實驗三血清γ球蛋白的分離、純化及鑒定七年制課件

血清γ球蛋白的

分離純化與鑒定1【實驗?zāi)康摹?．學(xué)習(xí)鹽析法、凝膠層析和離子交換層析分離純化蛋白質(zhì)的基本原理及應(yīng)用2．掌握醋酸纖維薄膜電泳技術(shù)的原理及應(yīng)用3．了解蛋白質(zhì)分離純化的總體思路2

【實驗方法】

一、鹽析法粗分γ-球蛋白二、凝膠過濾方法脫鹽三、離子交換層析方法純化γ-球蛋白四、醋酸纖維素薄膜電泳法鑒定γ-球蛋白的純度

3分離蛋白質(zhì)的方法分離方法沉淀法鹽析法有機(jī)溶劑沉淀法層析法電學(xué)法電泳法等電聚焦超速離心法離子交換層析吸附層析凝膠過濾（分子篩）親和層析在分離純化時，根據(jù)情況選用幾種方法，相互配合才能達(dá)到分離純化一種蛋白質(zhì)的目的。5【基本原理】

本實驗采用硫酸銨鹽析、葡聚糖凝膠過濾、離子交換層析方法，分離純化血清γ-球蛋白。最后用醋酸纖維素薄膜電泳法鑒定γ-球蛋白的純度。

6實驗思路分段鹽析去除雜蛋白凝膠層析脫鹽交聯(lián)葡聚糖吸水濃縮醋酸纖維素薄膜電泳鑒定先粗后細(xì)離子交換層析純化7定義：加入大量中性鹽以破壞蛋白質(zhì)的穩(wěn)定因素并使從溶液中沉淀析出的現(xiàn)象。原理:

破壞蛋白質(zhì)兩個穩(wěn)定因素：

水化膜和電荷層中性鹽：(NH4)2SO4、Na2SO4、NaCl等。優(yōu)點：蛋白質(zhì)不變性，常用。鹽析法9鹽析步驟取離心管一支加入血清2ml加入2ml0.9%氯化鈉搖勻邊攪拌混勻邊緩慢滴加飽和(NH4)2SO44ml上清液（主要含清蛋白）傾去靜置10min，再離心（5000轉(zhuǎn)/分）10min沉淀用1ml0.9%氯化鈉攪拌溶解逐滴加飽和(NH4)2SO42ml,搖勻靜置10min，再離心（5000轉(zhuǎn)/分）10min傾棄上清液（主要含α、β球蛋白）沉淀即為初步純化的γ－球蛋白加入0.0175mol/L磷酸緩沖液（pH=6.3)1ml溶解γ－球蛋白粗提液10二、葡聚糖凝膠柱層析脫鹽

欲去除鹽析法分離得到的球蛋白粗提液中大量鹽，通常有兩種方法：

凝膠層析法、透析本試驗采用葡聚糖凝膠——SephadexG25層析方法除去球蛋白粗提液中的鹽硫酸銨，以便下一步用離子交換層析方法進(jìn)一步提純球蛋白。11凝膠層析法脫鹽13凝膠柱層析脫鹽14分子篩層析15Kd

—分配系數(shù)：精確衡量混合物中某一待分離成分在凝膠柱內(nèi)的洗脫行為，反映物質(zhì)分子進(jìn)入凝膠顆粒的程度，是溶質(zhì)分子大小的一個函數(shù)Ve—洗脫體積：分離物被洗脫時所用的洗脫液體積Kd=(Ve-Vo)/Vi

洗脫曲線：以洗脫體積為橫坐標(biāo)，各物質(zhì)濃度/吸光度為縱坐標(biāo)作圖17（1）完全被排阻的極端大分子，Ve=Vo，Kd=0（2）中等分子，Ve=Vo+Kd·Vi，0<Kd<1（3）完全滲透的小分子，Ve=Vo+Vi，Kd=118▲SephadexG-25的準(zhǔn)備▲裝柱（15~20cm）操作步驟：1、層析柱保持垂直。2、放蒸餾水，排出空氣，關(guān)閉出口。3、加入攪拌均勻的SephadexG-25懸液，調(diào)節(jié)流速10滴/min，使凝膠均勻沉降，不斷補充，直至18cm。4、上留1-2mm的水，關(guān)閉出口。

注意：★床面上要保持少許水，防止膠床露出液面。

★膠面不平，用玻棒輕輕攪動，讓凝膠自然沉降，使表面平整。19脫鹽

12345678910②上樣γ－球蛋白，粗提液①裝柱葡聚糖凝膠G-25，柱高18-20cm流速：每分鐘10滴左右

③加入洗脫劑④收集20滴換一支試管21⑤.層析后洗脫液檢測白色比色板,洗凈備用。一塊在各孔滴加奈氏試劑（檢測NH4+）,另一塊滴加20%璜基水楊酸（檢測蛋白質(zhì)）。不用滴管,避免污染,直接倒…用“-”表示無現(xiàn)象，用“+”,“++”,“+++”等表示顏色深淺⑥回收凝膠22注意事項：

1.凝膠柱的制備質(zhì)量決定分離效果的好壞。

2.加樣分離時，滴速越慢，分離效果越好?！?/p>

以管號為橫軸，蛋白質(zhì)含量為縱軸繪制洗脫曲線，分析實驗結(jié)果。23離子交換層析的基本原理

離子交換層析是一種常用的、通過使用各種類型的離子交換劑達(dá)到分離純化目的的層析方法。離子交換劑是通過化學(xué)反應(yīng)將帶電基團(tuán)引入到惰性支持物上形成的固體物質(zhì)，在實驗中作為固定相。如果其帶負(fù)電，則能結(jié)合陽離子，成為陽離子交換劑；如果其帶正電，則能結(jié)合陰離子，稱為陰離子交換劑?？筛鶕?jù)實驗需要，選擇不同的離子交換劑進(jìn)行離子交換層析。

DEAE（二乙基氨基乙基）－纖維素含有可離子化的堿基，可與氫離子結(jié)合，成為帶正電荷的陰離子交換劑。25DEAE－纖維素離子交換層析純化γ－球蛋白血清α、β、γ－球蛋白、清蛋白的等電點為：清蛋白pI=4.64，

α2球蛋白

pI=5.06，

β球蛋白pI=5.12，

γ球蛋白pI=7.3本實驗采用0.0175mol/lpH6.5NH4Ac緩沖液進(jìn)行洗脫。此pH，DEAE帶正電荷，可與帶負(fù)電荷的α、β-球蛋白和清蛋白結(jié)合，而帶正電荷的γ-球蛋白不與DEAE結(jié)合，首先從層析柱中洗脫出來，首先收集到的既是純化的γ-球蛋白。26四、γ－球蛋白純化液的濃縮

利用葡聚糖凝膠富含羥基，吸水，不允許大分子蛋白進(jìn)入微孔的特性，在樣品溶液中加少量凝膠，離心，濃縮蛋白。

每ml純化γ－球蛋白溶液加SephadexG-250.25g，搖動2～3分鐘，離心3000r/min，5分鐘，上清即為濃縮γ-球蛋白（或用冷凍干燥儀使其濃縮）。

29五、γ－球蛋白鑒定

用醋酸纖維素薄膜電泳的方法，以血清電泳圖譜為對照，鑒定所分離的蛋白質(zhì)種類和純度（參見血清蛋白質(zhì)醋酸纖維素薄膜電泳）。

30蛋白質(zhì)的電離示意圖

31基本原理1、以醋酸纖維薄膜作為支持體的一種電泳方法。2、在pH8.6巴比妥緩沖液中，血清蛋白質(zhì)在電場中均帶負(fù)電荷，向正極移動。3、帶電荷多、分子量相對小的泳動速度快；帶電荷少、分子量相對大的泳動速度慢。32血清蛋白質(zhì)乙酸纖維素薄膜電泳33清蛋白12

加樣線加樣線純化蛋白對照樣品34醋酸纖維素薄膜電泳鑒定

點樣：全血清：點樣一次脫鹽后的粗蛋白溶液：點樣3～5次濃縮后的純γ－球蛋白溶液：點樣3～5次35醋酸纖維素薄膜電泳電泳條件：

電壓：90－110V；時間：50分鐘。染色：電泳畢，關(guān)電源。取出薄膜浸入盛有氨基黑10B染色液的染色缸中染色5分鐘，用2.5%醋酸洗脫液漂洗，直至背景呈白色。以血清蛋白圖譜為對照，觀察提純物屬哪種蛋白，其純度如何？

36操作步驟：1、裝置電泳箱。區(qū)分電泳箱正負(fù)極。2、點樣：浸于巴比妥溶液中的薄膜，濾紙輕輕吸干—半干燥態(tài)。鉛筆標(biāo)記；點樣器沾適量新鮮血清，垂直點樣。3、放入電泳槽，使膜保持水平。4、通電：110伏，1小時。斷電后，取膜。5、染色：氨基