臨床檢驗基礎講義

第第1頁共9頁臨床檢驗基礎講義（1）臨床醫(yī)學檢驗主管技師考試輔導《臨床檢驗基礎》血液樣本米集和血涂片制備一.血液生理概要要點1:離體后的血液自然凝固，分離出來的淡黃色透明液體稱為血清。血液加抗凝劑后分離出來的淡黃色液體稱為血漿。血清與血漿差別是：血清缺少某些凝血因子，如凝血因子I（纖維蛋白原）.II（凝血酶原）.v.vm等。要點2：全血適用于臨床血液學檢查，如血細胞計數(shù)分類和形態(tài)學檢查等。血漿適用于血漿生理性和病理性化學成分的測定，特別是內(nèi)分泌激素測定；血漿除鈣離子外，含有其他全部凝血因子，也適用于血栓與止血的檢查。血清適用于臨床化學和臨床免疫學檢查。要點3：正常人血量約為（70±10）ml/kg體重，成人約4?5L,約占體重的6%?8%,其中血漿占55%,血細胞占45%。小兒血量與體重之比略高于成人，男性比女性血量稍多，但女性妊娠期間血量可增加23%?25%。要點4：血液的紅色來自紅細胞內(nèi)血紅蛋白。動脈血氧合血紅蛋白含量較高，呈鮮紅色；靜脈血還原血紅蛋白含量高，呈暗紅色。嚴重貧血者血液紅色變淺。嚴重一氧化碳中毒或氧化物中毒者血液呈櫻紅色。要點5：酸堿度：正常人血液pH值7.35?7.45,動脈血pH值7.40,靜脈血pH值7.35o血漿滲透量：正常人約為290?310m0sm/(kg?H20)。要點6：正常人血液中紅細胞呈均勻混懸狀態(tài)。與紅細胞膜表面的唾液酸根.正常血漿成分.血漿黏度及血流動力學等因素有關。正常人全血黏度約為生理鹽水黏度的4?5倍，血漿黏度約為生理鹽水黏度的1.6倍。血液黏度與血細胞比容和血漿黏度有關，其中，血漿黏度受血漿中纖維蛋白原.球蛋白等大分子蛋白質(zhì)的影響，它們的濃度越高，血漿黏度越高。要點7：血液生理功能具有運輸功能.協(xié)調(diào)功能.維護機體內(nèi)環(huán)境穩(wěn)定和防御功能。二.采血方法要點8：靜脈采血多采用位于體表的淺靜脈，通常采用肘部靜脈.手背靜脈.內(nèi)踝靜脈或股靜脈。小兒可采頸外靜脈血液。要點9：皮膚采血法曾稱為毛細血管采血法，是采集微動脈.微靜脈和毛細血管的混合血，同時含細胞間質(zhì)和細胞內(nèi)液。通常，選擇耳垂或手指部位。手指采血操作方便，檢查結(jié)果比較恒定，世界衛(wèi)生組織(WHO)推薦采集左手無名指指端內(nèi)側(cè)血液，嬰第2頁共9頁幼兒可采集大拇指或足跟內(nèi)外側(cè)緣血液，嚴重燒傷患者，可選擇皮膚完整處采血。要點10：耳垂采血痛感較輕，操作方便，但血循環(huán)較差，受氣溫影響較大，檢查結(jié)果不夠恒定（如紅細胞.白細胞.血紅蛋白和血細胞比容等測定結(jié)果比手指血或靜脈血高），一般情況下不宜使用。要點11:因第1滴血混有組織液，應擦去。如血流不暢切勿用力擠壓，以免造成組織液混入，影響結(jié)果的準確性。進行多項檢查時，采血的順序依次為血小板計數(shù).紅細胞計數(shù).血紅蛋白測定.白細胞計數(shù)血型鑒定等。要點12：常用彩色真空采血容器的用途蓋子顏色添加抗凝劑注意事項用途紅色無凝塊形成約30min化學.血清學.血庫紫色EDTA須顛倒混勻6?8次全血細胞計數(shù)（CBC）淡藍色枸椽酸鈉須顛倒混勻；血液與抗凝比例為9:1凝血檢查（PT.APTT.因子測定）綠色肝素鈉.肝素鋰.肝素鍍根據(jù)實驗需要，選擇不同型的肝素化學灰色氟化鈉.草酸鉀不能用于其他化學檢查葡萄糖.糖耐量.乙醇濃度黃色多茴香腦磺酸鈉（SPS）須顛倒混勻8次血培養(yǎng)深藍色無抗凝劑或肝素鈉.EDTA化學清潔的試管毒理學.微量金屬金黃色分離膠/凝塊激活劑須顛倒混勻5次，使血液與激活劑充分接觸。凝塊完全形成后離心化學.不適于血庫淡綠色分離膠/肝素鋰血庫要點13：第3頁共9頁.皮膚采血：缺點是易于溶血?凝血.混入組織液，而且局部皮膚揉擦.針刺深度不一.個體皮膚厚度差異等都影響檢查結(jié)果，所以，皮膚采血檢查結(jié)果重復性差.準確性不好。.靜脈采血：開放式采血法的操作環(huán)節(jié)多，難于規(guī)范統(tǒng)一，在移液和丟棄注射器時可能造成血液污染。封閉式采血法的操作規(guī)范，有利于樣本收集運送和保存，防止院內(nèi)血源性傳染病。要點14：質(zhì)量控制患者：患者活動情況.精神狀態(tài).藥物.年齡?性別-種族.樣本采集時間.吸煙.季節(jié)等都會影響檢測結(jié)果。采血：采HlL前，患者應盡量減少運動保持平靜。住院患者應在早晨臥床時取血。冬天，患者從室外進入室內(nèi)，應等其暖和后再采血。止血帶結(jié)扎時間應小于lmin,如超過2min,大靜脈血流受阻而使毛細血管內(nèi)壓增高，使分子質(zhì)量V5000的物質(zhì)逸入組織液，或缺氧引起血液成分的變化，使檢查結(jié)果不可靠。溶血：血細胞內(nèi).外各種成分有梯度差，有的成分相差數(shù)倍，故在采集.運輸.保管.分離血細胞時應盡量避免溶血。因容器不潔.接觸水.強力振蕩.操作不慎等可引起溶血，使紅細胞計數(shù).血細胞比容-血漿或血清化學成分（如鉀.鎂.轉(zhuǎn)氨酶.膽紅素）等多項指標檢驗結(jié)果發(fā)生變化。樣本處理：血液樣本采集后應立即送檢，并盡快進行檢查，樣本保存不當直接影響實驗結(jié)果。第4頁共9頁實驗結(jié)果分析：分析結(jié)果時，應考慮藥物.飲食等因素對結(jié)果的影響。同時，應密切結(jié)合臨床。三.抗凝劑選擇要點15：.乙二胺四乙酸(EDTA)鹽:常用有鈉鹽(EDTA-Na2?H20)或鉀鹽(EDTA-K2?2H20),能與血液中鈣離子結(jié)合成螯合物,使52+失去凝血作用，阻止血液凝固。EDTA鹽對血細胞形態(tài).血小板計數(shù)影響很小，適用于血液學檢查，尤其是血小板計數(shù)。但鈉鹽溶解度低于鉀鹽，有時影響抗凝效果。根據(jù)國際血液學標準化委員會(ICSH)建議，CBC抗凝劑用EDTA-K2-2H20,量為.5?.2mg/ml血液。不適于凝血檢查.血小板功能試驗。.草酸鹽：常用有草酸鈉.草酸鉀.草酸鍍，溶解后解離的草酸根離子能與樣本中鈣離子形成草酸鈣沉淀，使Ca2+失去凝血作用，阻止血液凝固。草酸鹽優(yōu)點是溶解度好.價廉。草酸鹽對凝血因子V的保護作用差，影響凝血酶原時間測定，而且草酸鹽與鈣結(jié)合后形成的沉淀物，影響自動凝血儀檢測結(jié)果，因此，草酸鹽不適于凝血檢查。雙草酸鹽抗凝劑：草酸鉀可使紅細胞體積縮小，草酸鍍則可使紅細胞脹大，兩者按適當比例混合，恰好不影響紅細胞形態(tài)和體積，可用于血細胞比容.CBC.網(wǎng)織紅細胞計數(shù)等項目檢查，若單用草酸鉀或草酸鈉作為抗凝劑，與肝素為抗凝劑測定的血細胞比第5頁共9頁容比較，測定結(jié)果可減低8%?13%。雙草酸鹽抗凝劑可使血小板聚集.影響白細胞形態(tài)，不適于血小板計數(shù).白細胞分類計數(shù)。.肝素：加強抗凝血酶（AT）滅活絲氨酸蛋白酶作用，阻止凝血酶的形成，并阻止血小板聚集等作用，從而阻止血液凝固。肝素廣泛存在于肺.肝.脾等幾乎所有組織和血管周圍肥大細胞和嗜堿性粒細胞顆粒中，帶有較多負電荷。肝素具有抗凝力強-不影響血細胞體積.不易溶血等優(yōu)點，絕大多數(shù)檢查都可用肝素作為抗凝劑，是紅細胞滲透脆性試驗的理想抗凝劑。但肝素可引起白細胞聚集，瑞氏染色后產(chǎn)生藍色背景，不適于CBC.細胞形態(tài)學檢查。每毫升血液肝素用量為（15土.5）U,多為肝素鈉鹽或鉀鹽。.枸椽酸鹽：常用有枸椽酸鈉，能與血液中鈣離子結(jié)合形成螯合物，阻止血液凝固。枸椽酸鹽的溶解度低，抗凝力不如上述抗凝劑。枸椽酸鈉與血液的抗凝比例為1：9或1：4o適用于紅細胞沉降率.凝血檢查，是輸血保養(yǎng)液的成分。血液涂片制備要點16：手工推片法：取血1滴置載玻片一端，以邊緣平滑的推片，從血滴前方接觸血液，使血液沿推片散開，通常推片與載玻片保持25。?30。夾角，平穩(wěn)地向前推動，血液即在載玻片上形成薄層血膜。涂片厚薄與血滴大小.推片與載玻片間夾角.推片速度.血細胞比容有關。一張良好的血片，應厚薄適宜.頭體尾明顯.細胞分布均勻.血膜邊緣整齊，并留有一定空隙。第6頁共9頁血液細胞染色要點17：瑞氏染料：由酸性染料伊紅（E-）和堿性染料亞甲藍（M+）組成。將適量伊紅.美藍溶解在甲醇中，即為瑞氏染料。甲醇的作用：一是溶解美藍和伊紅；二是固定細胞形態(tài)。染色原理：既有物理的吸附作用，又有化學的親和作用。各種細胞成分化學性質(zhì)不同，對各種染料的親和力也不一樣。如血紅蛋白.嗜酸性顆粒為堿性蛋白質(zhì)，與酸性染料伊紅結(jié)合，染粉紅色，稱為嗜酸性物質(zhì)；細胞核蛋白.淋巴細胞.嗜堿性粒細胞胞質(zhì)為酸性，與堿性染料美藍或天青結(jié)合，染紫藍色或藍色，稱為嗜堿性物質(zhì)。中性顆粒呈等電狀態(tài)與伊紅和美藍均可結(jié)合，染淡紫紅色，稱為嗜中性物質(zhì)；原始紅細胞.早幼紅細胞胞質(zhì).核仁含較多酸性物質(zhì)，染成較濃厚的藍色；中幼紅細胞既含酸性物質(zhì)，又含堿性物質(zhì)，染成紅藍色或灰紅色；完全成熟紅細胞，酸性物質(zhì)徹底消失后，染成粉紅色。要點18：pH值的影響：細胞各種成分均屬蛋白質(zhì)，由于蛋白質(zhì)系兩性電解質(zhì)，所帶電荷隨溶液pH而定，在偏酸性環(huán)境中正電荷增多，易與伊紅結(jié)合，紅細胞和嗜酸性粒細胞染色偏紅，細胞核呈淡藍色或不染色；在偏堿性環(huán)境中負電荷增多，易與美藍結(jié)合，所有細胞呈灰藍色，顆粒呈深暗，嗜酸性顆粒呈暗褐，甚至棕黑色，中性顆粒偏粗，呈紫黑色。第7頁共9頁稀釋染液必須用緩沖液，沖洗用水應近中性，否則可導致細胞染色反應呈色異常，形態(tài)難以識別，甚至錯誤。要點19：沖洗時應以流水沖洗，不能先倒掉染液，以防染料沉著在血涂片上。沖洗時間不能過久，以防脫色。如血涂片上有染料顆粒沉積，可滴加甲醇，然后立即用流水沖洗。染色過淡可以復染，復染時應先加緩沖液，然后加染液。染色過深可用流水沖洗或浸泡，也可用甲醇脫色。方法學評價要點20：血涂片制備：手工推片法用血量少.操作簡單，是應用最廣泛的方法。此外，瘧原蟲.微絲呦等檢查可采用厚血膜涂片法。瑞氏染色法是最經(jīng)典.最常用的染色法，尤其對于細胞質(zhì)成分.中性顆粒等可獲得很好的染色效果，但對細胞核的著色能力略差。吉姆薩染液對細胞核.寄生蟲（如瘧原蟲等）著色較好，結(jié)構更清晰，但對細胞質(zhì)成分的著色能力略差。采用瑞氏-吉姆薩復合染液可使細胞胞質(zhì)-顆粒-胞核等均獲得滿意的染色效果。瑞氏染料的質(zhì)量規(guī)格用吸光度比值（rA）來評價，rA測定方法：取瑞氏染液15?25U1,加甲醇10ml稀釋，混勻，以甲醇為空白管，分別在波長650nm（美藍吸收峰波長）.525nm（伊紅吸收峰波長）測定吸光度（rA=A650/A525）。新配制染料rA接近2,隨美藍逐漸氧化為天青B（其吸收峰為650nm，吸光度約為美藍一半），rA也下降，降到第8頁共9頁1.3±0.1時，染料即可使用。新鮮配制的染料偏堿，須在室溫或是37°C下貯存一定時間，待美藍逐漸變?yōu)樘烨郆,貯存時間愈久，染色效果愈好。在貯