粘膜疫苗與活載體疫苗課件

粘膜疫苗與活載體疫苗2010/04/15粘膜免疫1963年Chodirker和Tomasi等對(duì)粘液Ig類型進(jìn)行大量免疫化學(xué)研究發(fā)現(xiàn)一種IgA類抗體，導(dǎo)致了粘膜免疫概念的產(chǎn)生。S-IgA介導(dǎo)的胃腸道的免疫保護(hù)粘膜免疫系統(tǒng)的組成1有結(jié)構(gòu)的組織：稱為黏膜濾泡，主要是腸相關(guān)淋巴組織和支氣管相關(guān)淋巴組織。他們是免疫應(yīng)答的傳入淋巴區(qū)，抗原由此進(jìn)入MIS（粘膜免疫系統(tǒng)），被抗原提呈捕獲、處理和提呈給T、B細(xì)胞，引發(fā)免疫應(yīng)答。2彌散淋巴組織：廣泛的分布黏膜固有層中，它們是免疫應(yīng)答的傳出淋巴區(qū)，漿細(xì)胞和致敏淋巴細(xì)胞通過歸巢機(jī)制遷至彌散淋巴組織，抗體和致敏淋巴細(xì)胞在此發(fā)揮功能。粘膜免疫粘膜免疫系統(tǒng)存在著功能性分離的位點(diǎn)：誘導(dǎo)位點(diǎn)(inductivesite)：首次接觸抗原/疫苗誘導(dǎo)起始反應(yīng)的位點(diǎn)，腸相關(guān)淋巴組織(GALT),支氣管相關(guān)淋巴組織(BALT)、鼻淋巴組織(NALT)、眼結(jié)膜相關(guān)淋巴組織等。效應(yīng)位點(diǎn)(effectorsite)：攝取抗原誘導(dǎo)B細(xì)胞和T細(xì)胞反應(yīng)，引起免疫保護(hù)的位點(diǎn)，腸道、呼吸道和生殖道等粘膜的固有層、部分腺體(乳腺、汗腺及禽哈德氏腺)和上皮間淋巴細(xì)胞(IEL)。腸道集合淋巴結(jié)(PP)對(duì)抗原的攝取從功能上和形態(tài)學(xué)上，腸道集合淋巴結(jié)分為三個(gè)區(qū):(1)彎隆區(qū)(domeregion)，由含微皺褶細(xì)胞(M細(xì)胞)、濾泡相關(guān)上皮(FAE)和淋巴細(xì)胞的上皮層覆蓋;M細(xì)胞主要用于抗原轉(zhuǎn)運(yùn)到誘導(dǎo)位點(diǎn)。(2)B細(xì)胞濾泡，常含一個(gè)或多個(gè)生發(fā)中心;(3)T細(xì)胞依賴區(qū)(TDA)，富含T細(xì)胞。腸道集合淋巴結(jié)引發(fā)的IgA抗體反應(yīng)(1)正常的抗原遞呈;(2)在Th細(xì)胞的輔助下，腸道集合淋巴結(jié)中B細(xì)胞對(duì)抗原刺激發(fā)生反應(yīng)，進(jìn)行擴(kuò)增，形成記憶細(xì)胞，散布到粘膜效應(yīng)位點(diǎn)如大、小腸的彌散性固有層。（3）當(dāng)歸巢至些效應(yīng)位點(diǎn)，B細(xì)胞進(jìn)行克隆擴(kuò)增，一旦再接觸到相同抗原，在Th細(xì)胞和其分泌的細(xì)胞因子的輔助下，分化為分泌IgA的漿細(xì)胞;（4）B細(xì)胞和Th細(xì)胞經(jīng)過這種誘導(dǎo)，其子代遷移至效應(yīng)位點(diǎn)如胃腸道的固有層繼續(xù)發(fā)育，這些過程構(gòu)成了粘膜共有的免疫系統(tǒng)

怎樣針對(duì)粘膜免疫誘導(dǎo)位點(diǎn)抗原遞呈和激活B,T細(xì)胞亞群最佳？必須弄清病原體的致病機(jī)理以及宿主如何反應(yīng)來保護(hù)自己，才能設(shè)計(jì)最佳方案：(1)目前選擇使用的大量疫苗主要是特異性針對(duì)腸道集合淋巴結(jié)包括口服混合有粘膜佐劑、微膠囊或活載體釋放系統(tǒng)的抗原;(2)病原體是胞內(nèi)感染，在設(shè)計(jì)疫苗時(shí)，更多地考慮刺激CD4+Th1細(xì)胞和CD8+T細(xì)胞，引發(fā)細(xì)胞免疫反應(yīng)。（3）病原體經(jīng)細(xì)胞外機(jī)制引起疾病，應(yīng)考慮疫苗的免疫程序來優(yōu)化CD4+Th2細(xì)胞，引發(fā)體液免疫;新的粘膜免疫佐劑—神經(jīng)肽免疫系統(tǒng)有其自身的調(diào)節(jié)途徑：經(jīng)細(xì)胞間相互作用和釋放細(xì)胞因子來控制B細(xì)胞和T細(xì)胞反應(yīng)。腸神經(jīng)系統(tǒng)(entericnervoussystem,ENS)影響著胃腸道免疫系統(tǒng)的調(diào)節(jié)ENS滲透到胃腸道的每個(gè)部位，波及廣泛的區(qū)域，影響著粘膜免疫的誘導(dǎo)和效應(yīng)功能，涉及免疫應(yīng)答的神經(jīng)調(diào)制質(zhì)(neuromodulator)達(dá)18種以上。新的粘膜免疫佐劑—神經(jīng)肽P物質(zhì)能刺激產(chǎn)生Ig細(xì)胞的發(fā)育，體內(nèi)排空P物質(zhì)則降低產(chǎn)生Ig細(xì)胞的數(shù)目。含P物質(zhì)的神經(jīng)纖維的密度和分布在哺乳動(dòng)物種間變化很大，進(jìn)一步研究需要確定這種神經(jīng)纖維是否直接影響固有層漿細(xì)胞或T細(xì)胞。血管活性腸肽(VIP)：淋巴細(xì)胞表達(dá)VIP受體，含VIP神經(jīng)纖維可滲透到腸道集合淋巴結(jié)的T細(xì)胞區(qū)。與P物質(zhì)發(fā)揮的刺激作用相反，VIP通過降低IL-2而IgA產(chǎn)生的減少。P物質(zhì)和VIP如何互相調(diào)節(jié)粘膜免疫反應(yīng)提供進(jìn)一步的研究。活載體疫苗構(gòu)建活載體疫苗的細(xì)菌載體構(gòu)建活載體疫苗的病毒載體構(gòu)建活載體疫苗的細(xì)菌載體減毒沙門氏菌、卡介苗、減毒腸致病性大腸桿菌、減毒弧菌、減毒耶爾森氏菌共棲菌的細(xì)菌包括革蘭氏陽性菌格氏鏈球菌、木糖葡萄球菌、乳球菌、乳酸桿菌等也可代替減毒病原菌作為載體；單核細(xì)胞增生李斯特菌最近也被認(rèn)為是一種潛在的疫苗載體釋放粘膜疫苗的活載體－－沙門氏菌(1)該菌能運(yùn)送抗原至腸道的淋巴組織，并引起分泌IgA免疫反應(yīng)，分泌性IgA浸潤所有的粘膜表面以及外分泌腺體的分泌物。(2)傷寒沙門氏菌在動(dòng)物寄主腸道中定居，并在腸道淋巴組織、肝和脾中增殖。各種沙門氏菌突變后，它們?nèi)阅茉谀c道淋巴組織中定居。這些特征使減毒沙門氏菌可能作為表達(dá)各種定居因子、毒性抗原基因的載體，來遞呈這些抗原到腸道淋巴組織。釋放粘膜疫苗的活載體－－沙門氏菌沙門氏菌是通過腸細(xì)胞或m細(xì)胞侵襲至宿主體內(nèi)，使它們易于接近免疫效應(yīng)細(xì)胞或抗原提呈細(xì)胞，或直接刺激粘膜免疫系統(tǒng)檢查沙門氏菌表達(dá)系統(tǒng)誘導(dǎo)的腸道集合淋巴結(jié)的Th反應(yīng)比較困難，通過檢查脾臟細(xì)胞的反應(yīng)來證明粘膜反應(yīng)。表達(dá)碩大利什曼原蟲gp63表面蛋白質(zhì)的致弱的沙門氏菌誘導(dǎo)的Th1樣反應(yīng)可通過從抗原刺激的脾臟細(xì)胞的培養(yǎng)上清液中IFN-r和IL-2的產(chǎn)生和IL-4的缺乏來實(shí)現(xiàn)。確定IgA誘導(dǎo)位點(diǎn)(如腸道集合淋巴結(jié))和效應(yīng)位點(diǎn)(如胃腸道固有層)中抗原特異的Th1和Th2細(xì)胞的特性已成為當(dāng)前研究的一個(gè)熱點(diǎn)卡介苗與牛分枝桿菌相近的分枝桿菌和丁酸分枝桿菌作為完全佐劑的關(guān)鍵成分已使用多年。優(yōu)點(diǎn):(1)并發(fā)癥少;(2)它和脊髓灰質(zhì)炎疫苗是WHO組織所推薦的、出生時(shí)預(yù)防接種的兩種疫苗，本身就是最強(qiáng)的非特異免疫刺激劑;能應(yīng)用與HIV陽性的新生兒;(3)單次免疫接種即能誘導(dǎo)長期的(5-50年)細(xì)胞介導(dǎo)的免疫力，使機(jī)體產(chǎn)生對(duì)AIDS、肝炎甚至惡性腫瘤等20余種疾病的保護(hù)性免疫;(4)價(jià)廉、熱穩(wěn)定性強(qiáng)，適宜在基層推廣使用卡介苗將外源基因?qū)肟ń槊缰械募夹g(shù)很成熟利用分枝桿菌噬菌體構(gòu)建新的雜交穿梭載體，能象大腸桿菌的質(zhì)粒一樣起作用。表面表達(dá)的抗原最有利于抗原的遞呈以產(chǎn)生最佳免疫應(yīng)答，尤其是提供免疫保護(hù)方面。訖現(xiàn)在所做的工作為止，根據(jù)誘導(dǎo)的免疫應(yīng)答還很難說一種途徑比另一種途徑更好。象沙門氏菌一樣，應(yīng)答更取決于抗原的類型而不是其免疫的方法。目前用于表達(dá)外源病毒蛋白的載體病毒包括：痘病毒(痘苗病毒和宿主特異性痘病毒)、腺病毒、皰疹病毒、小RNA病毒等構(gòu)建活載體疫苗的病毒載體痘苗病毒具有宿主范圍廣、增殖滴度高、穩(wěn)定性好、基因組容量大、含多個(gè)非必需區(qū)基因等特，因此，有利于進(jìn)行基因工程操作，易于構(gòu)建和分離重組病毒，適于插人多個(gè)外源基因(可達(dá)0kb)，對(duì)插入的外源基因有較高的表達(dá)水平。禽類痘病毒，由于用該病毒接種哺乳動(dòng)物后，可以引起頓挫型感染，可以持續(xù)表達(dá)外源基因，并且不影響再次接種，日漸引起人們的關(guān)注。馬立克氏病毒gB基因的雞痘活載體疫苗免疫效果極佳，免疫雞用強(qiáng)毒攻擊100%不發(fā)病，用超強(qiáng)毒株擊90%不發(fā)病。病毒感染的廣譜性，使其它痘苗病毒活載體疫苗的應(yīng)用受到限制。痘病毒腺病毒載體對(duì)外源基因的容量較小，但它具有獨(dú)特的優(yōu)點(diǎn):①腺病毒比較安全。②腺病毒的靶細(xì)胞范圍廣，不僅能感染復(fù)制分裂細(xì)胞，而且能感染非復(fù)制分裂細(xì)胞。③腺病毒容易制備，對(duì)熱不敏感，在適合的培養(yǎng)系統(tǒng)中呈高滴度增殖。④腺病毒可以在腸道及呼吸道繁殖，能誘導(dǎo)粘膜免疫，能制成藥囊經(jīng)口服途徑接種以預(yù)防消化道及呼吸道感染。(5)Ad2,Ad5等啟動(dòng)子較強(qiáng)，能高水平表達(dá)外源基因，特別是換以更強(qiáng)的啟動(dòng)子。腺病毒缺失E1區(qū)的人腺病毒必須在特殊的工程細(xì)胞中或非缺失的腺病毒輔助下才能復(fù)制增殖，因此稱為病毒缺陷型載體?！暗谝淮俨《据d體”(應(yīng)包括E3或El+E3同時(shí)缺失)目前應(yīng)用最為廣泛，由于缺失復(fù)制必須區(qū)，腺病毒只能在表達(dá)El基因產(chǎn)物的細(xì)胞中復(fù)制。E1區(qū)可被去除5.5Kb，外源基因的插人容量可達(dá)7.5Kb。常規(guī)的構(gòu)建方法是在E1區(qū)插入一個(gè)表達(dá)盒，其中包括啟動(dòng)子，外源基因和polyA序列。腺病毒幾乎所有的哺乳動(dòng)物都存在皰疹病毒，某些疤疹病毒對(duì)畜牧業(yè)構(gòu)成嚴(yán)重的危害，如偽狂犬病毒。皰疹病毒的基因組較大，約150kb左右，預(yù)計(jì)含有約70個(gè)編碼基因，其中至少有20%的基因是非必需基因，可容納多個(gè)外源基因的插入。許多皰疹病毒經(jīng)粘膜途徑感染，構(gòu)建的載體活疫苗可經(jīng)粘膜途徑提呈抗原，誘導(dǎo)特異性粘膜免疫。皰疹病毒活載體主要有單純疤疹病毒、偽狂犬病毒、火雞疤疹病毒、牛疤疹病毒I型、馬疤疹病毒I型和傳染性喉氣管炎病毒等皰疹病毒小RNA病毒科中的脊髓灰質(zhì)炎病毒(PV)Sabin疫苗株在實(shí)際應(yīng)用中證明安全、可口服，并且易增殖，感染滴度高。可以將Pi區(qū)中的部分氨基酸缺失掉，代之以外源性病毒保護(hù)性抗原決定族，形成嵌合病毒粒子。脊髓灰質(zhì)炎病毒作為載體與前面所述的病毒活載體有所不同，前述載體系將外源性保護(hù)性抗原分泌到載體病毒粒子以外，而脊髓灰質(zhì)炎病毒載體表達(dá)的外源性病毒蛋白則以嵌合的形式存在于載體病毒顆粒的表面。小RNA病毒以負(fù)鏈RNA病毒，如流感病毒，作為載體的研究亦已嘗試多年，并取得重大進(jìn)展。流感病毒RNA沒有感染性，不能自行復(fù)制。流感病毒核糖核蛋白體(RNP)的重組及轉(zhuǎn)染系統(tǒng)，即用提純的病毒轉(zhuǎn)染進(jìn)已被輔助病毒感染的細(xì)胞。重組流感病毒RNA表達(dá)質(zhì)粒中，流感病毒的非結(jié)構(gòu)蛋白基因被外源基因的反義序列取代，當(dāng)質(zhì)粒轉(zhuǎn)錄后，重組病毒RNA與核蛋白和RNA聚合酶重建成為RNP，在流感病毒依賴RNA的RNA聚合酶作用下，外源基因的反義序列即被轉(zhuǎn)錄成為正義鏈，并隨病毒的復(fù)制而表達(dá)。流感病毒人免疫缺陷病毒(HIV)MN株gpl20抗原上V3環(huán)中的12肽核酸序列，插人流感病毒A/WSN/33株血凝素B抗原位點(diǎn)的突出環(huán)狀結(jié)構(gòu)上，構(gòu)建成嵌合體病毒能夠誘導(dǎo)小鼠產(chǎn)生HIV特異性抗體。由于流感病毒可以同時(shí)誘導(dǎo)體液免疫和細(xì)胞免疫，并能產(chǎn)生IgA介導(dǎo)的粘膜免疫，因此，有希望成為新型的高效活疫苗。流感病毒某些病毒的胸腺激酶基因(TK)是常被缺失的非必需基因。將痘苗病毒TK基因缺失后，其毒力大大減弱。單純疤疹病毒(HSV)的TK