醫(yī)學(xué)碩士答辯歐琴答辯課件

EBVLMP2B細(xì)胞表位的預(yù)測(cè)、克隆、表達(dá)及其融合蛋白免疫原性的初步研究答辯人：歐琴導(dǎo)師：張麗芳教授夏克棟教授專業(yè)：病原生物學(xué)2007.5.17主要內(nèi)容◆

研究背景◆研究目的◆研究方案◆結(jié)果◆分析與討論◆結(jié)論研究背景

EB病毒(Epstein-Barrvirua,EBV)屬于γ皰疹病毒科。引起的主要疾病包括傳染性單核細(xì)胞增多癥、移植后淋巴細(xì)胞增多癥(PTLD)、霍奇金病、Burkitt淋巴瘤以及鼻咽癌(NPC)。研究背景

LMP2不是轉(zhuǎn)化基因，維持EBV潛伏感染。

LMP2成為NPC等EBV相關(guān)腫瘤治療的理想靶抗原之一。研究背景表位疫苗是目前研制感染性疾病與惡性腫瘤疫苗的方向。多表位疫苗能選擇性誘導(dǎo)多價(jià)、多特異性應(yīng)答和控制免疫應(yīng)答類型。研究背景NPC患者血清中能檢測(cè)LMP2抗體。B細(xì)胞表位的研究為單克隆抗體的制備提供更充分的依據(jù)，以B細(xì)胞表位為基礎(chǔ)的多肽抗原可用于血清學(xué)檢測(cè)。

研究方案一、EBVLMP2的二級(jí)結(jié)構(gòu)分析和B細(xì)胞表位預(yù)測(cè)研究方案采用EXPASY服務(wù)器提供的SwissProt蛋白質(zhì)數(shù)據(jù)庫(kù)檢索LMP2完整蛋白質(zhì)的氨基酸序列();采用EXPASY服務(wù)器提供的SOPMA、GOR、nnPredict、HNN方法預(yù)測(cè)LMP2二級(jí)結(jié)構(gòu)()；采用EXPASY服務(wù)器提供的SOSUI方法預(yù)測(cè)LMP2跨膜區(qū)域()；采用EXPASY服務(wù)器提供的Hopp&Woods、Emini、Jameson-Wolf、Zimmerman方法預(yù)測(cè)LMP2的親水性、表面可及性、抗原性、極性及柔韌性參數(shù)()；對(duì)上述方法預(yù)測(cè)的結(jié)果進(jìn)行綜合分析，推斷LMP2的B細(xì)胞表位，并用吳玉章等建立的抗原性指數(shù)(AI)綜合評(píng)判EBVLMP2的B細(xì)胞優(yōu)勢(shì)表位。◆◆◆◆◆研究方案二、EBVLMP2B細(xì)胞表位的克隆、表達(dá)及其融合蛋白的純化研究方案引物堿基序列酶切位點(diǎn)OZLF-675’TCGAGTTACAGCAGGCTGTTAABamHIAGGGCGGATCTTCGATGCGG3’OZLF-685’GATCCCGCATCGAAGATCCGCCXhoICTTTAACAGCCTGCTGTAAC3’OZLF-695’TCGAGTTAAGTGAGATTTAAGGTG3’BamHIOZLF-705’GATCCACCTTAAATCTCACTTAAC3’XhoIOZLF-715’TCGAGTTAATTCGGGATAAATTCBamHITGTGCTGGACAATGATTTG3’OZLF-725’GATCCAAATCATTGTCCAGCACAXhoIGAATTTATCCCGAATTAAC3’圖1pET32a/B細(xì)胞表位的重組質(zhì)粒圖研究方案研究方案層析純化蛋白：灌膠BufferB液調(diào)節(jié)吸光度和透光度樣本處理樣本加入層析柱中，收集濾液BufferB液洗滌，至A＜0.01，收集濾液BufferD液洗滌，至A＜0.01，收集濾液BufferE液洗滌，至A＜0.01，收集濾液樣本收集SDS分析濾液中目的蛋白分布情況BufferB:8M尿素(pH8.0)BufferD:8M尿素(pH6.8)BufferE:8M尿素(pH4.0)研究方案動(dòng)物：ICR小鼠免疫方式：背部皮下多點(diǎn)注射采血方式：眶靜脈采血，3只/組表2動(dòng)物實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)組別數(shù)量(只)蛋白劑量(ug/只)注射時(shí)間取血時(shí)間

Ⅰ9ozlf-67500、2、3W2、3、6WⅡ9ozlf-69500、2、3W2、3、6WⅢ9ozlf-71500、2、3W2、3、6WⅣ9Ｈis蛋白500、2、3W2、3、6WⅤ9PBS0、2、3W2、3、6W研究方案ELISA檢測(cè)：以純化的融合蛋白作包被抗原以B95.8細(xì)胞作包被抗原選擇抗原性強(qiáng)的融合蛋白作包被抗原，檢測(cè)NPC組、CA疾病對(duì)照組和健康對(duì)照組的血清特異性抗體結(jié)果一、EBVLMP2的二級(jí)結(jié)構(gòu)分析和B細(xì)胞表位預(yù)測(cè)結(jié)果aa144～150202～208265～268318～322375～390445～455

圖2按SOSUI程序預(yù)測(cè)EBVLMP2蛋白跨膜區(qū)膜內(nèi)區(qū)域跨膜區(qū)膜外區(qū)域結(jié)果圖3各種不同參數(shù)對(duì)EBVLMP2的預(yù)測(cè)結(jié)果a.親水性參數(shù)b.極性參數(shù)c.柔韌性參數(shù)d.表面可及性e.抗原性

二級(jí)結(jié)構(gòu)10～82,89～108,116～126,142～149,198～206,288～295,317～321,339～348,379～389,414～422,481～497

膜外區(qū)域

144～150,202～208,265～268,318～322,375～390,445～455

親水性

15～26,36～41,43～60,65～74,90～96,101～119,176～179,199～205,236～242,414～416,483～492

表面可及性13～18,20～22,25～32,39～64,67～82,90～92,95～112,114～116,73～178

199～201,203～204,235～240,378～380,383～384,416～420,484～496

抗原性10～83,88～109,111～121,174～179,198～207,235～241,290～293,340～348,380～387,413～421,471～476,483～491

極性

20～23,45～55,57～59,65～74,90～94,102～117,198～203,234～342,483～491

柔韌性

10～85,89～121,199～205,218～222,236～244,289～296,342～347,370

～378,381～383,385～388,412～420,483～493預(yù)測(cè)方法預(yù)測(cè)結(jié)果結(jié)果表3應(yīng)用不同方法預(yù)測(cè)EBVLMP2蛋白B細(xì)胞表位的肽段位置二、EBVLMP2B細(xì)胞表位的克隆、表達(dá)及其融合蛋白的純化結(jié)果結(jié)果圖4重組質(zhì)粒pET32a/ozlf-67酶切鑒定1:λDNA/HindⅢDNAMarker;2.pET32a/ozlf-67;3:pET32a/ozlf-67/EcoRI;4:pET32a(+);5:pET32a(+)/EcoRI圖5重組質(zhì)粒pET32a/ozlf-69酶切鑒定1:λDNA/HindⅢDNAMarker;2.pET32a/ozlf-69;3:pET32a/ozlf-69/EcoRI;4:pET32a(+);5:pET32a(+)/EcoRI圖6重組質(zhì)粒pET32a/ozlf-71酶切鑒定1:λDNA/HindⅢDNAMarker;2.pET32a/ozlf-71;3:pET32a/ozlf-71/EcoRI;4:pET32a(+);5:pET32a(+)/EcoRI重組質(zhì)粒酶切鑒定結(jié)果ozlf-67、ozlf-69、ozlf-71融合蛋白和His蛋白的純化圖9純化的ozlf-67蛋白SDS電泳分析1：蛋白分子標(biāo)準(zhǔn)物；2：樣品穿透液；3：BufferB液濾液；4：BufferC液濾液；5-7：BufferE液濾液圖10純化的ozlf-69蛋白SDS電泳分析1：蛋白分子標(biāo)準(zhǔn)物；2：樣品穿透液；3：BufferB液濾液；4：BufferC液濾液；5-8：BufferE液濾液圖11純化的ozlf-71蛋白SDS電泳分析1：蛋白分子標(biāo)準(zhǔn)物；2：樣品穿透液；3：BufferB液濾液；4：BufferC液濾液；5-6：BufferE液濾液圖12純化的His蛋白SDS電泳分析1：蛋白分子標(biāo)準(zhǔn)物；2：樣品穿透液；3：BufferB液濾液；4：BufferC液濾液；5：BufferE液濾液結(jié)果結(jié)果三、EBVLMP2B細(xì)胞表位融合蛋白免疫原性的初步研究結(jié)果圖13不同免疫原在不同時(shí)間的抗體均值（X±SD）

分別包被3種表位融合蛋白o(hù)zlf-67、ozlf-69和ozlf-71，分別檢測(cè)3種表位融合蛋白的免疫血清與His蛋白免疫血清的抗體效價(jià)差異。

結(jié)果圖14多肽表位誘導(dǎo)鼠免疫血清的抗體效價(jià)的ELISA檢測(cè)結(jié)果**：與His蛋白免疫組比較**結(jié)果

B95.8細(xì)胞作為包被抗原，ELISA檢測(cè)3種表位融合蛋白免疫小鼠制備的鼠血清抗體效價(jià)。

圖15B95.8細(xì)胞包被ELISA檢測(cè)鼠免疫血清抗體效價(jià)*

：與His蛋白免疫組比較***結(jié)果

選用Ozlf-67融合蛋白為診斷抗原，ELISA檢測(cè)NPC組、CA疾病對(duì)照組及健康對(duì)照組血清特異性IgG抗體。圖16ozlf-67蛋白包被ELISA檢測(cè)病人血清抗體效價(jià)*：與正常組比較*結(jié)果分組份數(shù)A值陽(yáng)性陰性陽(yáng)性率NPC組480.866±0.231

341370.8％CA組680.140±0.1064645.9％正常組680.184±0.0670680表5ozlf-67蛋白包被ELISA檢測(cè)病人血清抗體陽(yáng)性率**與正常組比較*分析與討論預(yù)測(cè)的B細(xì)胞表位是線性B細(xì)胞表位，主要的參數(shù)有二級(jí)結(jié)構(gòu)、跨膜區(qū)、親水性、表面可及性、抗原性以及柔韌性等，抗原性和親水性是形成表位的首要條件，因而優(yōu)勢(shì)表位的形成是多種因素綜合作用的結(jié)果。分析與討論采用分子生物學(xué)方法分別得到了包含預(yù)測(cè)表位片段的重組質(zhì)粒，并得到了融合蛋白，為進(jìn)一步表位融合蛋白的免疫學(xué)檢測(cè)奠定基礎(chǔ)。分析與討論3種表位融合蛋白均具有良好的免疫原性B細(xì)胞表位多肽均能誘導(dǎo)產(chǎn)生特異性抗體以B95.8細(xì)胞作為抗原包被酶標(biāo)板，B細(xì)胞表位融合蛋白誘導(dǎo)的小鼠免疫血清與EBV抗原特異性結(jié)合，但抗體效價(jià)較低，可能是由于單個(gè)表位肽的結(jié)合能力較弱。分析與討論

選用Ozlf67融合蛋白為診斷抗原，ELISA檢測(cè)NPC患者血清特異性抗體，用于NPC的血清學(xué)診斷