生物化學(xué)核酸化學(xué)課件

第一節(jié)核酸的概念、分類和功能

第二節(jié)核酸的組成和分子結(jié)構(gòu)

第三節(jié)DNA的結(jié)構(gòu)第五節(jié)核酸的性質(zhì)及分離、分析

第六節(jié)核酸的應(yīng)用第四節(jié)RNA的結(jié)構(gòu)第五章核酸化學(xué)第一節(jié)核酸的概念、分類和功能一、染色體和基因二、核酸概念和分類在生物細(xì)胞核中存在著一種能被堿性染料著色的螺旋集縮體。這是由核酸、組蛋白、非組蛋白等組成，稱此物質(zhì)為染色體。一、染色體和基因核酸：DNA-脫氧核糖核苷酸RNA-核糖核苷酸一、染色體和基因核糖核酸（ribonucleicacid-RNA）

轉(zhuǎn)移RNA(transferRNA-tRNA)

信使RNA(messengerRNA-mRNA)

核糖體RNA（ribosomalRNA-rRNA）脫氧核糖核酸（deoxyribonucleicacid-DNA）二、核酸的概念和分類真核生物原核生物

DNA細(xì)胞核（95%）線粒體、葉綠體（5%）核質(zhì)區(qū)（擬核）

RNA細(xì)胞質(zhì)（75%）線粒體、葉綠體（15%）細(xì)胞核（10%）細(xì)胞質(zhì)二、核酸的概念和分類核酸核苷酸磷酸核苷戊糖堿基水解核蛋白蛋白質(zhì)第二節(jié)核酸的組成和分子結(jié)構(gòu)

組成元素（C,H,O,N,P）核苷核酸核苷酸堿基許多個(gè)戊糖磷酸第二節(jié)核酸的組成和分子結(jié)構(gòu)

一、戊糖三、核苷二、堿基四、核苷酸第二節(jié)核酸的組成和分子結(jié)構(gòu)

五、核酸二、堿基1.嘧啶堿基2.嘌呤堿基核酸中的堿基分兩類：（1）嘧啶堿：胞嘧啶（C）尿嘧啶（U）胸腺嘧啶（T）（2）嘌呤堿：腺嘌呤（A）鳥嘌呤（G）二、堿基尿嘧啶U胸腺嘧啶T胞嘧啶CDNA特有RNA特有1.嘧啶堿基三、核苷1.核苷的結(jié)構(gòu)2.核苷的書寫核苷是一種糖苷，由戌糖和堿基縮合而成。糖與堿基之間以糖苷鍵相連接。糖的第一位上的碳原子（C1）與嘧啶堿的第一位上的氮原子（N1）或嘌呤堿的第九位上的氮原子（N9）相連，所以糖與堿基間的連鍵是N-C鍵，一般稱之為N-糖苷鍵。蛋白質(zhì)與糖連接時(shí)，天冬酰氨的氨基與半縮醛羥基間形成的為N-糖苷鍵。1.核苷的結(jié)構(gòu)糖與堿基之間以C-N糖苷鍵連接11191.核苷的結(jié)構(gòu)1．核苷酸的種類2．核苷酸的結(jié)構(gòu)與命名3．多磷酸核苷及其衍生物4．環(huán)核苷酸5．核苷酸的性質(zhì)四、核苷酸核苷中的戌糖羥基被磷酸酯化，就形成核苷酸作為DNA或RNA結(jié)構(gòu)單元的核苷酸分別是5′-磷酸-脫氧核糖核苷和5′-磷酸-核糖核苷。1．核苷酸的種類M-單(D-二；T－三）；P-磷酸RNA的名稱為某（單、二、三）磷酸核苷酸，DNA在某（單、二、三）前加脫氧兩字。如AMP稱腺苷－磷酸(或腺苷酸），dAMP稱為脫氧腺苷－磷酸（脫氧腺苷酸）。八種核苷酸的表示2．核苷酸的結(jié)構(gòu)與命名3．多磷酸核苷及其衍生物4．核苷酸的性質(zhì)堿基可以發(fā)生酮式和烯醇式的互變異構(gòu)，體內(nèi)以酮式為主。核苷酸在240～290nm具有強(qiáng)烈的光吸收，最大吸收波長在260nm左右。核苷酸是兩性電解質(zhì)，在不同的pH條件下，其解離程度不同，在某一pH值時(shí)，對(duì)外不表現(xiàn)出電性，該pH值稱為其等電點(diǎn)。一般物理性質(zhì)：各核苷酸殘基沿多核苷酸鏈排列的順序叫核酸的一級(jí)結(jié)構(gòu)。連接鍵：3，5一磷酸二酯鍵連接起來的直線形或環(huán)形分子。DNA沒有側(cè)鏈。一、DNA的一級(jí)結(jié)構(gòu)DNA字母簡寫:

5`

…

APGPCPTPGPCP…3`

或

5`

…

AGCTGC…3`一、DNA的一級(jí)結(jié)構(gòu)公認(rèn)的為1953年watson和crick提出的DNA雙螺旋結(jié)構(gòu)模型。二、DNA的二級(jí)結(jié)構(gòu)二、DNA的二級(jí)結(jié)構(gòu)1．B-DNA雙螺旋結(jié)構(gòu)模型的要點(diǎn)2．雙螺旋結(jié)構(gòu)的穩(wěn)定性3．DNA雙螺旋的不同類型（1）兩條多核苷酸鏈組成；反向平行（p5’-糖3’-p的結(jié)構(gòu)與p3’-糖5’-p的結(jié)構(gòu)相對(duì)）兩條鏈的糖－磷酸主鏈都是右手螺旋，有一共同螺旋軸1．B-DNA雙螺旋結(jié)構(gòu)模型的要點(diǎn)（2）兩條鏈上的堿基互補(bǔ)配對(duì)：A-T，C-G或T-A，G-C；A與T之間為二個(gè)氫鍵，C與G之間為三個(gè)氫鍵。1．B-DNA雙螺旋結(jié)構(gòu)模型的要點(diǎn)1．B-DNA雙螺旋結(jié)構(gòu)模型的要點(diǎn)雙螺旋的螺距為3.4nm，螺旋的直徑為2nm，相鄰堿基對(duì)平面間的距離是0.34nm。雙螺旋的每一轉(zhuǎn)有10對(duì)核苷酸，相鄰核苷酸之間的夾角為36°。

（3）螺旋表面有一條大溝和一條小溝大溝小溝1．B-DNA雙螺旋結(jié)構(gòu)模型的要點(diǎn)（4）1．B-DNA雙螺旋結(jié)構(gòu)模型的要點(diǎn)（5）堿基平面與雙螺旋的中心軸垂直，糖環(huán)平面與中心軸平行。1．B-DNA雙螺旋結(jié)構(gòu)模型的要點(diǎn)（6）雙螺旋結(jié)構(gòu)橫向靠氫鍵穩(wěn)定，縱向靠堿基堆積力維系穩(wěn)定。1．B-DNA雙螺旋結(jié)構(gòu)模型的要點(diǎn)（7）一個(gè)鏈的堿基順序確定后，則另一條鏈必有相對(duì)應(yīng)的堿基順序。堿基互補(bǔ)原則具有極重要意義，DNA復(fù)制、轉(zhuǎn)錄、反轉(zhuǎn)錄等過程的分子基礎(chǔ)都是堿基互補(bǔ)配對(duì)。ATGAACAGCTTCAATAAGGACGAGTTTGACTACTTGTCGAAGTTATTCCTGCTCAAACTG（1）氫鍵；（2）離子鍵及范德華力；（3）堿基堆積力；2．雙螺旋結(jié)構(gòu)的穩(wěn)定性（1）氫鍵：兩條鏈間堿基的相互作用，A與T之間為二條氫鍵，C與G之間為三條氫鍵。氫鍵作用力很弱，但DNA分子中存在大量氫鍵，因此氫鍵為一重要穩(wěn)定因素；2．雙螺旋結(jié)構(gòu)的穩(wěn)定性（2）離子鍵及范德華力：DNA分子中磷酸基因在生理?xiàng)l件下解離，使DNA成為一種多陰離子，這有利于它與帶正電荷的其它陽離子基團(tuán)發(fā)生靜電作用，這樣減少雙鏈間的靜電排斥，有利于雙螺旋的穩(wěn)定；（3）堿基堆積力：目前普遍認(rèn)為堆積堿基間的疏水作用是穩(wěn)定DNA結(jié)構(gòu)的更重要的因素。大量堿基層層堆積，兩相鄰堿基的平面十分貼近，于是使雙螺旋結(jié)構(gòu)內(nèi)部形成一個(gè)強(qiáng)大的疏水區(qū)，與介質(zhì)中的小分子隔開，有利于互補(bǔ)堿基之間氫鍵的形成；2．雙螺旋結(jié)構(gòu)的穩(wěn)定性3．DNA雙螺旋的不同類型B型DNA（B－DNA）:在相對(duì)濕度為92%時(shí)，所得到的DNA鈉鹽纖維；A型DNA（A－DNA）:在相對(duì)濕度低于75%時(shí)，獲得的DNA鈉鹽纖維；此外還有Z－DNA等；3．DNA雙螺旋的不同類型三、基因組基因組是指生物體的單倍體細(xì)胞核、細(xì)胞器或病毒粒子所含的全部DNA分子或RNA分子的總和。為了揭示生命奧秘，必須要測定生物體的基因組序列-基因組計(jì)劃。目前已經(jīng)完成了病毒、大腸桿菌、酵母、果蠅、玉米、水稻和人類基因組的測序，得出人類基因組的大小為3×109

bp，用于編碼蛋白質(zhì)的基因序列約為31000個(gè)，只占基因組的1.1%~1.4%。一、RNA的一級(jí)結(jié)構(gòu)二、RNA的高級(jí)結(jié)構(gòu)第四節(jié)RNA的結(jié)構(gòu)

1.一級(jí)結(jié)構(gòu)的定義2.一級(jí)結(jié)構(gòu)的特點(diǎn)一、RNA的一級(jí)結(jié)構(gòu)1.一級(jí)結(jié)構(gòu)的定義RNA的一級(jí)結(jié)構(gòu)指的是多核苷酸鏈中核糖核苷酸的排列順序，即多核苷酸鏈中堿基的排列順序。RNA也是無分支的線形結(jié)構(gòu)。含腺嘌呤、鳥嘌呤、胞嘧啶和尿嘧啶四種堿基，尚含有多種“稀有堿基”和特殊形式的核苷。其中以各種甲基化的堿基和“假尿嘧啶核苷”尤為豐富。假尿苷這些不尋常的成分可能與tRNA的生物學(xué)功能有一定的關(guān)系。1.一級(jí)結(jié)構(gòu)的定義含量:占總RNA的5%。存在：在細(xì)胞核中以DNA為模板被合成以后，可能暫存于核仁內(nèi)，也可能立即轉(zhuǎn)移到胞質(zhì)中，并以每分子mRNA與幾個(gè)或幾十個(gè)核蛋白體結(jié)合成串珠樣的多核蛋白體形式而存在。特點(diǎn)：一般都很不穩(wěn)定，代謝活躍，更新迅速，壽命較短，種類很多。功能:在蛋白質(zhì)生物合成中起傳遞遺傳信息的作用，故也叫信息RNA（iRNA）。2.一級(jí)結(jié)構(gòu)的特點(diǎn)（mRNA）真核單順反子5’-末端有“帽子”3’-末端有polyA片段原核多順反子5’-末端無“帽子”3’-末端無polyA片段順反子：

mRNA上具有翻譯功能的核苷酸順序。單順反子：只編碼一個(gè)蛋白質(zhì)的mRNA。polyA片段：指10～200個(gè)多聚腺苷酸，這與mRNA順利通過核膜進(jìn)入胞漿有關(guān)，也與mRNA從細(xì)胞核轉(zhuǎn)移到核糖體的過程有關(guān)，也有人認(rèn)為與病毒侵染性有關(guān)。“帽子”結(jié)構(gòu)：5’-末端的G被甲基化，通過焦磷酸與另一個(gè)發(fā)生了核糖上甲基化的核苷酸以5’、5’-磷酸二酯鍵相連,此結(jié)構(gòu)對(duì)mRNA的翻譯活性是重要的。2.一級(jí)結(jié)構(gòu)的特點(diǎn)（mRNA）2.一級(jí)結(jié)構(gòu)的特點(diǎn)（mRNA）含量：占細(xì)胞總RNA的75-80%。存在：與蛋白質(zhì)結(jié)合成核蛋白的形式，存在于細(xì)胞質(zhì)的核蛋白體中。功能：以核蛋白體的形式在蛋白質(zhì)生物合成中提供合適的工作場所。分子量:它的分子量都比較大，大腸桿菌核糖體中有三類rRNA（它們的沉降系數(shù)分別為5S、16S、23S）；動(dòng)物細(xì)胞核糖體rRNA有四類（5S、5.8S、18S和28S）。2.一級(jí)結(jié)構(gòu)的特點(diǎn)（rRNA）大腸桿菌5SRNA的結(jié)構(gòu)2.一級(jí)結(jié)構(gòu)的特點(diǎn)（rRNA）原核生物：是由30S和50S兩個(gè)亞基組成的70S的rRNA和蛋白質(zhì)聚合體，其中rRNA含66％。真核生物：是由60S和40S兩個(gè)亞基組成的80S的rRNA和蛋白質(zhì)聚合體，其中rRNA含60％。2.一級(jí)結(jié)構(gòu)的特點(diǎn)（rRNA）含量：約占細(xì)胞總RNA的10－15%。存在：tRNA溶于“胞液”部分中，它們以自由狀態(tài)或以氨基酸結(jié)合狀態(tài)而存在。分子量：由60～95個(gè)核苷酸殘基組成，都較小功能：蛋白質(zhì)的生物合成中起選擇性運(yùn)輸原料（氨基酸）的作用，因此把tRNA叫受體RNA。每種氨基酸都有對(duì)應(yīng)的一種或幾種tRNA。2.一級(jí)結(jié)構(gòu)的特點(diǎn)（tRNA）tRNA的三葉草型結(jié)構(gòu)特點(diǎn)（總）反密碼環(huán)二、RNA的高級(jí)結(jié)構(gòu)①氨基酸接受區(qū)（氨基酸臂）②二氫尿嘧啶區(qū)③反密碼區(qū)④TψC區(qū)⑤額外環(huán)（可變區(qū)）氨基酸臂二氫尿嘧啶區(qū)額外環(huán)TψC區(qū)tRNA分子中含有修飾堿基，但多少不等。在某些位置上的核苷酸對(duì)于所有的tRNA都是同樣的，或變化很少叫做不變核苷酸。稀有堿基二、RNA的高級(jí)結(jié)構(gòu)第五節(jié)核酸的性質(zhì)及分離、分析

一、核酸的理化性質(zhì)二、核酸的分離三、核酸的分析四、核酸測序的研究方法1．相對(duì)分子質(zhì)量2．粘度與沉降特性3．紫外吸收4．變性與復(fù)性5．熔解溫度6．克原子磷消光系數(shù)一、核酸的理化性質(zhì)純品DNA為白色纖維狀固體，RNA為白色粉末。

DNA、RNA及核苷酸為極性化合物，溶于水，不溶于有機(jī)溶劑。DNA能被乙醇和異戊醇沉淀。

核酸的物理特性核酸的兩性解離DNA和RNA都為兩性電解質(zhì)，具有等電點(diǎn)。核酸在pH>4時(shí)，帶負(fù)電荷等電點(diǎn)（pI）：pI＝pKa1＋pKa22

DNA的相對(duì)分子質(zhì)量較大，一般為106～109

bp，大多數(shù)DNA為線性分子，分子極不對(duì)稱，雖然其長度可達(dá)厘米級(jí)但分子的直徑只有納米級(jí)。RNA的相對(duì)分子質(zhì)量較小，通常為104～106

bp。1．相對(duì)分子質(zhì)量

DNA能被乙醇和異戊醇沉淀。DNA分子的粘度比RNA分子的粘度要大得多。不同相對(duì)分子質(zhì)量的核酸沉降速度不同。一般情況下，超螺旋DNA>環(huán)狀DNA>線形DNA。

2．粘度與沉降特性嘌呤堿與嘧啶堿有共軛雙鍵，使堿基核苷、核苷酸和核酸在240～290nm紫外波段有一強(qiáng)烈的吸收峰，最大吸收值在260nm附近。3．紫外吸收4．變性與復(fù)性（變性）定義：指核酸雙螺旋區(qū)氫鍵斷裂，變成單鏈，它并不涉及共價(jià)鍵（磷酸二酯鍵）的斷裂。變性因素：熱變性、酸堿變性和化學(xué)變性等。定義：變性DNA在適當(dāng)條件下，又可使兩條彼此分開的鏈重新締合成雙螺旋結(jié)構(gòu)。高溫變性緩慢冷卻熱復(fù)性退火4．變性與復(fù)性（復(fù)性）DNA復(fù)性后，許多物化性質(zhì)又得到恢復(fù)，生物活性可以得到部分恢復(fù)。但將熱變性的DNA驟然冷卻，不能復(fù)性，只有緩慢冷卻時(shí)才可以復(fù)性。高溫變性緩慢冷卻熱復(fù)性急速冷卻復(fù)性失敗4．變性與復(fù)性（復(fù)性）4．變性與復(fù)性（復(fù)性）影響核酸復(fù)性速度的因素很多：①核酸濃度越高，隨機(jī)碰撞的頻率越高，復(fù)性速度越快。②核酸分子越大，鏈間錯(cuò)配頻率越高，復(fù)性速度越慢。③核酸鏈內(nèi)重復(fù)序列多，易形成互補(bǔ)配對(duì)，復(fù)性速度較快。④維持一定的溶液離子強(qiáng)度，消弱磷酸基靜電斥力，可加快復(fù)性速度。⑤選擇最佳的復(fù)性溫度，溫度太高會(huì)使核酸發(fā)生變性，而溫度過低會(huì)使錯(cuò)配的兩鏈無法分開。通常把DNA的雙螺旋結(jié)構(gòu)失去一半時(shí)的溫度稱該DNA的溶點(diǎn)或溶解溫度，用Tm表示，DNA的Tm值一般在70～850C之間。變性的相對(duì)量溫度0C60801001.01.21.41.60TmTmTm100%Polyd(A-T)Polyd(G-C)DNA5．熔解溫度

Tm值的大小與下列因素有關(guān)：

（1）DNA的均一性（2）G-C含量（3）介質(zhì)中的離子強(qiáng)度5．熔解溫度（1）DNA的均一性：一般均一性越高，Tm值的變動(dòng)范圍越小。（2）G-C含量：G-C含量越高，Tm值越大，Tm與G-C含量成正比關(guān)系。因?yàn)镚-C比A-T更穩(wěn)定（氫鍵）。Tm與所含G-C的多少的關(guān)系，可用經(jīng)驗(yàn)公式計(jì)算不同DNA的Tm：

（G＋C）％＝(Tm－69.3)×2.445．熔解溫度（3）介質(zhì)中的離子強(qiáng)度：一般離子強(qiáng)度較低，DNA的Tm值也較低，范圍也越窄。溫度0C70801001.21.41.5901.11.3

A2600.010.020.050.20.10.51.0大腸桿菌DNA在不同KCl濃度下的Tm5．熔解溫度6．摩爾磷吸光系數(shù)核酸分子中磷原子的含量基本穩(wěn)定。根據(jù)磷的含量測定核酸溶液的吸光度，以每升核酸溶液中一摩爾磷為標(biāo)準(zhǔn)來計(jì)算核酸的吸光系數(shù)，就叫做摩爾磷吸光系數(shù)，用ε（P）表示。二、核酸的分離核酸的分離原則：盡量簡化操作，縮短提取過程；減少化學(xué)物質(zhì)對(duì)核酸的降解；減少核酸的生物降解；減少物理因素對(duì)核酸的降解。二、核酸的分離核酸的分離方法：細(xì)胞裂解；酶處理；核酸的分離提純：鹽提取法酚提取法層析法。三、核酸的分析純DNA的OD260/280≥1.8。純RNAOD260/280≥2.0，如果樣品中含有雜蛋白，比值會(huì)明顯下降。如果OD260/230≥1.8時(shí)樣品是純的，否則樣品中含有雜多糖。通常1.0OD相當(dāng)于50μg/mL的雙螺旋DNA或40μg/mL單鏈DNA（或RNA）。紫外法1977年兩位學(xué)者分別提出了化學(xué)斷裂法和雙脫氧鏈終止法。這兩種方法的基本原理相同，都是用不同的專一性手段使被分析的DNA分子斷裂成若干帶放射性標(biāo)記的、長短不一的片段，然后用測DNA片段的相對(duì)長度來測核苷酸的順序。四、核酸測序的研究方法Sanger雙脫氧鏈終止法四、核酸測序的研究方法Gilbert化學(xué)斷裂法四、核酸測序的研究方法DNA片段一端用放射性標(biāo)記，用堿基特異性的化學(xué)反應(yīng)裂解DNA，通過標(biāo)定末端與斷裂位點(diǎn)之間的距離來確定堿基的位置。四、核酸測序的研究方法最新的測序方法：焦磷酸測序技術(shù)：

Roche公司的GSFLX系統(tǒng)（454系統(tǒng)）；橋擴(kuò)增測序技術(shù)：

Illumina公司的GenomeAnalyzer系統(tǒng)（Solexa系統(tǒng)）；連接測序技術(shù)：

ABI公司的SOLiD系統(tǒng)；第六節(jié)核酸的應(yīng)用研究

一、人類基因組計(jì)劃二、分子雜交三、小RNA和微小RNA四、反義RNA一、人類基因組計(jì)劃1990年，美國國會(huì)批準(zhǔn)美國的“人類基因組計(jì)劃”于10月1日正式啟動(dòng)。美國的人類基因組計(jì)劃總體規(guī)劃是：擬在15年內(nèi)至少投入30億美元，進(jìn)行對(duì)人類全基因組的分析。一、人類基因組計(jì)劃2003年4月l4日，美、英、日、德、法、中六國首腦發(fā)表了“人類基因組聯(lián)合宣言”，宣告“人類基因組計(jì)劃”提前完成。一、人類基因組計(jì)劃美國：WASH＆MIT等研究中心，貢獻(xiàn)率為54％；英國：SANGER等研究中心，貢獻(xiàn)率為33％；日本：RIKEN等研究中心，貢獻(xiàn)率為7％；法國：GENOSCOPE研究中心，貢獻(xiàn)率為2.8％；德國：IMB等研究中心，貢獻(xiàn)率為2.2％；中國：華大基因等，貢獻(xiàn)率為1％；一、人類基因組