生物化學(xué)檢驗(yàn)技術(shù)研究進(jìn)展新課件

生物化學(xué)檢驗(yàn)技術(shù)研究進(jìn)展

主要內(nèi)容生化檢驗(yàn)的發(fā)展簡(jiǎn)史1生化檢驗(yàn)的常規(guī)技術(shù)2生化檢驗(yàn)的新興技術(shù)3生化技術(shù)的臨床應(yīng)用4概念臨床生物化學(xué)是研究器官、組織人體體液的化學(xué)組成和進(jìn)行著的生物化學(xué)過程，以及疾病、藥物對(duì)這些過程的影響，為疾病診斷、病情監(jiān)測(cè)、藥物療效、預(yù)后判斷和疾病預(yù)防等各個(gè)方面提供信息和理論依據(jù)。臨床生物化學(xué)發(fā)展的重大突破“臨床化學(xué)”名稱的由來體液生物化學(xué)組分的分析應(yīng)用及“細(xì)胞內(nèi)環(huán)境相對(duì)穩(wěn)定”概念

比色法和光度法在臨床生物化學(xué)實(shí)驗(yàn)室中的應(yīng)用

血清酶活力測(cè)定作為細(xì)胞和組織損傷的指標(biāo)治療性藥物監(jiān)測(cè)成為臨床生物化學(xué)的一個(gè)重要分支超微量的儀器分析、免疫學(xué)、分子生物學(xué)、放射性同位素等技術(shù)在生物化學(xué)實(shí)驗(yàn)室中的應(yīng)用

自動(dòng)化裝置和超微分析生化檢驗(yàn)的常規(guī)技術(shù)一、光譜分析技術(shù)二、電泳技術(shù)三、離心技術(shù)四、層析技術(shù)五、電化學(xué)分析技術(shù)光譜分析技術(shù)定義：利用各種化學(xué)物質(zhì)(包括原子、基團(tuán)、分子及高分子化合物)所具有的發(fā)射、吸收或散射光譜系的特征，來確定其性質(zhì)、結(jié)構(gòu)或含量的技術(shù)，稱為光譜分析技術(shù)。根據(jù)物質(zhì)對(duì)光譜響應(yīng)特征的不同，可把光譜分析技術(shù)分為發(fā)射光譜分析技術(shù)、吸收光譜分析技術(shù)和散射光譜分析技術(shù)三大類。它既可以研究物質(zhì)的結(jié)構(gòu)，也可以對(duì)特定物質(zhì)進(jìn)行定性或定量分析。層析技術(shù)

原理：層析技術(shù)是一種物理的分離方法。無論何種層析，其系統(tǒng)通常由互不相溶的兩個(gè)相組成：一是固定相（固體或吸附在固體上的液體），一是流動(dòng)相（液體或氣體）。層析時(shí)，利用混合物中各組分理化性質(zhì)（如吸附力、分子形狀和大小、分子極性、分子親和力、溶解度等）的差異，使各組分不同程度地分布在兩相中，隨著流動(dòng)相從固定相上流過，不同組分以不同速度移動(dòng)而最終被分離。分類吸附層析分配層析凝膠層析離子交換層析親和層析聚焦層析離子交換層析（ion-changechromatography）

原理基質(zhì)疏水型離子交換劑；親水型離子交換劑應(yīng)用制備純化生物物質(zhì)定量、定性測(cè)定混合物中各組分1.平衡階段:離子交換劑與反離子結(jié)合2.吸附階段：樣品與反離子進(jìn)行交換3、4.解吸附階段：用梯度緩沖溶液洗脫，先洗下弱吸附物質(zhì)，后洗下強(qiáng)吸附物質(zhì)5.再生階段：用原始平衡液進(jìn)行充分洗滌，既可重復(fù)使用12345原始緩沖溶液的反離子樣品溶液梯度濃度聚焦層析（Chromatofocusing）

該法分離純化蛋白質(zhì)的依據(jù)是等電點(diǎn)的差異和離子交換行為。蛋白質(zhì)按其等電點(diǎn)在pH梯度環(huán)境中進(jìn)行排列的過程叫做聚焦效應(yīng)。pH梯度的形成(由多緩沖劑和多緩沖交換劑形成)是聚焦效應(yīng)的先決條件，如果一種蛋白質(zhì)加到已形成pH梯度的層析柱上時(shí)，由于洗脫液的連續(xù)流動(dòng)，蛋白質(zhì)將迅速地遷移到與它等電點(diǎn)相同的pH處。從此位置開始，該蛋白質(zhì)將以緩慢的速度進(jìn)行吸附、解吸附，直到在等電點(diǎn)pH時(shí)被洗出。在聚焦層析過程中，一種樣品分次加入時(shí)，只要先加入者尚未洗出，并且有一定的時(shí)間進(jìn)行聚焦，剩余樣品還可以加到柱上，其聚焦過程都能順利完成。層析時(shí)的聚焦效應(yīng)示意圖pH梯度溶液的形成示意圖蛋白質(zhì)1（pI=7）蛋白質(zhì)2（pI=8）流速移動(dòng)速率電泳技術(shù)原理：電泳是帶電顆粒在電場(chǎng)作用下向著與其電荷相反的電極移動(dòng)的現(xiàn)象。許多生物分子都帶有電荷，其電荷的多少取決于分子組成、性質(zhì)及其所在介質(zhì)的pH。如果混合物中各組分的結(jié)構(gòu)組成不同，在某一pH溶液中，各組分所帶電荷性質(zhì)、電荷數(shù)量不同，加之其分子量不同，在同一電場(chǎng)的作用下，各組分泳動(dòng)的方向和速度也各異，而達(dá)到分離鑒定各組分的目的。電泳技術(shù)分類（按實(shí)驗(yàn)裝置分類）

紙電泳

薄膜電泳

凝膠電泳

毛細(xì)管電泳垂直板凝膠電泳毛細(xì)管電泳SDS原理：當(dāng)SDS（SodiumDodecylSulfate,十二烷基硫酸鈉）與蛋白質(zhì)結(jié)合后，蛋白質(zhì)分子即帶有大量的負(fù)電荷，并遠(yuǎn)遠(yuǎn)超過了其原來的電荷，從而使天然蛋白質(zhì)分子間的電荷差別就降低乃至消除了。與此同時(shí)蛋白質(zhì)在SDS的作用下結(jié)構(gòu)變得松散，形狀趨向一致，所以各種SDS-蛋白質(zhì)復(fù)合物在電泳時(shí)產(chǎn)生的泳動(dòng)率差異，就反映了分子量的差異。在此條件下，樣品分子量的對(duì)數(shù)與其在凝膠中的遷移率呈直線關(guān)系。應(yīng)用:測(cè)定蛋白質(zhì)分子量測(cè)定蛋白質(zhì)亞基數(shù)等電點(diǎn)聚焦原理：在一定抗對(duì)流介質(zhì)（如凝膠）中加入兩性電解質(zhì)載體(Ampholyte,是一種多氨基多羧基的混合物，由異構(gòu)物和同系物組成，其pK和pI值各自相異卻又相近），當(dāng)直流電通過時(shí)，便形成一個(gè)由陽極到陰極pH值逐步上升的梯度。兩性化合物在此電泳過程中，就被濃集在與其等電點(diǎn)相等的pH區(qū)域，從而使不同化合物能按其各自等電點(diǎn)得到分離。應(yīng)用：高效率分離純化蛋白質(zhì)測(cè)定蛋白質(zhì)分子量離心技術(shù)原理：離心是利用旋轉(zhuǎn)運(yùn)動(dòng)的離心力以及物質(zhì)的沉降系數(shù)或浮力密度的差異進(jìn)行分離、濃縮和提純的一種方法。顆粒的沉降速度取決于離心機(jī)的轉(zhuǎn)速及其自身與中心軸的距離。不同大小、形狀和密度的顆粒會(huì)以不同的速度沉降。分類電位法：測(cè)定原電池電動(dòng)勢(shì)以求物質(zhì)含量電導(dǎo)法：測(cè)定電阻以求物質(zhì)含量電容量法：借助某些物理量的突變作為滴定分析終點(diǎn)的指示新興技術(shù)高效液相色譜分析法毛細(xì)管電泳技術(shù)生物芯片技術(shù)高效液相色譜分析技術(shù)（HPLC)高效液相色譜法是用特制微粒（＜10μm）充填的層析柱作為固定相，通過高壓使液體流動(dòng)相快速通過層析柱而達(dá)到快速有效分離液相中各種物質(zhì)的層析技術(shù)。它具有分離效果好、分析速度快、檢測(cè)靈敏度高等特點(diǎn)。在醫(yī)藥衛(wèi)生和生物化學(xué)領(lǐng)域得到廣泛的應(yīng)用，蛋白質(zhì)、糖類、核酸、氨基酸、生物堿、類固醇和類脂等大分子以及高分子聚合物都能用HPLC測(cè)定。臨床應(yīng)用高效液相色譜法是目前最好的血藥濃度監(jiān)測(cè)方法，但在實(shí)際應(yīng)用中還存在一些問題，如每遇到一種新藥必須摸索測(cè)定的最佳條件；各種藥物的測(cè)定條件不同，要不斷的更換流動(dòng)相甚至色譜柱；每次只能測(cè)定一種藥物，至多只能測(cè)定一類藥物，無法測(cè)定性質(zhì)不同的藥物。因此，高效液相色譜法用于常規(guī)血藥濃度監(jiān)測(cè)，只適用于少量常用的某些特定藥物，大大限制了它的推廣應(yīng)用。

鑒于臨床的需要，國(guó)外一些公司設(shè)計(jì)了自動(dòng)高效液相色譜儀，具有以下優(yōu)點(diǎn)：①固定色譜柱和流動(dòng)相，使一臺(tái)儀器適合多種藥物的檢測(cè)。②利用計(jì)算機(jī)技術(shù)，儲(chǔ)存幾百種藥物的圖譜，能自動(dòng)識(shí)別未知藥物。③為提高圖譜鑒別能力，該機(jī)利用了三維光譜、出峰時(shí)間等多種手段。④自動(dòng)進(jìn)樣系統(tǒng)使儀器自動(dòng)定量或定性測(cè)定，分析多達(dá)50個(gè)樣品。毛細(xì)管電泳裝置示意圖高壓電源光源光電倍增管數(shù)據(jù)采集毛細(xì)管緩沖液-樣品緩沖液發(fā)展歷史1981年Jorgenson和Lukacs首先提出在75μm內(nèi)徑毛細(xì)管柱內(nèi)用高電壓進(jìn)行分離,創(chuàng)立了現(xiàn)代毛細(xì)管電泳。1984年Terabe等建立了膠束毛細(xì)管電動(dòng)力學(xué)色譜。1987年Hjerten建立了毛細(xì)管等電聚焦,Cohen和Karger提出了毛細(xì)管凝膠電泳。1988～1989年出現(xiàn)了第一批毛細(xì)管電泳商品儀器。

與高效液相色譜法的比較共同點(diǎn)：都是高效分離技術(shù),儀器操作均可自動(dòng)化,且二者均有多種不同分離模式。差異點(diǎn)：⑴CE用遷移時(shí)間取代HPLC中的保留時(shí)間，CE的分析時(shí)間通常不超過30min,比HPLC速度快；⑵對(duì)CE而言,從理論上推得其理論塔板高度和溶質(zhì)的擴(kuò)散系數(shù)成正比,對(duì)擴(kuò)散系數(shù)小的生物大分子而言,其柱效就要比HPLC高得多；⑶CE所需樣品為nl級(jí),最低可達(dá)270fl,流動(dòng)相用量也只需幾毫升,而HPLC所需樣品為μl級(jí),流動(dòng)相則需幾百毫升乃至更多；但CE僅能實(shí)現(xiàn)微量制備,而HPLC可作常量制備。

與普通電泳比較CE和普通電泳相比,由于其采用高電場(chǎng),因此分離速度要快得多；檢測(cè)器則除了未能和原子吸收及紅外光譜連接以外,其它類型檢測(cè)器均已和CE實(shí)現(xiàn)了連接檢測(cè)；一般電泳定量精度差,而CE和HPLC相近；CE操作自動(dòng)化程度比普通電泳要高得多。優(yōu)點(diǎn)三高二少：高靈敏度：常用紫外檢測(cè)器的檢測(cè)限可達(dá)10-13～10-15mol,激光誘導(dǎo)熒光檢測(cè)器則達(dá)10-19～10-21mol；高分辨率：其每米理論塔板數(shù)為幾十萬；高者可達(dá)幾百萬乃至千萬,而HPLC一般為幾千到幾萬；高速度：最快可在60s內(nèi)完成,在250s內(nèi)分離10種蛋白質(zhì),1.7min分離19種陽離子,3min內(nèi)分離30種陰離子；樣品少：只需nl(10-9L)級(jí)的進(jìn)樣量；成本低：只需少量(幾毫升)流動(dòng)相和價(jià)格低廉的毛細(xì)管。

毛細(xì)管電泳(CE)除了比其它色譜分離分析方法具有效率更高、速度更快、樣品和試劑耗量更少、應(yīng)用面同樣廣泛等優(yōu)點(diǎn)外,其儀器結(jié)構(gòu)也比高效液相色譜(HPLC)簡(jiǎn)單。CE只需高壓直流電源、進(jìn)樣裝置、毛細(xì)管和檢測(cè)器。前三個(gè)部件均易實(shí)現(xiàn),困難之處在于檢測(cè)器。特別是光學(xué)類檢測(cè)器,由于毛細(xì)管電泳溶質(zhì)區(qū)帶的超小體積的特性導(dǎo)致光程太短,而且圓柱形毛細(xì)管作為光學(xué)表面也不夠理想,因此對(duì)檢測(cè)器靈敏度要求相當(dāng)高。

應(yīng)用目前，毛細(xì)管電泳已廣泛應(yīng)用于氨基酸分析、蛋白質(zhì)高效分離、指紋圖譜研究、分離合成寡核苷酸、DNA酶切片段及PCR產(chǎn)物的分析鑒定、DNA順序測(cè)定等，在生物大分子和小分子的分離分析及臨床檢測(cè)等方面也有廣闊的應(yīng)用前景。生物芯片技術(shù)生物芯片(biochip)是指采用光導(dǎo)原位合成或微量點(diǎn)樣等方法，將大量生物大分子比如核酸片段、多肽分子甚至組織切片及細(xì)胞等生物樣品有序地固化于支持物，然后與已標(biāo)記的待測(cè)生物樣品中靶分子雜交，通過特定的儀器比如激光共聚焦掃描或電荷偶聯(lián)攝像機(jī)對(duì)雜交信號(hào)的強(qiáng)度進(jìn)行快速、并行、高效地檢測(cè)分析，從而判斷樣品中靶分子的數(shù)量。由于常用玻片/硅片作為固相支持物，且在制備過程中模擬計(jì)算機(jī)芯片的制備技術(shù)，所以稱之為生物芯片技術(shù)。分類及基本原理根據(jù)芯片上固定的探針分為：基因芯片、蛋白質(zhì)芯片、細(xì)胞芯片、組織芯片等。另外根據(jù)原理不同，還有元件型微陣列芯片、通道型微陣列芯片、生物傳感芯片等新型生物芯片?；驹恚簩⒅苽浜玫纳飿悠饭潭ㄓ诮?jīng)化學(xué)修飾的載體上，然后與標(biāo)記的樣品分子雜交，根據(jù)各探針分子雜交信號(hào)的強(qiáng)度來確定樣品分子的數(shù)量和序列信息。

應(yīng)用基因測(cè)序：芯片技術(shù)中的雜交測(cè)序技術(shù)是一種新的高效快速測(cè)序方法。每種疾病都有其相應(yīng)的致病基因或易感基因存在，這樣就能通過基因檢測(cè)對(duì)疾病進(jìn)行基因診斷和基因治療。新藥開發(fā)：高通量的DNA芯片可發(fā)現(xiàn)眾多的新基因和新的靶分子用于新藥的設(shè)計(jì)。尋找新基因：定量監(jiān)測(cè)大量基因表達(dá)水平，在闡述基因功能、探索疾病原因及機(jī)制、可能的診斷及治療靶等方面是很有價(jià)值的。存在問題生物芯片技術(shù)雖然還處在初期發(fā)展階段，但它的飛速發(fā)展正在逐步改變著人們對(duì)生物體的認(rèn)識(shí)，隨著這一技術(shù)的深入發(fā)展，它對(duì)于臨床疾病診斷、疾病發(fā)生機(jī)制的認(rèn)識(shí)和新藥開發(fā)都將是一個(gè)重要的研究手段。但仍存在很多難以解決的問題，如技術(shù)復(fù)雜、檢測(cè)靈敏度較低，重復(fù)性差、分析范圍較窄和成本昂貴等問題。這些問題主要是表現(xiàn)在樣品得制備、探針合成與固定、分子的標(biāo)記、數(shù)據(jù)的讀取與分析等幾個(gè)方面。生化技術(shù)的臨床應(yīng)用臨床生