(fù)雜的換鞋/工作服更換等步驟帶來(lái)額外工作量；高，誤操作可能性大，與操作人員有較大相關(guān)性無(wú)菌隔離器技術(shù)自動(dòng)氣體滅菌省時(shí)省力，氣體分布均勻效果較好，容易驗(yàn)證；，與外界完全隔離，僅通，過(guò)HEPA進(jìn)行空氣交換并可恒定艙內(nèi)壓力以阻絕外界污染；安全系數(shù)高雙門(mén)快速傳遞系統(tǒng)保證在無(wú)菌環(huán)境中傳遞，無(wú)菌保證程度高；僅通穿戴手套/半身工作服即可；低可能性極小第三十一頁(yè)，共87頁(yè)。Na隔離器2x3-glove

IsotestH2O2溶液被泵入蒸發(fā)器液態(tài)H2O2→氣態(tài)H2O210SAL表面殺滅效率-6tional

Institutes

forFood

andDrug

Control第三十二頁(yè)，共87頁(yè)。隔離器9206無(wú)菌檢查用隔離系統(tǒng)驗(yàn)證指導(dǎo)原則1.操作驗(yàn)證3.滅菌驗(yàn)證4.滅菌循環(huán)驗(yàn)證2.完整性驗(yàn)證5.內(nèi)部潔凈度驗(yàn)證6.儀器儀表驗(yàn)證第三十三頁(yè)，共87頁(yè)。LuzhouInstitutesforFood

andDrug

Control三種主要設(shè)備比較生物安全柜層流柜無(wú)菌隔離器人員保護(hù)☆☆☆☆☆☆環(huán)境要求☆☆☆☆☆☆樣品保護(hù)☆☆☆☆☆☆☆處理樣品靈活性☆☆☆☆☆☆操作難度☆☆☆☆☆☆運(yùn)行維護(hù)難度☆☆☆☆☆☆第三十四頁(yè)，共87頁(yè)。微生物檢驗(yàn)的過(guò)程控制環(huán)境保證培養(yǎng)基保證無(wú)菌性檢查靈敏度檢查有效的方法方法驗(yàn)證SOP操作有效的結(jié)果可靠的結(jié)論結(jié)果判斷過(guò)程控制第三十五頁(yè)，共87頁(yè)。ChP無(wú)菌檢查培養(yǎng)基與USP、BP的比較硫乙醇酸鹽流體培養(yǎng)基（FluidThioglycollateMedium）藥典USPBP中國(guó)藥典-2015名稱(chēng)FluidThioglycollateMedium硫乙醇酸鹽流體培養(yǎng)基FluidThioglycollateMedium硫乙醇酸鹽流體培養(yǎng)基FluidThioglycollateMedium硫乙醇酸鹽流體培養(yǎng)基目的培養(yǎng)需氧、厭氧和微需氧微生物（主要是厭氧菌）培養(yǎng)需氧、厭氧和微需氧微生物（主要是厭氧菌）培養(yǎng)需氧、厭氧微生物培養(yǎng)條件14天于30-35°C及20-25°C配方PancreaticDigestofCasein(胰酪蛋白胨)....................15.0gYeastExtract(酵母浸出粉)..................................5.0gDextrose(葡萄糖)............................................5.5gSodiumChloride(氯化鈉).....................................2.5gL-Cystine(L-胱氨酸).......................................0.5gSodiumThioglycollate(硫乙醇酸鈉)..........................0.5gAgar(瓊脂).................................................0.75gResazurin(刃天青).........................................1.0mg第三十六頁(yè)，共87頁(yè)。ChP無(wú)菌檢查培養(yǎng)基與USP、BP的比較大豆胰酪胨培養(yǎng)基(TSB)&改良馬丁培養(yǎng)基藥典USP36BP-2013中國(guó)藥典2010版中國(guó)藥典2015版名稱(chēng)TrypticSoyBroth(Soybeancaseindigestmedium)大豆－胰酪胨培養(yǎng)基改良馬丁培養(yǎng)基胰酪大豆胨液體培養(yǎng)基配方胰酪蛋白胨..…………….…..7.0g大豆木瓜蛋白酶消化物………………….3.0g氯化鈉…..…………….…….…5.0g磷酸氫二鉀…....2.5g一水葡萄糖……………….……2.5g蛋白胨……………..5.0g酵母浸出粉…….…2.0g葡萄糖…………....20.0g磷酸氫二鉀………..1.0g硫酸鎂(MgSO4.7H2O)….0.5g胰酪胨?????17.0g大豆木瓜蛋白酶水解物?????????3.0g氯化鈉??????5.0g磷酸氫二鉀?????2.5g葡萄糖/無(wú)水葡萄糖???????2.5g/2.3g目的支持廣泛微生物的生長(zhǎng),包括需氧菌專(zhuān)性和兼性厭氧菌、真菌（主要是需氧菌）、用于培養(yǎng)真菌支持廣泛微生物的生長(zhǎng),包括需氧菌、專(zhuān)性和兼性厭氧菌、真菌（主要是需氧菌）培養(yǎng)條件14天于30-35°C及20-25°C14天于20-25°C14天于30-35°C及20-25°C第三十七頁(yè)，共87頁(yè)。微生物實(shí)驗(yàn)室常用菌株銅綠假單胞菌(Pseudomonasaeruginosa)[CMCC(B)10104]大腸埃希菌（Escherichiacoli）[CMCC(B)44102]金黃色葡萄球菌(Staphylococcusaureus)[CMCC(B)26003]生孢梭菌(Clostridiumsporogenes)[CMCC(B)64941]枯草芽孢桿菌(Bacillussubtilis) G+芽孢桿菌[CMCC(B)63501]G-桿菌G+球菌酵母菌霉菌兼性需氧菌專(zhuān)性厭氧菌專(zhuān)性需氧菌白色念珠菌(Candidaalbicans)[CMCC(F)98001]黑曲霉(Aspergillusniger)[CMCC(F)98003]第三十八頁(yè)，共87頁(yè)。LuzhouInstitutesforFoodandDrugControl在硫乙中生長(zhǎng)差異僅在厭氧層生長(zhǎng)需氧層厭氧層均生長(zhǎng)銅綠假單胞菌(Pseudomonasaeruginosa)僅在需氧層生長(zhǎng)[CMCC(B)10104]大腸埃希菌（Escherichiacoli）[CMCC(B)44102]金黃色葡萄球菌(Staphylococcusaureus)[CMCC(B)26003]生孢梭菌(Clostridiumsporogenes)[CMCC(B)64941]枯草芽孢桿菌(Bacillussubtilis)[CMCC(B)63501]第三十九頁(yè)，共87頁(yè)。方法適用性?xún)?nèi)容修訂第四十頁(yè)，共87頁(yè)。微生物計(jì)數(shù)定義變化修訂前修訂后內(nèi)容細(xì)菌數(shù)—營(yíng)養(yǎng)瓊脂霉菌和酵母菌數(shù)—玫瑰紅鈉瓊脂（1）需氧菌總數(shù)（TAMC）。（2）霉菌和酵母菌總數(shù)（TYMC）。（3）需氧菌總數(shù)：生長(zhǎng)在胰酪大豆胨瓊脂（TSA）上所有菌落(包括霉菌和酵母菌)。（4）霉菌和酵母菌總數(shù)：一般指生長(zhǎng)在沙氏葡萄糖瓊脂（SDA）上的所有菌落(包括細(xì)菌)。如果由于細(xì)菌的生長(zhǎng)而使霉菌和酵母菌的計(jì)數(shù)結(jié)果不符合微生物限度要求，可使用含有抗生素的SDA重新計(jì)數(shù)。第四十一頁(yè)，共87頁(yè)。對(duì)照培養(yǎng)基培養(yǎng)基質(zhì)量控制：USP—之前驗(yàn)證過(guò)的中國(guó)藥典—對(duì)照培養(yǎng)基單劑量免稱(chēng)量獨(dú)立包裝專(zhuān)利號(hào)：ZL200920108836.8回收率

待測(cè)培養(yǎng)基平均菌落數(shù)（cfu）*100%對(duì)照培養(yǎng)基平均菌落數(shù)（cfu）50%~200%第四十二頁(yè)，共87頁(yè)。LuzhouInstitutesforFoodandDrugControl培養(yǎng)基適用性檢查范圍液體、固體培養(yǎng)基加菌量不大于100cfu培養(yǎng)溫度胰酪大豆胨瓊脂：30~35℃培養(yǎng)；胰酪大豆胨肉湯：30~35℃培養(yǎng)；沙氏葡萄糖瓊脂：20~25℃培養(yǎng)。培養(yǎng)時(shí)間細(xì)菌不大于72h，真菌不大于5天?？山邮軜?biāo)準(zhǔn)固體培養(yǎng)基：50％~200％（0.5~2）液體培養(yǎng)基：生長(zhǎng)良好。第四十三頁(yè)，共87頁(yè)。LuzhouInstitutesforFoodandDrugControl培養(yǎng)基適用性檢查培養(yǎng)基名稱(chēng)胰酪大豆胨肉湯（TSB）無(wú)菌性檢查取已滅菌的TSB，于30-35℃培養(yǎng)不少于3天，培養(yǎng)基應(yīng)澄清。試驗(yàn)用菌株枯草芽孢桿菌、金黃色葡萄球菌、銅綠假單胞菌接種方法分別接種各試驗(yàn)用菌懸液于該培養(yǎng)基中，接種量不大于100cfu，搖勻，培養(yǎng)。適用性檢查接種試驗(yàn)用菌株后，30-35℃培養(yǎng)不超過(guò)72小時(shí)，與對(duì)照培養(yǎng)基比較，試驗(yàn)菌應(yīng)生長(zhǎng)良好。（建議：培養(yǎng)基呈混濁的液體，或劃線于相應(yīng)的分離平板上，培養(yǎng)后呈現(xiàn)典型菌落）備注：該培養(yǎng)基同時(shí)用于稀釋液的制備和控制菌檢查時(shí)，需要考慮同時(shí)滿(mǎn)足計(jì)數(shù)和控制菌檢查培養(yǎng)基適用性檢查控制要求。第四十四頁(yè)，共87頁(yè)。LuzhouInstitutesforFoodandDrugControl培養(yǎng)基適用性檢查培養(yǎng)基名稱(chēng)胰酪大豆胨瓊脂（TSA）無(wú)菌性檢查取已滅菌TSA注皿，于30-35℃培養(yǎng)3~5天，應(yīng)無(wú)菌落生長(zhǎng)。試驗(yàn)用菌種枯草芽孢桿菌、金黃色葡萄球菌、銅綠假單胞菌、白色念珠菌、黑曲霉接種方法涂布法：表面接種不大于100cfu試驗(yàn)用菌懸液于TSA平板表面；傾注法：接種不大于100cfu試驗(yàn)用菌懸液于無(wú)菌平皿，傾注該培養(yǎng)基，輕輕搖勻。適用性檢查枯草芽孢桿菌、金黃色葡萄球菌、銅綠假單胞菌于30-35℃培養(yǎng)不超過(guò)3天；白色念珠菌、黑曲霉于30-35℃培養(yǎng)不超過(guò)5天。與對(duì)照培養(yǎng)基比較，恢復(fù)率在50％~200％之間。第四十五頁(yè)，共87頁(yè)。LuzhouInstitutesforFoodandDrugControl培養(yǎng)基適用性檢查培養(yǎng)基名稱(chēng)沙氏葡萄糖瓊脂（SDA）無(wú)菌性檢查取已滅菌的SDA注皿，于20-25℃培養(yǎng)5~7天，應(yīng)無(wú)菌落生長(zhǎng)。試驗(yàn)用菌種白色念珠菌、黑曲霉接種方法涂布法：表面接種不大于100cfu試驗(yàn)用菌懸液于SDA平板表面。傾注法：接種不大于100cfu試驗(yàn)用菌懸液于無(wú)菌平皿中,傾注該培養(yǎng)基，輕輕搖勻。適用性檢查白色念珠菌、黑曲霉于20-25℃培養(yǎng)不大于5天。與對(duì)照培養(yǎng)基比較，恢復(fù)率在50％~200％之間。備注：如該培養(yǎng)基用于控制菌白色念珠菌的檢查時(shí)，同時(shí)需要滿(mǎn)足控制菌項(xiàng)下培養(yǎng)基適用性檢查要求。第四十六頁(yè)，共87頁(yè)。LuzhouInstitutesforFoodandDrugControl培養(yǎng)基適用性檢查培養(yǎng)基名稱(chēng)沙氏葡萄糖瓊脂+抗生素（當(dāng)細(xì)菌超標(biāo)引起霉菌和酵母菌總數(shù)超標(biāo)用）無(wú)菌性檢查取已滅菌的SDA注皿，于20-25℃培養(yǎng)5~7天，應(yīng)無(wú)菌落生長(zhǎng)。試驗(yàn)用菌種抑菌性檢查：枯草芽孢桿菌、金黃色葡萄球菌、銅綠假單胞菌促生長(zhǎng)能力：白色念珠菌、黑曲霉常用抗生素1、慶大霉素：廣譜。對(duì)G-，G+菌有較好的抗菌作用。2、氯霉素：廣譜。對(duì)G-菌作用強(qiáng)；對(duì)G+菌作用不及青霉素與四環(huán)素。接種方法抑菌性：接種不少于100cfu試驗(yàn)用菌。促生長(zhǎng)能力：接種不大于100cfu試驗(yàn)用菌。適用性檢查白色念珠菌、黑曲霉于20-25℃培養(yǎng)不大于5天。與對(duì)照培養(yǎng)基比較，恢復(fù)率在50％~200％之間?？莶菅挎邨U菌、金黃色葡萄球菌、銅綠假單胞菌應(yīng)不得生長(zhǎng)。第四十七頁(yè)，共87頁(yè)。LuzhouInstitutesforFoodandDrugControl樣品：烏雞白鳳丸烏雞白鳳丸胰酪大豆胨瓊脂培養(yǎng)基玫瑰紅鈉瓊脂培養(yǎng)基疑似菌落做革蘭染色革蘭陽(yáng)性桿菌不屬于霉菌或酵母菌。將無(wú)菌硫酸慶大霉素（相當(dāng)于20mg慶大霉素）胰酪胨大豆瓊脂培養(yǎng)基玫瑰紅鈉瓊脂培養(yǎng)基。第四十八頁(yè)，共87頁(yè)。LuzhouInstitutesforFoodandDrug

Control選擇性培養(yǎng)基適用性控制菌檢查培養(yǎng)基特性試驗(yàn)菌株大腸菌群乳糖膽鹽發(fā)酵培養(yǎng)基促生長(zhǎng)能力E.coli乳糖發(fā)酵培養(yǎng)基抑制能力S.aureus促生長(zhǎng)能力+指示能力E.coliEMB或麥康凱瓊脂促生長(zhǎng)能力+指示能力E.coli大腸埃希菌膽鹽乳糖培養(yǎng)基促生長(zhǎng)能力E.coliMUG、EMB或麥康凱瓊脂抑制能力S.aureus促生長(zhǎng)能力+指示能力E.coli沙門(mén)菌營(yíng)養(yǎng)肉湯培養(yǎng)基促生長(zhǎng)能力S

paratyphi

B四硫磺酸鹽亮綠培養(yǎng)基促生長(zhǎng)能力S

paratyphi

BDHL或SS瓊脂、EMB或麥康凱瓊脂抑制能力S.aureus促生長(zhǎng)能力+指示能力S

paratyphi

B三糖鐵瓊脂指示能力S

paratyphi

B第四十九頁(yè)，共87頁(yè)。LuzhouInstitutesforFoodandDrug

Control選擇性培養(yǎng)基適用性控制菌檢查培養(yǎng)基特性試驗(yàn)菌株銅綠假單胞菌膽鹽乳糖培養(yǎng)基促生長(zhǎng)能力P.aeruginosa溴化十六烷基三甲銨瓊脂抑制能力S.aureus促生長(zhǎng)能力P.aeruginosa綠膿菌素測(cè)定用培養(yǎng)基抑制能力E.coli促生長(zhǎng)能力+指示能力P.aeruginosa金黃色葡萄球菌亞碲酸鹽肉湯培養(yǎng)基促生長(zhǎng)能力S.aureus甘露醇高鹽瓊脂或卵黃氯化鈉瓊脂抑制能力E.coli促生長(zhǎng)能力+指示能力S.aureus抑制能力E.coli梭菌梭菌增菌培養(yǎng)基促生長(zhǎng)能力Cl.

sporogenes哥倫比亞瓊脂促生長(zhǎng)能力Cl.

sporogenes白色念珠菌沙氏葡萄糖肉湯促生長(zhǎng)能力C.albicans沙氏葡萄糖瓊脂促生長(zhǎng)能力+指示能力C.albicans念珠菌顯色培養(yǎng)基促生長(zhǎng)能力+指示能力C.albicans1%聚山梨酯80-玉米瓊脂培養(yǎng)基抑制能力E.coli促生長(zhǎng)能力+指示能力C.albicans第五十頁(yè)，共87頁(yè)。微生物檢驗(yàn)的過(guò)程控制環(huán)境保證培養(yǎng)基保證無(wú)菌性檢查靈敏度檢查有效的方法方法驗(yàn)證SOP操作有效的結(jié)果可靠的結(jié)論結(jié)果判斷過(guò)程控制第五十一頁(yè)，共87頁(yè)。檢測(cè)方法驗(yàn)證標(biāo)準(zhǔn)（藥典）檢測(cè)方法實(shí)驗(yàn)室在進(jìn)行常規(guī)檢測(cè)前應(yīng)證明該實(shí)驗(yàn)室可以滿(mǎn)足標(biāo)準(zhǔn)檢測(cè)方法中的某些性能指標(biāo)（即方法確認(rèn)），并證明某一方法適用于某產(chǎn)品的檢測(cè)（方法適用性包括陽(yáng)性對(duì)照和陰性對(duì)照）。新建方法 方法驗(yàn)證與方法適用性藥典方法（其他成熟方法）方法轉(zhuǎn)移與方法確認(rèn)（部分菌株的驗(yàn)證）有案可查、溯源性；建立實(shí)驗(yàn)室自身的方法依據(jù)體系其他準(zhǔn)確度、精密度、專(zhuān)屬性、檢測(cè)限、定量限、線性、粗放性第五十二頁(yè)，共87頁(yè)。驗(yàn)證的一般程序與環(huán)節(jié)需前處理不需前處理無(wú)抑菌作用樣品檢查①驗(yàn)證前處理方法對(duì)污染菌生長(zhǎng)、檢出的影響。③驗(yàn)證抑菌活性去除的有效性，以及去除方法對(duì)污染菌生長(zhǎng)、檢出的影響。②可以通過(guò)驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)判斷藥品微生物檢查方法驗(yàn)證的一般程序與環(huán)節(jié)利用供試品與微生物的差異，降低或消除供試品的影響通過(guò)模擬實(shí)驗(yàn)對(duì)降低或消除效果加以檢驗(yàn)。有抑菌作用去除抑菌作用第五十三頁(yè)，共87頁(yè)。吐溫80結(jié)構(gòu)乳化劑降低了混合體系中各組分的界面張力，并在微滴表面形成較堅(jiān)固的薄膜由于乳化劑給出的電荷而在微滴表面形成雙電層，阻止微滴彼此聚集，而保持均勻的乳狀液。第五十四頁(yè)，共87頁(yè)。分裝5份9.9ml供試液+

0.1ml金黃色葡萄球菌液+

0.1ml金黃色葡萄球菌液+

0.1ml金黃色葡萄球菌液+

0.1ml銅綠假單胞菌液+

0.1ml枯草芽孢桿菌液+

0.1ml白色念珠菌液+0+.01m.1lm黑l黑曲曲霉霉菌菌液液+

0.1ml銅綠假單胞菌液+

0.1ml金黃色葡萄球菌液+

0.1ml銅綠假單胞菌液+

0.1ml枯草芽孢桿菌液+

0.1ml金黃色葡萄球菌液+

0.1ml銅綠假單胞菌液++00.1.1mml白l白色色念念珠珠菌菌液液++00..11mmll枯枯草草芽芽孢孢桿桿菌菌液液++00.1.m1mll金金黃黃色色葡葡萄萄球球菌菌液液++00..11mmll銅銅綠綠假假單單胞胞菌菌液液根據(jù)供試品的理化特性與生物學(xué)特性，采取適宜的方法制備合適的供試液。稀釋度依據(jù)樣品特性，質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)制定計(jì)數(shù)方法適用性試驗(yàn)保證平皿中的菌數(shù)不大于100cfu第五十五頁(yè)，共87頁(yè)。微生物檢驗(yàn)的過(guò)程控制環(huán)境保證培養(yǎng)基保證無(wú)菌性檢查靈敏度檢查有效的方法方法驗(yàn)證SOP操作有效的結(jié)果可靠的結(jié)論結(jié)果判斷過(guò)程控制第五十六頁(yè)，共87頁(yè)。微生物限度案例某板藍(lán)根沖劑，標(biāo)準(zhǔn)為細(xì)菌數(shù)不得過(guò)1000cfu/g，某藥檢所細(xì)菌數(shù)結(jié)論1200cfu/g，送中檢院仲裁。(1)方法適用性合格不合格第五十七頁(yè)，共87頁(yè)。LuzhouInstituteDrug

Control菌種傳代保藏流程1BioBall3推薦方式2自動(dòng)稀釋s

forFood

and第五十八頁(yè)，共87頁(yè)。LuzhouInstitutesforFoodandDrugControl試驗(yàn)用菌株的傳代次數(shù)不得超過(guò)5代（從菌種保存中心獲得的冷凍干燥菌種為第0代）。代的定義：每接種一次即為一代（有在新鮮的培養(yǎng)基上生長(zhǎng)過(guò)程)傳代示意圖：干燥菌種（0代）QCCV1 CV2 CV3液體培養(yǎng)基復(fù)蘇（1代）工作菌株傳代保藏規(guī)程第五十九頁(yè)，共87頁(yè)。菌種傳代流程S1

S2

S3QCS1S2S3

第二代工作菌懸液冷藏（零下20℃）cv1CVcv2

cv3cv4QCCycle1第一代儲(chǔ)備管凍存（零下30或70℃）凍干菌種第二代工作菌斜面冷藏（2~8℃）

鑒別cv11cv2cv3cv36Cycle2第二代儲(chǔ)備管凍存（零下30或70

℃

）QCTSBQC工作菌株傳代保藏流程示意圖。第六十頁(yè)，共87頁(yè)。微生物檢驗(yàn)的過(guò)程控制環(huán)境保證培養(yǎng)基保證無(wú)菌性檢查靈敏度檢查有效的方法方法驗(yàn)證SOP操作有效的結(jié)果可靠的結(jié)論結(jié)果判斷過(guò)程控制第六十一頁(yè)，共87頁(yè)。實(shí)驗(yàn)操作——物料進(jìn)場(chǎng)消毒液搽拭物品外表面潔凈傳遞（風(fēng)淋、紫外照射）核心區(qū)外圍消毒劑清潔外表面雙層無(wú)菌包裝外圍第六十二頁(yè)，共87頁(yè)。實(shí)驗(yàn)操作——人員進(jìn)場(chǎng)一更二更第六十三頁(yè)，共87頁(yè)。LuzhouInstitutesforFood

andDrug

Control硫乙陰性090423馬丁陰性090423馬丁××樣品090423硫乙××樣品090423馬丁××陽(yáng)性090423硫乙××陽(yáng)性090423監(jiān)控平板樣品 沉降菌 手指無(wú)菌檢驗(yàn)框架示意圖第六十四頁(yè)，共87頁(yè)。LuzhouInstitutesfor無(wú)菌三針單聯(lián)管Food

andDrug

Control第六十五頁(yè)，共87頁(yè)。實(shí)驗(yàn)過(guò)程監(jiān)控表面監(jiān)控手部監(jiān)控環(huán)境菌監(jiān)控第六十六頁(yè)，共87頁(yè)。無(wú)菌程序保障? 無(wú)菌檢查樣品前處理分批消毒、實(shí)驗(yàn)（混合）→統(tǒng)一消毒，統(tǒng)一實(shí)驗(yàn)? 嚴(yán)格遵守外表面消毒程序一般環(huán)境酚類(lèi)（phenylphenol/tertiaryamylphenol）→潔凈環(huán)境過(guò)氧乙酸+75%乙醇（無(wú)菌級(jí)）（苯式苯酚/三級(jí)戊基苯酚）? 增加過(guò)程監(jiān)控力度表面菌采樣、手部采樣（每批）、動(dòng)態(tài)浮游菌采樣（下風(fēng)口）第六十七頁(yè)，共87頁(yè)。LuzhouInstitutesforFood

andDrug

Control明確標(biāo)識(shí)Paperlabels

are

preferredovermarker

pens.第六十八頁(yè)，共87頁(yè)。原始記錄樣品信息&方法信息儀器信息&狀態(tài)檢驗(yàn)結(jié)論前置方便核驗(yàn)校對(duì)&復(fù)核信息前置第六十九頁(yè)，共87頁(yè)。原始記錄樣品信息一致材料信息&試劑信息檢驗(yàn)方法描述檢驗(yàn)結(jié)果記錄第七十頁(yè)，共87頁(yè)。原始記錄樣品信息一致過(guò)程監(jiān)控信息包括監(jiān)控方案培養(yǎng)條件培養(yǎng)結(jié)果及培養(yǎng)基信息是否啟動(dòng)偏差調(diào)查記錄第七十一頁(yè)，共87頁(yè)。原始記錄樣品信息環(huán)境保障調(diào)查儀器運(yùn)轉(zhuǎn)環(huán)境監(jiān)控檢驗(yàn)操作調(diào)查培養(yǎng)基、檢驗(yàn)用具陰性、陽(yáng)性對(duì)照操作細(xì)節(jié)結(jié)果判斷調(diào)查第七十二頁(yè)，共87頁(yè)。微生物檢驗(yàn)的過(guò)程控制環(huán)境保證培養(yǎng)基保證無(wú)菌性檢查靈敏度檢查有效的方法方法驗(yàn)證SOP操作有效的結(jié)果可靠的結(jié)論結(jié)果判斷過(guò)程控制第七十三頁(yè)，共87頁(yè)。結(jié)果判斷? 陽(yáng)性（+）陰性（-）

供試品管渾濁，即判不合格除非能充分證明試驗(yàn)結(jié)果無(wú)效，即生長(zhǎng)的微生物非供試品所含

設(shè)備，環(huán)境的微生物監(jiān)控結(jié)果超標(biāo)

回顧實(shí)驗(yàn)過(guò)程，發(fā)現(xiàn)污染因素

鑒定微生物，確認(rèn)是操作引入的? 無(wú)菌試驗(yàn)經(jīng)確認(rèn)無(wú)效，可重試第七十四頁(yè)，共87頁(yè)。藥品無(wú)菌檢驗(yàn)的溯源性分析藥品微生物實(shí)驗(yàn)室環(huán)境/過(guò)程微生物的監(jiān)測(cè)藥品的微生物檢測(cè)環(huán)境/過(guò)程細(xì)菌與藥品細(xì)菌的比較結(jié)論產(chǎn)品污染實(shí)驗(yàn)污染污染源排除重試溯源分析整改第七十五頁(yè)，共87頁(yè)。藥品微生物實(shí)驗(yàn)環(huán)境微生物的監(jiān)測(cè)藥品的微生物檢測(cè)環(huán)境微生物與陽(yáng)性結(jié)果的比較結(jié)論保證藥品微生物檢驗(yàn)結(jié)果可靠的有效途徑過(guò)程微生物信息的全面性微生物鑒定結(jié)果的準(zhǔn)確性第七十六頁(yè)，共87頁(yè)。LuzhouInstitutesforFoodandDrugControl各類(lèi)常見(jiàn)微生物的菌落特征微生物類(lèi)別菌落特征單細(xì)胞微生物菌絲狀微生物細(xì)菌酵母菌放線菌霉菌主要特征細(xì)胞形態(tài)特征小而均勻、個(gè)別有芽孢大而分化細(xì)而均勻粗而分化相互關(guān)系單個(gè)分散或按一定方式排列單個(gè)分散或假絲狀絲狀交織絲狀交織菌落含水情況很濕或較濕較濕干燥或較干燥干燥外觀特征小而突起或大而平坦大而突起小而緊密大而疏松或大而致密參