遺傳毒性評價(jià)課件

微核制片技術(shù)及其應(yīng)用(誘變劑的遺傳毒性評價(jià))

一、實(shí)驗(yàn)?zāi)康?/p>

了解微核檢測的原理和毒理遺傳學(xué)意義。掌握蠶豆根尖微核（或細(xì)胞電泳）監(jiān)測環(huán)境污染的一般方法。3.學(xué)會(huì)利用微核測試系統(tǒng)評價(jià)環(huán)境物質(zhì)的遺傳毒理效應(yīng)。二、實(shí)驗(yàn)原理（微核技術(shù)）1、微核（micronuclei,MCN）：是真核類生物細(xì)胞經(jīng)輻射或化學(xué)藥物的作用而產(chǎn)生的一種游離于主核之外的異常核結(jié)構(gòu)。在細(xì)胞間期微核呈圓形或橢圓形，大小為主核1/3以下。微核的折光率及細(xì)胞化學(xué)反應(yīng)性質(zhì)和主核一樣，也具合成DNA的能力。

2、微核的形成機(jī)理：許多理化因素，如輻射、化學(xué)藥劑等作用于分裂細(xì)胞，引起染色體斷裂或干擾染色體行為使之在有絲分裂過程中行動(dòng)滯后，末期未能進(jìn)入主核，當(dāng)子細(xì)胞進(jìn)入下一次分裂間期時(shí)，便濃縮形成獨(dú)立于主核之外的小核——微核。3、微核率的大小與用藥劑量或輻射累積效應(yīng)呈正相關(guān)，因此，可在間期進(jìn)行微核的觀察和計(jì)數(shù)來檢測染色體畸變水平，指示染色體或紡錘體的損傷程度微核是常用的遺傳毒理學(xué)指標(biāo)之一。4、微核測試已用于輻射損傷、輻射防護(hù)、化學(xué)誘變劑、新藥試驗(yàn)、染色體遺傳疾病及癌癥前期診斷等方面微核成因化學(xué)致突變物染色體作用于紡錘絲無著絲點(diǎn)，片或環(huán)整條染色體帶著絲粒的環(huán)和斷片于細(xì)胞分裂末期細(xì)胞質(zhì)中形成微核微核的形成70年代初，Matter和Schmid首先用嚙齒類動(dòng)物骨髓細(xì)胞微核率來測定疑有誘變活力的化合物，建立了微核測定法。此后，微核測定逐漸從動(dòng)物、人擴(kuò)展到植物領(lǐng)域。人和動(dòng)物的微核測試多用一定培養(yǎng)條件與時(shí)間下的骨髓和外周血細(xì)胞，但細(xì)胞同步化困難，微核率低，約0.2%。如用高等植物花粉，利用其天然的同步性作微核測試材料，效果較好，其中70年代末Te-HsiuMa用一種原產(chǎn)于美洲的鴨跖草，建立的四分孢子期微核率計(jì)數(shù)（MCN-in-tetrad）的測試系統(tǒng)是較好的系統(tǒng)之一。華中師范大學(xué)生物系自1983年開始，建立了一套蠶豆根尖微核測試系統(tǒng)，并首次用于監(jiān)測水環(huán)境污染，經(jīng)鑒定已列入國家《生物監(jiān)測技術(shù)規(guī)范（水環(huán)境部分）》。美國國家環(huán)保局也肯定了蠶豆根尖微核試驗(yàn)在環(huán)境突變性檢測中的作用，對許多環(huán)境致癌物都作了標(biāo)準(zhǔn)化的試驗(yàn)，建立了龐大的數(shù)據(jù)庫，可以推廣。三、實(shí)驗(yàn)用具1、材料：蠶豆（Viciafaba,2n=12）干種子蠶豆根尖細(xì)胞的染色體大、數(shù)量少，DNA含量高，根尖中含有較多的分裂相細(xì)胞，對誘變因子反應(yīng)敏感，且容易觀察，是理想的遺傳毒理分析材料。

1mol/L鹽酸、甲醇、冰醋酸、改良苯酚品紅染液；NaN3（疊氮鈉）、EMS（甲基磺酸乙酯）、DES（硫酸二乙酯）等化學(xué)誘變劑等；紫外線、微波等物理誘變因子。3、藥品和試劑1、浸種催芽：25℃下浸泡24h，吸脹后，用河沙作發(fā)芽床，25℃培養(yǎng)箱中催芽12～24h，初生根長出2～3mm時(shí)，取發(fā)芽良好的種子，放入鋪滿濾紙的瓷盤中，25℃繼續(xù)催芽，大部分根長至1～2cm（約36~48h）。2、染毒：用被檢測液處理根尖。每處理選6～8粒初生根生長良好、根長一致的種子，放入培養(yǎng)皿中，用被檢測液浸沒根尖。陽性因子可采用NaN3和紫外線等，0.2、0.4、0.8mmol/LNaN3溶液。紫外線分別處理20、40、60min。另外可取一處污水作被檢液之一。用自來水（或蒸餾水）處理作對照。處理根尖12～24h。3、根尖細(xì)胞恢復(fù)培養(yǎng)：處理后的種子用自來水（或蒸餾水）浸洗三次，每次2～3min。洗凈后置入輔有濕潤濾紙的瓷盤中，25℃下恢復(fù)培養(yǎng)22～24h。四、實(shí)驗(yàn)操作流程4、根尖細(xì)胞固定并保存：切取恢復(fù)后的1cm長的幼根，甲醇：冰醋酸（3：1）液固定24h。置70%的乙醇中保存于4℃冰箱中。5、解離：加入1mol/L鹽酸浸沒幼根10min，使幼根軟化。解離前后用蒸餾水清洗干凈。6、染色、壓片：截取1～2mm長的根尖置載玻片上，滴一滴染液，染色5～8min，加上蓋玻片，壓片。7、鏡檢觀察、計(jì)數(shù)：首先在低倍鏡下找到分生組織區(qū)細(xì)胞分散均勻，分裂相較多的部位，再轉(zhuǎn)高倍鏡觀察。每一處理觀察3個(gè)根尖，每個(gè)根尖數(shù)1000個(gè)細(xì)胞，統(tǒng)計(jì)其中含微核的細(xì)胞數(shù)，然后平均，即為該處理的MCN‰，即微核千分率。處理觀察的細(xì)胞數(shù)微核數(shù)總計(jì)微核‰NaN3(mmol/L)0.20.40.8紫外線(min)204060蠶豆根尖微核檢測記錄表注：以小組為單位統(tǒng)計(jì)平均微核千分率。處理觀察的細(xì)胞數(shù)微核數(shù)總計(jì)微核‰NaN3(mmol/L)0.20.40.8蒸餾水計(jì)算各測試樣品（包括對照）的微核千分率（MCN‰）：

樣品污染（中毒）程度的確定：MCN‰﹤10‰，基本沒有污染（中毒）；10‰MCN‰18‰，輕度污染（中毒）；18‰﹤MCN‰﹤30‰，中度污染（中毒）；MCN‰﹥30‰，重度污染（中毒）。某樣品或?qū)φ沼^察到的微核數(shù)某樣品或?qū)φ沼^察到的細(xì)胞數(shù)MCN‰=×1000‰“污染指數(shù)”判別（此方法可避免因?qū)嶒?yàn)條件等因素帶來的MCN‰本底的波動(dòng)）：

樣品實(shí)測微核平均千分率對照平均微核千分率0﹤PI﹤1.