液相色譜的方法開發(fā)分離機(jī)理及色譜柱課件

液相色譜的方法開發(fā)分離機(jī)理及色譜柱選HPLC參數(shù)時(shí)的基本考慮溶解度-選擇流動(dòng)相的條件分子量-在樣品預(yù)處理或GPC分析時(shí)有用官能團(tuán)-有否離子化基團(tuán)?保留特性如何?樣品的基質(zhì)-考慮如何前處理在基質(zhì)中樣品的含量-分析、制備都考慮檢測特性-有否紫外吸收?熒光?找出樣品中不同組份之間的差異摸索條件的重要線索極性問題吸附色譜的分離機(jī)理隨著樣品在固定相上的吸附能力由大到小在色譜柱上的保留由長到短吸附色譜概述分離基于樣品的極性差異。洗脫次序∶一般為正相，即：極性低的先被洗脫常用的流動(dòng)相∶非極性有機(jī)溶劑，如己烷乙酸等為添加劑常用固定相∶硅膠、氧化鋁、羥基磷灰石等。分配色譜的分離機(jī)理鍵合相色譜柱以硅膠為基質(zhì)，通過化學(xué)鍵合方式把碳十八、碳八、胺基等基團(tuán)聯(lián)在基質(zhì)上，作為固定相。優(yōu)點(diǎn)∶固定相穩(wěn)定，不易流失應(yīng)用廣泛，可使用多種溶劑消除硅羥基的不良影響缺點(diǎn)∶pH值不能小于3同樣填料，各種牌號(hào)色譜柱不盡相同體積排除色譜的分離機(jī)理凝膠色譜概述凝膠滲透（GPC）、凝膠過濾（GFC）分離基于分子在溶液中的體積大小洗脫次序：大分子先被洗脫流動(dòng)相不參與分離，只起溶劑作用分離效率低色譜行為容易預(yù)測離子交換樹脂的分離機(jī)理離子交換色譜概述適用于離子型化合物的分離分離基于離子的帶電特性洗脫次序受多種因素的影響填料（離子交換樹脂）的種類∶陰/陽，強(qiáng)/弱，交換基團(tuán)樣品分子特性鹽的種類、濃度溫度及pH值有機(jī)溶劑離子交換樹脂的交換容量色譜柱化學(xué)及外形結(jié)構(gòu)的關(guān)系對HPLC柱的了解平均顆粒度，顆粒度分布顆粒度(dp)顆粒度越?。褐г礁?傳質(zhì)好，渦流擴(kuò)散小)

柱壓越高(滲透性差)顆粒分布顆粒分布越寬∶柱效低(滲透性差)顆粒形狀球型∶柱效高、重現(xiàn)性好、柱床結(jié)構(gòu)均勻無定型：柱床結(jié)構(gòu)不均勻

流動(dòng)相線性速度不均勻

譜帶擴(kuò)展對HPLC柱的了解（二）平均孔徑/孔體積孔徑/孔體積分布大的孔徑可分析高分子量的分子對HPLC柱的了解（四）含碳量含碳量越高，k‘值越大（固定相傳質(zhì)效應(yīng)增加）高含碳量有利于不易保留的化合物的分離水解穩(wěn)定性好，重現(xiàn)性好有利于極性化合物的拖尾改善低含碳量有利于分析中性及堿性化合物降低溶劑損耗不同色譜柱的含碳量

色譜柱 C% k‘苊(50/50的乙腈/水)SymmetryC18 19 17ZorbaxODS 17 15.7LiChrosorbRP-18 15 10.3SymmetryC8 12 12.5ResolveC-18 12 12.4UltrasphereODS 11 11.3PartisilODS-3 11 12.0mBondpakC-18 10 7.9Nova-PakC-18 7 5.5對HPLC柱的了解(五)填料的端基封口封口殘余硅羥基減少不可逆吸附或拖尾增加碳含量（0.1%-1%）對HPLC柱的了解（六）硅膠的活性主要影響堿性化合物的保留行為：k'生產(chǎn)硅膠時(shí)處理溫度不同，硅膠活性也不同是選擇性差異的主要來源硅膠的雜質(zhì)含量重金屬含量低，硅羥基活性小，拖尾減小是色譜柱質(zhì)量好壞的重要標(biāo)志對HPLC柱的了解（七）填料的穩(wěn)定性硅膠填料pH：2-8聚合物填料pH：2-12pH值小于2時(shí)

鍵合相水解Waters不同品牌的色譜柱Resolve平均孔徑90A，5/10m低活性硅膠非常高的疏水性，無端基封口有利于低保留的中性及酸性化合物分離Delta-Pak有100A和300A兩種孔徑，5/15m硅膠中到高的疏水性，端基封口適合于多肽、蛋白的分離及制備色譜新一代硅膠基質(zhì)的色譜柱Symmetry高純度硅膠：Fe，Al，Mg等均<10ppm孔徑100A，5m球形顆粒，端基封口超高含碳量：C18/19%，C8/12%表面積：300m2/g孔體積：1mL/g特點(diǎn)好峰形，好重現(xiàn)性，不同的選擇性，使用壽命長Waters聚合物基質(zhì)的反相柱特殊設(shè)計(jì)的多孔聚合物膠有很寬的pH適應(yīng)范圍（2-12）可用離子抑制方法分析堿性化合