核酸化學(xué)生物化學(xué)課件

第二章

核酸化學(xué)NucleicAcidchemistry第一節(jié)概述第二節(jié)核酸的化學(xué)組成第三節(jié)核酸的分子結(jié)構(gòu)第四節(jié)核酸的性質(zhì)第五節(jié)核酸的研究方法本章內(nèi)容第一節(jié)概述

核酸（nucleicacid—NA）是一類重要的生物大分子，擔(dān)負(fù)著生命信息的儲(chǔ)存與傳遞。核酸是現(xiàn)代生物化學(xué)、分子生物學(xué)的重要研究領(lǐng)域，是基因工程操作的核心分子。1944年Avery細(xì)菌轉(zhuǎn)化實(shí)驗(yàn)肺炎病菌有二種，一種是光滑型肺炎雙球菌：有莢膜、菌落光滑且有毒。這種菌通常外包有一層黏性發(fā)光的多糖莢膜，它是細(xì)菌致病性的必要成分，引起肺炎；另一種是粗糙型肺炎雙球菌：無(wú)莢膜、菌落粗糙且無(wú)毒。（a）將光滑型肺炎雙球菌注入小鼠體內(nèi)，使小鼠致死。

（b）將粗糙型肺炎雙球菌注入小鼠體內(nèi)，對(duì)小鼠無(wú)害。

（c）將光滑型肺炎雙球菌加熱殺死后，再注入小鼠體內(nèi)，對(duì)小鼠無(wú)害。

（d）將加熱殺死的光滑型肺炎雙球菌與粗糙型肺炎雙球菌一起注入小鼠體內(nèi)，小鼠死掉。這說(shuō)明粗糙型肺炎雙球菌變成了致死的光滑型肺炎雙球菌。暗示著被殺死的光滑型肺炎雙球菌中含有某種因子，它進(jìn)入了粗糙型肺炎雙球菌將它轉(zhuǎn)化成了致死的光滑型肺炎雙球菌。

（e）從加熱殺死的光滑型肺炎雙球菌中提取DNA，并且盡可能地將混在DNA中的蛋白質(zhì)除去，然后將除去了蛋白質(zhì)的DNA與粗糙型肺炎雙球菌混合后，再注入小鼠體內(nèi)，小鼠死掉。

1928年細(xì)菌學(xué)家Griffith細(xì)菌毒性實(shí)驗(yàn)

1952年美國(guó)Hershey噬菌體感染實(shí)驗(yàn)

DNA的遺傳作用的進(jìn)一步證明是來(lái)自A.Hershy和M.Chase的噬菌體感染大腸桿菌的研究。用放射性同位素32P標(biāo)記噬菌體DNA，使標(biāo)記的噬菌體感染大腸桿菌，經(jīng)短期保溫后，噬菌體就附著在細(xì)菌上。然后用攪拌器（10000轉(zhuǎn)/分）攪拌幾分鐘，使噬菌體與大腸桿菌分開(kāi)，再用高速離心機(jī)使細(xì)菌沉淀，分析沉淀和上清中的放射性（右圖）。用35S標(biāo)記噬菌體的蛋白質(zhì)外殼，進(jìn)行同樣的驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)。

實(shí)驗(yàn)結(jié)果是大多數(shù)噬菌體的DNA存在于細(xì)菌中，而外殼留在上清中。但是被感染的細(xì)菌內(nèi)部出現(xiàn)了奇跡。隨著被感染的細(xì)菌的培養(yǎng)，有的細(xì)菌破裂，釋放出很多噬菌體來(lái)。這說(shuō)明用于復(fù)制的遺傳信息通過(guò)病毒DNA，而不是通過(guò)病毒蛋白質(zhì)導(dǎo)入細(xì)菌內(nèi)的。

第二節(jié)核酸的化學(xué)組成

核酸是由幾十個(gè)甚至幾千萬(wàn)個(gè)核苷酸聚合而成的具有一定空間結(jié)構(gòu)的生物大分子。

基本元素：C、H、O、N、P；其中P的含量比較穩(wěn)定，占9%-10%，通過(guò)測(cè)定P的含量來(lái)推算核酸的含量（定磷法）。磷酸核苷堿基

戊糖

核酸→核苷酸

一、戊糖

組成核酸的戊糖有兩種。DNA所含的糖為β-D-2-脫氧核糖；RNA所含的糖則為β-D-核糖。2.嘧啶（Pyrimidine）胸腺嘧啶T胞嘧啶C尿嘧啶U

核酸中也存在一些不常見(jiàn)的稀有堿基。稀有堿基的種類很多，大部分是上述堿基的甲基化產(chǎn)物。二氫尿嘧啶（DHU）修飾堿基的簡(jiǎn)寫(xiě)符號(hào)

(為1時(shí)可以不寫(xiě))修飾核苷/稀有核苷修飾核苷包括三種情況:

（1）由修飾堿基和糖組成的核苷（2）由非修飾堿基和2'-O-甲基核糖組成的核苷（3）由堿基與糖連接方式特殊的核苷

（1）（2）二氫尿嘧啶核苷

(Am)（3）(ψ)例：四、核苷酸（nucleotide）

核苷酸：核苷+磷酸

戊糖+堿基+磷酸

H五、游離核苷酸及其衍生物的形式1.繼續(xù)磷酸化3.輔酶

NAD、NADP、FAD、HSCoA

FADNAD、NADPHSCoA4.GDP-半乳糖、GDP-葡萄糖等是糖蛋白

生物合成和多糖生物合成的活性糖

基供體。

結(jié)構(gòu)式5′-磷酸端（常用5′-P表示）；3′-羥基端（常用3′-OH表示）核苷酸鏈具有方向性，當(dāng)表示一個(gè)核苷酸鏈時(shí)，必須注明它的方向是5′→3′或是3′→5′。字母式5′PAPCPGPCPTPGPTPAOH3′

5′PACGCTGTAOH3′線條式OHDNA的一級(jí)結(jié)構(gòu)也可指DNA分子中堿基的順序。DNA的堿基順序本身就是遺傳信息存儲(chǔ)的分子形式。生物界物種的多樣性即寓于DNA分子中四種核苷酸千變?nèi)f化的不同排列組合之中。（二）DNA的二級(jí)結(jié)構(gòu)Watson和Crick于1953年提出了DNA雙螺旋結(jié)構(gòu)模型，說(shuō)明了DNA的二級(jí)結(jié)構(gòu)。（即B型DNA）（1）Chargaff定則

（1950s,E.Chargaff發(fā)現(xiàn)）DNA堿基組成符合：A=T；G=C；

A+G=T+C。不對(duì)稱比率：A+T/G+C；物種不同，DNA堿基組成不同；物種親緣愈接近，堿基組成也愈接近，該比率越相近似。Ⅲ.具有種的特異性，沒(méi)有器官和組織的特異性，年齡、營(yíng)養(yǎng)狀況、環(huán)境的改變不影響DNA的堿基組成。1．提出DNA雙螺旋結(jié)構(gòu)模型的根據(jù)

（2）x-光衍射分析20世紀(jì)40年代Astbury1952年M.Wilkins2．DNA雙螺旋結(jié)構(gòu)模型（double-helicalstructure）1953年Watson和Crick提出了DNA雙螺旋結(jié)構(gòu)。DNA雙螺旋結(jié)構(gòu)模型要點(diǎn)（1）螺旋中的兩條鏈反向平行，即其中一條鏈的方向?yàn)?′→3′，而另一條鏈的方向?yàn)?′→5′，兩條鏈共同圍繞一個(gè)假想的中心軸呈右手雙螺旋結(jié)構(gòu)。DNA雙螺旋結(jié)構(gòu)模型要點(diǎn)（2）疏水的堿基位于雙螺旋的內(nèi)側(cè)，親水的磷酸和脫氧核糖基位于螺旋外側(cè)。堿基平面與螺旋軸垂直，脫氧核糖平面與中心軸平行。由于幾何形狀的限制，堿基對(duì)只能由嘌呤和嘧啶配對(duì)，即A與T，G與C。這種配對(duì)關(guān)系，稱為堿基互補(bǔ)。A和T之間形成兩個(gè)氫鍵，G與C之間形成三個(gè)氫鍵。T-A堿基對(duì)C-G堿基對(duì)DNA雙螺旋結(jié)構(gòu)模型要點(diǎn)（3）由于堿基對(duì)排列的方向性，使得堿基對(duì)占據(jù)的空間是不對(duì)稱的，因此，在雙螺旋的表面形成大小兩個(gè)凹槽，分別稱為大溝和小溝，二者交替出現(xiàn)。2.0nm小溝大溝DNA雙螺旋結(jié)構(gòu)模型要點(diǎn)（4）雙螺旋橫截面的直徑約為2nm，相鄰兩個(gè)堿基平面之間的距離（軸距）為0.34nm，每10個(gè)核苷酸形成一個(gè)螺旋，其螺距（即螺旋旋轉(zhuǎn)一圈）的高度）為3.4nm。2.0nm小溝大溝DNA雙螺旋結(jié)構(gòu)模型要點(diǎn)（5）兩條鏈借堿基之間的氫鍵和堿基堆積力（即堿基之間的范德華力）牢固的連接起來(lái)，維持DNA雙螺旋的三維結(jié)構(gòu)。兩條鏈?zhǔn)菈A基互補(bǔ)關(guān)系。3.DNA的雙螺旋結(jié)構(gòu)穩(wěn)定因素

氫鍵堿基堆積力磷酸基上負(fù)電荷被胞內(nèi)組蛋白或正離子中和堿基處于疏水環(huán)境中4.DNA的雙螺旋結(jié)構(gòu)的意義

該模型揭示了DNA作為遺傳物質(zhì)的穩(wěn)定性特征，最有價(jià)值的是確認(rèn)了堿基配對(duì)原則，這是DNA復(fù)制、轉(zhuǎn)錄和反轉(zhuǎn)錄的分子基礎(chǔ)，亦是遺傳信息傳遞和表達(dá)的分子基礎(chǔ)。該模型的提出是上個(gè)世紀(jì)生命科學(xué)的重大突破之一，它奠定了生物化學(xué)和分子生物學(xué)乃至整個(gè)生命科學(xué)飛速發(fā)展的基石。DNA雙螺旋構(gòu)象的類型（三）DNA的三級(jí)結(jié)構(gòu)---超螺旋1）超螺旋是指雙螺旋進(jìn)一步扭曲或再螺旋的構(gòu)象。2）正超螺旋（變緊，過(guò)旋）和負(fù)超螺旋（變松，欠旋）。3）人類46條染色體的DNA總長(zhǎng)可達(dá)1.7m，經(jīng)過(guò)螺旋化壓縮，實(shí)際總長(zhǎng)只有200nm。負(fù)超螺旋核小體盤繞及染色質(zhì)示意圖DNA的存在形式--核小體真核生物中DNA雙螺旋沿著組蛋白八聚體核心的短軸繞1.75圈，形成左手超螺旋，稱核小體。染色質(zhì)的基本結(jié)構(gòu)單位是核小體。串珠狀結(jié)構(gòu)進(jìn)一步卷曲形成螺線管，后者再進(jìn)一步卷曲形成超螺旋管，形成染色單體?；蚝突蚪M基因即一段有功能的DNA片段，生物細(xì)胞中DNA分子的最小功能單位（交換單位）。一個(gè)細(xì)胞或生物體所含的全套基因稱基因組。二、RNA的分子結(jié)構(gòu)（一）RNA的分類及特點(diǎn)（二）

RNA分子的結(jié)構(gòu)特點(diǎn)

（一）RNA的特點(diǎn)及分類結(jié)構(gòu)特點(diǎn)：1.堿基組成：A、G、C、U（A＝U/G≡C）；2.稀有堿基較多，穩(wěn)定性較差，易水解；3.多為單鏈結(jié)構(gòu)，少數(shù)局部形成螺旋（發(fā)夾結(jié)構(gòu)）；4.分子較小。分類：1.信使RNA（mRNA）2.轉(zhuǎn)運(yùn)RNA（tRNA）3.核糖體RNA（rRNA）MessengerRNA約占總RNA的3%-5%，含量最少，種類最多。成熟mRNA不含內(nèi)含子，hnRNA含有。mRNA從DNA轉(zhuǎn)錄遺傳信息，并作為蛋白質(zhì)合成的模板，決定蛋白質(zhì)的氨基酸順序。RibosomeRNA

約占全部RNA的80%，含量最多。與多種蛋白質(zhì)結(jié)合成核糖體，后者是合成蛋白質(zhì)的場(chǎng)所。原核生物真核生物核糖體rRNA核糖體rRNA

30s70s

50s16s5s、23s40s80s50s18s5s、5.8s、28sTransferRNA約占總RNA的10-15%，分子最小。它在蛋白質(zhì)生物合成中起翻譯mRNA信息，并將相應(yīng)的氨基酸轉(zhuǎn)運(yùn)到核糖體，參與蛋白質(zhì)體的合成。已知每一個(gè)氨基酸至少有一個(gè)相應(yīng)的tRNA。（二）RNA分子的結(jié)構(gòu)特點(diǎn)tRNA的結(jié)構(gòu)二級(jí)結(jié)構(gòu)特征：?jiǎn)捂溔~草葉形四臂四環(huán)三級(jí)結(jié)構(gòu)特征：在二級(jí)結(jié)構(gòu)基礎(chǔ)上進(jìn)一步折疊扭曲形成倒L型酵母tRNAAla的二級(jí)結(jié)構(gòu)

DHU環(huán)IGC反密碼子反密碼環(huán)氨基酸臂可變環(huán)TψC環(huán)CCAAla3′5′2）rRNA的分子結(jié)構(gòu)特征：?jiǎn)捂湥菪潭容^tRNA低

與蛋白質(zhì)組成核糖體后方能發(fā)揮其功能5SRNA的二級(jí)結(jié)構(gòu)3）mRNA的分子結(jié)構(gòu)在轉(zhuǎn)錄一章講授第四節(jié)核酸的性質(zhì)一、一般物理性質(zhì)二、核酸的水解三、兩性解離四、紫外吸收性質(zhì)五、穩(wěn)定性六、變性七、復(fù)性與雜交一、一般物理性質(zhì)1.DNA白色纖維狀固體，RNA白色粉末狀固體，都微溶于水，不溶于乙醇，因此常用乙醇來(lái)沉淀DNA；DNA溶液黏度大于RNA。2.DNA難溶于0.14mol/L的NaCl溶液，可溶于

1—2mol/L的NaCl溶液，RNA則相反，可據(jù)此分離二者。3.加熱條件下，

D－核糖＋濃鹽酸＋苔黑酚綠色

D－2－脫氧核糖＋酸＋二苯胺藍(lán)紫色二、核酸的水解核酸分子中的磷酸二酯鍵可在酸或堿性條件下水解切斷。DNA和RNA對(duì)酸或堿的耐受程度有很大差別。室溫條件下，DNA在堿中變性，但不水解，RNA水解。在細(xì)胞內(nèi)核酸分子受DNA酶作用。三、兩性解離核酸含酸性的磷酸基團(tuán)，又含弱堿性的堿基，為兩性電解質(zhì)，可發(fā)生兩性解離；核酸相當(dāng)于多元酸，pH大于4時(shí)，呈陰離子狀態(tài)；等電點(diǎn)四、紫外吸收在核酸分子中嘌呤堿和嘧啶堿都含有共軛雙鍵體系，在260nm有吸收；可以作為區(qū)別蛋白質(zhì)和對(duì)核酸及其組份定性和定量測(cè)定的依據(jù)，進(jìn)行核酸純度鑒定，也可作為核酸變性和復(fù)性的指標(biāo)。DNA的紫外吸收光譜天然DNA變性DNA核苷酸總吸收值1232202402602800.10.20.30.4波長(zhǎng)（nm）光吸收123根據(jù)A260/A280的比值判斷核酸樣品的純度純DNA：A260/A280=1.8純RNA：A260/A280=2.0（若樣品中含有雜蛋白或苯酚，則A260/A280比值明顯降低）純的核酸樣品可根據(jù)260nm的光吸收值算出其含量若260nm光吸收值為1相當(dāng)于50μg/ml雙螺旋DNA或相當(dāng)于40μg/ml單鏈DNA或RNA或相當(dāng)于20μg/ml寡核苷酸。五、DNA的穩(wěn)定性1.DNA的溶液呈粘稠狀，但實(shí)際上DNA的雙螺旋結(jié)構(gòu)僵直而有剛性，易斷成碎片，這也是目前難以獲得完整大分子DNA的原因。2.溶液狀態(tài)的DNA易受DNA酶作用而降解，抽干水分的DNA性質(zhì)十分穩(wěn)定。六、DNA的變性1.概念2.變性條件3.變性的特征1.概念是指核酸雙螺旋區(qū)的多聚核苷酸鏈間的氫鍵斷裂，變成單鏈結(jié)構(gòu)的過(guò)程。2.DNA的變性的條件能夠引起核酸變性的因素有：1）溫度升高；2）酸堿度改變、pH（>11.3或<5.0）；3）有機(jī)溶劑如甲醛和尿素、甲酰胺等；4）低離子強(qiáng)度。3.DNA變性的特征變性核酸將失去其部分或全部的生物活性。變性改變了DNA的二級(jí)結(jié)構(gòu)。核酸的變性并不涉及磷酸二酯鍵的斷裂，所以它的一級(jí)結(jié)構(gòu)(堿基順序)保持不變。DNA的變性過(guò)程是突變性的，它在很窄的溫度區(qū)間內(nèi)完成。DNA解鏈溫度紫外吸收值明顯增加，即增色效應(yīng)。粘度降低，沉降系數(shù)增加。DNA解鏈溫度（熔點(diǎn)，Tm

）當(dāng)50%的DNA變性時(shí)的溫度稱為該DNA的解鏈溫度，即增色效應(yīng)達(dá)到一半時(shí)的溫度；一般DNA的Tm值在70-85C之間。均一DNA（如病毒）的Tm值范圍較小。分子中G和C的含量越高，越不易變性，Tm值越高。可通過(guò)經(jīng)驗(yàn)公式計(jì)算：（G+C)%=(Tm-69.3)X2.44Tm值隨溶液鹽濃度增加而增大，Tm值較低，易變性，不易保存。溶解曲線與Tm。。影響Tm值的因素

①DNA的均一性

②DNA中G-C對(duì)的含量

經(jīng)驗(yàn)式:(G-C)%=(Tm-69.3)×2.44③鹽離子強(qiáng)度增色效應(yīng)與減色效應(yīng)天然DNA分子在熱變性條件下，雙螺旋結(jié)構(gòu)破壞，堿基暴露，在紫外光260nm波長(zhǎng)處的吸收度明顯增加，此現(xiàn)象稱為增色效應(yīng)。變性DNA分子復(fù)性形成雙螺旋結(jié)構(gòu)時(shí)其紫外吸收降低的現(xiàn)象稱為減色效應(yīng)。七、DNA的復(fù)性概念復(fù)性的條件3.影響復(fù)性的因素4.復(fù)性動(dòng)力學(xué)5.分子雜交1.概念1.變性DNA在適當(dāng)?shù)臈l件下，兩條彼此分開(kāi)的單鏈可以重新締合成為雙螺旋結(jié)構(gòu)，其物理性質(zhì)和生物活性隨之恢復(fù)，這一過(guò)程稱為復(fù)性；2.對(duì)于熱變性的DNA，在緩慢冷卻的條件下可重新結(jié)合恢復(fù)雙螺旋結(jié)構(gòu)，稱為退火。3.DNA復(fù)性后，一系列性質(zhì)將得到恢復(fù)，但是生物活性一般只能得到部分的恢復(fù)。DNA的復(fù)性圖示2.DNA的復(fù)性條件1.將熱變性的DNA驟然冷卻至低溫時(shí)，DNA不可能復(fù)性。即淬火。2.將變性的DNA緩慢冷卻時(shí)，可以復(fù)性。退火溫度＝Tm－25℃3.分子量越大復(fù)性越難。濃度越大，復(fù)性越容易。此外，DNA的復(fù)性需要一定的鹽濃度，也與它本身的組成和結(jié)構(gòu)有關(guān)。高于Tm值5℃

復(fù)性也稱退火

3.影響復(fù)性的因素

①樣品的性質(zhì)(G+C)

②DNA的濃度

③DNA片段的大小

④溫度

⑤離子強(qiáng)度

5.分子雜交1.在變性的DNA溶液中加入外源DNA單鏈分子或RNA單鏈分子（與原DNA具有同源性），去掉變性條件后復(fù)性形成雙螺旋結(jié)構(gòu)的過(guò)程。2.這樣形成的新分子稱為雜交DNA分子。3.利用核酸雜交可檢測(cè)特定的核苷酸片段或研究同源性等。分子雜交

探針：用于雜交的異源DNA或RNA序列，其核苷酸序列是人工特定的、已知的，經(jīng)放射性標(biāo)記的一條鏈。核酸的變性、復(fù)性和雜交變性（加熱）探針雜交（緩慢冷卻）復(fù)性（緩慢冷卻）分子雜交的種類SouthernBlot：DNA-DNA雜交NorthernBlot：DNA-RNA雜交WesternBlot：抗原-抗體進(jìn)行雜交原位雜交：活體組織上進(jìn)行雜交，顯出熒光Southern印跡法DNA分子限制片段限制性酶切割瓊脂糖電泳轉(zhuǎn)移至硝酸纖維素膜上與放射性標(biāo)記DNA探針雜交放射自顯影帶有DNA片段的凝膠凝膠濾膜用緩沖液轉(zhuǎn)移DNA吸附有DNA片段的膜第五節(jié)核酸的研究方法

一、核酸的分離、提取通則

為了得到完整的大分子核酸，一般要注意3點(diǎn)：1．保持低溫（0o～4℃）。2．防止過(guò)酸、過(guò)堿，避免劇烈攪拌。3．防止核酸酶的作用。

抑制DNase：可加檸檬酸鈉、EDTA等金屬螯合劑；或加去污劑十二烷基硫酸鈉（SDS）；或加蛋白變性劑。抑制RNase：（1）實(shí)驗(yàn)器皿高溫，或高壓滅菌，不能高壓滅菌的用具用0.1%二乙基焦碳酸鹽（diethylpyrocarbonate,