損傷和修復(fù)夏海濱

損傷和修復(fù)夏海濱第1頁，共81頁，2023年，2月20日，星期五第一節(jié)DNA損傷的原因及機(jī)制第2頁，共81頁，2023年，2月20日，星期五DNA存儲著生物體賴以生存和繁衍的遺傳信息，因此維護(hù)DNA分子的完整性對細(xì)胞至關(guān)重要。在細(xì)胞中能進(jìn)行修復(fù)的生物大分子也就只有DNA。在生物進(jìn)化中突變又是與遺傳相對立統(tǒng)一而普遍存在的現(xiàn)象。第3頁，共81頁，2023年，2月20日，星期五一、DNA損傷的原因（一）自發(fā)性損傷（二）物理因素引起的DNA損傷（三）化學(xué)因素引起的DNA損傷（四）其它誘發(fā)突變的化學(xué)物質(zhì)或致癌劑第4頁，共81頁，2023年，2月20日，星期五（一）自發(fā)性損傷堿基配對的錯誤頻率約為10-4-10-5；

DNA聚合酶本身具有校對作用：將不正確插入的核苷酸切除掉，重新加上正確的核苷酸。這樣，每摻入一個核苷酸，發(fā)生錯誤的機(jī)會有10-8-10-101.DNA復(fù)制中的錯誤第5頁，共81頁，2023年，2月20日，星期五2.堿基的自發(fā)性化學(xué)變化

(1)堿基的異構(gòu)互變DNA中的4種堿基各自的異構(gòu)體間自發(fā)地相互變化(例如烯醇式與酮式堿基間的互變)，使堿基配對間的氫鍵改變。異構(gòu)體間自發(fā)地相互變化形成導(dǎo)致下一世代中G－C配對取代A－T配對。腺嘌呤的稀有互變異體與胞嘧啶胸腺嘧啶的稀有互變異構(gòu)體與鳥嘌呤第6頁，共81頁，2023年，2月20日，星期五(2)堿基的脫氨基(deamination)作用堿基的環(huán)外氨基有時會自發(fā)脫落，從而胞嘧啶會變成尿嘧啶、腺嘌呤會變成次黃嘌呤(H)、鳥嘌呤會變成黃嘌呤(X)等。胞嘧啶自發(fā)脫氨基的頻率約為每個細(xì)胞每天190個。第7頁，共81頁，2023年，2月20日，星期五第8頁，共81頁，2023年，2月20日，星期五第9頁，共81頁，2023年，2月20日，星期五(3)脫嘌呤（depurination）與脫嘧啶自發(fā)的水解可使嘌呤和嘧啶從DNA鏈的核糖磷酸骨架上脫落下來。一個哺乳類細(xì)胞37℃，20h內(nèi)DNA鏈自發(fā)脫落的嘌呤約1000個、嘧啶約500個，長壽命不復(fù)制繁殖的哺乳類細(xì)胞(如神經(jīng)細(xì)胞)在整個生活期間自發(fā)脫嘌呤數(shù)約為108，約占細(xì)胞DNA中總嘌呤數(shù)的3%。第10頁，共81頁，2023年，2月20日，星期五(4)堿基修飾與鏈斷裂

細(xì)胞呼吸的副產(chǎn)物O2、H2O2等會造成DNA損傷，能產(chǎn)生胸腺嘧啶乙二醇、羥甲基尿嘧啶等堿基修飾物，引起DNA單鏈斷裂等損傷每個哺乳類細(xì)胞每天DNA單鏈斷裂發(fā)生的頻率約為5萬次。DNA的甲基化、結(jié)構(gòu)的其他變化等，這些損傷的積累可能導(dǎo)致老化。第11頁，共81頁，2023年，2月20日，星期五（二）物理因素引起的DNA損傷第12頁，共81頁，2023年，2月20日，星期五

1.紫外線引起的DNA損傷(1)紫外線照射，同一條DNA鏈上相鄰的嘧啶以共價鍵連成二聚體，相鄰的兩個T、或兩個C、或C與T間都可以環(huán)丁基環(huán)(cyclobutanering)連成二聚體。

圖胸腺嘧啶二聚體的形成第13頁，共81頁，2023年，2月20日，星期五(2)人皮膚因受紫外線照射而形成二聚體的頻率可達(dá)每小時5×104/細(xì)胞，只局限在皮膚中。(3)微生物受紫外線照射后，會影響其生存。(4)紫外線照射還能引起DNA鏈斷裂等損傷。第14頁，共81頁，2023年，2月20日，星期五2.電離輻射引起的DNA損傷直接效應(yīng)是DNA直接吸收射線能量而遭損傷，間接效應(yīng)是指DNA周圍其他分子(主要是水分子)吸收射線能量產(chǎn)生具有很高反應(yīng)活性的自由基進(jìn)而損傷DNA。電離輻射可導(dǎo)致DNA分子的多種變化：(1)堿基變化

主要是由OH-自由基引起，包括DNA鏈上的堿基氧化修飾、過氧化物的形成、堿基環(huán)的破壞和脫落等。一般嘧啶比嘌呤更敏感。第15頁，共81頁，2023年，2月20日，星期五(2)脫氧核糖變化脫氧核糖上的每個碳原子和羥基上的氫都能與OH-反應(yīng)，導(dǎo)致脫氧核糖分解，引起DNA鏈斷裂。

(3)DNA鏈斷裂射線的直接和間接作用都可能使脫氧核糖破壞或磷酸二酯鍵斷開。單鏈斷裂(singlestrandbroken)，雙鏈斷裂(doublestrandbroken)。單鏈斷裂發(fā)生頻率為雙鏈斷裂的10-20倍，但比較容易修復(fù)；對單倍體細(xì)胞來說(如細(xì)菌)一次雙鏈斷裂就是致死事件。第16頁，共81頁，2023年，2月20日，星期五(4)交聯(lián)DNA鏈交聯(lián)：同一條DNA鏈上或兩條DNA鏈上的堿基間可以共價鍵結(jié)合，DNA-蛋白質(zhì)交聯(lián)：組蛋白、染色質(zhì)中的非組蛋白、調(diào)控蛋白、與復(fù)制和轉(zhuǎn)錄有關(guān)的酶都會與DNA共價鍵連接。第17頁，共81頁，2023年，2月20日，星期五（三）化學(xué)因素引起的DNA損傷突變劑或致癌劑對DNA的作用。第18頁，共81頁，2023年，2月20日，星期五1.烷化劑對DNA的損傷

是一類親電子的化合物，很容易與生物體中大分子的親核位點(diǎn)起反應(yīng)。烷化劑的作用可使DNA發(fā)生各種類型的損傷。第19頁，共81頁，2023年，2月20日，星期五(1)堿基烷基化

烷化劑如甲基黃酸乙脂（EMS）,氮芥(NM),甲基黃酸甲脂（MMS）,亞硝基胍（NG）等，它們的作用是使堿基烷基化，將烷基加到DNA鏈中嘌呤或嘧啶的N或O上；EMS使G的第6位烷化，使T的第4位上烷化，結(jié)果產(chǎn)生的O-6-E-G和O-4-E-T分別和T、G配對，導(dǎo)致G∶C對轉(zhuǎn)換成A∶T對；T∶A對轉(zhuǎn)換成C∶G

第20頁，共81頁，2023年，2月20日，星期五(2)堿基脫落烷化鳥嘌呤的糖苷鍵不穩(wěn)定，容易脫落形成DNA上無堿基的位點(diǎn)，復(fù)制時可以插入任何核苷酸，造成序列的改變。(3)斷鏈DNA鏈的磷酸二酯鍵上的氧也容易被烷化，形成不穩(wěn)定的磷酸三酯鍵，易在糖與磷酸間發(fā)生水解，使DNA鏈斷裂。

第21頁，共81頁，2023年，2月20日，星期五(4)交聯(lián)烷化劑有兩類:單功能基烷化劑，如甲基甲烷碘酸，只能使一個位點(diǎn)烷基化；雙功能基烷化劑，化學(xué)武器如氮芥、硫芥等，一些抗癌藥物如環(huán)磷酰胺、苯丁酸氮芥、絲裂霉素等，某些致癌物如二乙基亞硝胺等均屬此類，其兩個功能基可同時使兩處烷基化，結(jié)果就能造成DNA鏈內(nèi)、DNA鏈間，以及DNA與蛋白質(zhì)間的交聯(lián)。第22頁，共81頁，2023年，2月20日，星期五

圖3氮芥引起DNA分子兩條鏈在鳥嘌呤上的交聯(lián)

(a)交聯(lián)附近的總圖；(b)交聯(lián)部分結(jié)構(gòu)圖第23頁，共81頁，2023年，2月20日，星期五2.堿基類似物對DNA的損傷人工合成的一些堿基類似物，用作促突變劑或抗癌藥物，如5-溴尿嘧啶(5-BU)、5-氟尿嘧啶(5-FU)、2-氨基腺嘌呤(2-AP)等。其結(jié)構(gòu)與正常的堿基相似，進(jìn)入細(xì)胞能替代正常的堿基參入到DNA鏈中而干擾DNA復(fù)制合成。第24頁，共81頁，2023年，2月20日，星期五第25頁，共81頁，2023年，2月20日，星期五例如亞硝酸鹽能使C脫氨變成U，經(jīng)過復(fù)制就可使DNA上的G-C變成A-T；羥胺能使T變成C，結(jié)果是A-T改成C-G；黃曲霉素B也能專一攻擊DNA上的堿基導(dǎo)致序列的變化。（四）其它誘發(fā)突變的化學(xué)物質(zhì)或致癌劑第26頁，共81頁，2023年，2月20日，星期五第二節(jié)DNA修復(fù)第27頁，共81頁，2023年，2月20日，星期五DNA修復(fù)(DNArepairing)是細(xì)胞對DNA受損傷后的一種反應(yīng)，這種反應(yīng)可能使DNA結(jié)構(gòu)恢復(fù)原樣，重新能執(zhí)行它原來的功能；有時并非能完全消除DNA的損傷，只是使細(xì)胞能夠耐受這種DNA的損傷而能繼續(xù)生存。修復(fù)系統(tǒng)：切除修復(fù)回復(fù)修復(fù)錯配修復(fù)SOS修復(fù)重組修復(fù)限制修飾系統(tǒng)-----對付外源DNA的入侵第28頁，共81頁，2023年，2月20日，星期五

1切除修復(fù)(excisionrepair)

對多種DNA損傷包括堿基脫落形成的無堿基位點(diǎn)、嘧啶二聚體、堿基烷基化、單鏈斷裂、交聯(lián)等都能起修復(fù)作用。這種修復(fù)方式普遍存在于各種生物細(xì)胞中，也是人體細(xì)胞主要的DNA修復(fù)機(jī)制。需要多種酶作用，復(fù)制前進(jìn)行

。1.1核苷酸切除修復(fù)1.1.1大腸桿菌核苷酸切除修復(fù)有關(guān)的酶

1）UvrABC內(nèi)切酶或切除酶：需要ATP的結(jié)合但不需要ATP水解；是uvrA，uvrB和uvrC三個基因表達(dá)產(chǎn)物的復(fù)合物；在損傷位置兩側(cè)各作一缺口（UvrB在3’端，UvrC在5’端）。第29頁，共81頁，2023年，2月20日，星期五2）解鏈酶Ⅱ（UvrD編碼）：

去除UvrABC內(nèi)切酶產(chǎn)生的寡核苷酸；3）DNA聚合酶(DNApol)4）DNA連接酶(DNALigase)

人類核苷酸切除修復(fù)有關(guān)的基因:（XPA，XPB，XPC，XPD，XPF，XPG）缺陷引起人類著色性干皮病。

臨床表現(xiàn)：嚴(yán)重光敏感，皮癌，視力缺陷，神經(jīng)錯亂。第30頁，共81頁，2023年，2月20日，星期五切口切口1.1.2核苷酸切除修復(fù)過程第31頁，共81頁，2023年，2月20日，星期五Uvr系統(tǒng)在修復(fù)各階段中的作用：UvrA識別損傷；

UvrBC在DNA上切一缺口；

UvrD解旋切口區(qū)域的DNA,并釋放出切割的DNA片段。第32頁，共81頁，2023年，2月20日，星期五1.2堿基切除修復(fù)

1.2.1堿基切除修復(fù)有關(guān)的酶

1)DNA糖基化酶（DNAglycosylase):

識別DNA中損傷的或錯誤的堿基；水解N-糖苷鍵去除堿基。

2)AP內(nèi)切酶（Endonucleases）：有3’5’外切酶活性，切除AP位點(diǎn)5’端的數(shù)個核苷酸。DNA糖基化酶去除堿基后，產(chǎn)生一個AP位點(diǎn)。AP內(nèi)切酶識別此位點(diǎn)并在AP位點(diǎn)的5’端產(chǎn)生一個切口。3)脫氧核糖磷酸二酯酶（dRpase）：切除AP位點(diǎn)的脫氧核糖磷酸，產(chǎn)生一個核苷酸的缺口。

4)DNA聚合酶：在缺口處進(jìn)行修復(fù)，加入一個核苷酸。在AP位點(diǎn)5’端進(jìn)行廣泛的修復(fù)合成。5)DNA連接酶：連接最后一個切口。第33頁，共81頁，2023年，2月20日，星期五OHP5′3′5′3′5′3′3′3′5′5′烷化堿基DNA糖苷酶切除的游離堿基OHP5′3′OHP-5′3′5′AP內(nèi)切酶dRpase無嘌呤嘧啶位點(diǎn)切除的5′-脫氧核糖磷酸AP內(nèi)切酶的3′-5′外切酶活性

寡核苷酸切除產(chǎn)物堿基切除修復(fù)過程3′P第34頁，共81頁，2023年，2月20日，星期五

基本步驟：①首先由核酸酶識別DNA的損傷位點(diǎn)，在損傷部位的5′側(cè)切開磷酸二酯鍵。②由5′→3′核酸外切酶將有損傷的DNA片段切除。③在DNA聚合酶的催化下，以完整的互補(bǔ)鏈為模板，按5′→3′方向DNA鏈，填補(bǔ)已切除的空隙。④由DNA連接酶將新合成的DNA片段與原來的DNA斷鏈連接起來。最終使DNA恢復(fù)原來的結(jié)構(gòu)。

DNA損傷后切除修復(fù)第35頁，共81頁，2023年，2月20日，星期五2回復(fù)修復(fù)/直接修復(fù)(directrepair)

指無需去除堿基或核苷酸，只需一種酶經(jīng)一步反應(yīng)修復(fù)DNA損傷的修復(fù)機(jī)制。較簡單的修復(fù)方式，一般都能將DNA修復(fù)到原樣。2.1烷基的轉(zhuǎn)移O6甲基鳥嘌呤甲基轉(zhuǎn)移酶(MGMT)，能直接將DNA鏈鳥嘌呤O6位上的甲基移到酶的半胱氨酸殘基上而修復(fù)損傷的DNA。這個酶的修復(fù)能力并不很強(qiáng)，但在低劑量烷化劑作用下此酶有修復(fù)活性。第36頁，共81頁，2023年，2月20日，星期五2.2光修復(fù)由細(xì)菌中的DNA光解酶(photolyase)完成：此酶能特異性識別紫外線造成的核酸鏈上相鄰嘧啶共價結(jié)合的二聚體，并與其結(jié)合，這步反應(yīng)不需要光；結(jié)合后如受300－600nm波長的光照射，則此酶就被激活，將二聚體分解為兩個正常的嘧啶單體，然后酶從DNA鏈上釋放，DNA恢復(fù)正常結(jié)構(gòu)。第37頁，共81頁，2023年，2月20日，星期五2.3單鏈斷裂的重接

DNA單鏈斷裂，其中一部分可僅由DNA連接酶(ligase)參與而完全修復(fù)。雙鏈斷裂幾乎不能修復(fù)。2.4堿基的直接插入

DNA鏈上嘌呤的脫落造成無嘌呤位點(diǎn)，能被DNA嘌呤插入酶(insertase)識別結(jié)合，在K+存在的條件下，催化游離嘌呤或脫氧嘌呤核苷插入，生成糖苷鍵；所催化插入的堿基有高度專一性、與另一條鏈上的堿基嚴(yán)格配對，使DNA完全恢復(fù)。第38頁，共81頁，2023年，2月20日，星期五3錯配修復(fù)（mismatchrepair）一種糾正復(fù)制后子鏈中錯配堿基的修復(fù)方式。3.1錯配修復(fù)有關(guān)的蛋白和酶MutS蛋白：識別錯配的堿基。

MutH蛋白：內(nèi)切酶，在子鏈未甲基化的5’-GATC-3’序列靠近鳥嘌呤的5’-端造成一個切口，使包括錯配堿基在內(nèi)的數(shù)百個核苷酸得以切除。MutL蛋白：將MutH和MutS蛋白連接成復(fù)合體。解鏈酶：解開DNA雙鏈。單鏈結(jié)合蛋白：穩(wěn)定單鏈模板。DNA聚合酶：從3’-OH填補(bǔ)空缺。DNA連接酶：連接切口。第39頁，共81頁，2023年，2月20日，星期五CH3GATC

CTAGGTGATC5′3′CTAG3′5′GTCH3CH3GATC

CTAGGTMutHMutSMutL切口CH3GATC

CTAGGT5′3′CH3

GATC5′3′

CTAG3′5′TGDNA解鏈酶核酸外切酶SSBdNMPsCH3GATC

CTAGGT5′3′DNA聚合酶

DNA連接酶dNTPsCH3GATC

CTAGGC3.2DNA錯配修復(fù)的模型第40頁，共81頁，2023年，2月20日，星期五MutSMutLMutSMutHMutS識別錯配位點(diǎn),并易位到GATC位點(diǎn)。

MutH在GATC位點(diǎn)剪切非甲基化鏈，內(nèi)切酶從GATC到錯配位點(diǎn)降解DNA。第41頁，共81頁，2023年，2月20日，星期五3.3錯配修復(fù)的意義修復(fù)DNA復(fù)制過程中逃避了DNA聚合酶校正作用的子鏈上的錯配堿基。在子鏈合成后幾分鐘之內(nèi)，GATC尚未甲基化，故能被MutH蛋白識別，結(jié)合并制造切口。人類遺傳性非多發(fā)性結(jié)直腸癌的病因是錯配修復(fù)的基因缺陷。

mMLH1突變譜外顯子基因突變蛋白產(chǎn)物（預(yù)測）

16165bp缺失外顯子缺失16閱讀框內(nèi)

1946bp缺失移碼，氨基酸替換

1946bp插入羧基末端延長

12371bp缺失移碼，不完整蛋白質(zhì)第42頁，共81頁，2023年，2月20日，星期五4重組修復(fù)(recombinationalrepair)－復(fù)制后修復(fù)指由基因的同源重組介導(dǎo)的修復(fù)過程。在某些情況下沒有互補(bǔ)鏈可以直接利用，例如在DNA復(fù)制時兩條鏈已經(jīng)分開后發(fā)生DNA損傷，采用重組修復(fù)。

作用：

（1）修復(fù)DNA復(fù)制時子鏈的缺口。（2）修復(fù)雙鏈斷裂，單鏈缺口。（3）修復(fù)雙鏈交聯(lián)。第43頁，共81頁，2023年，2月20日，星期五修復(fù)步聚：①受損傷的DNA鏈復(fù)制時，產(chǎn)生的子代DNA在損傷的對應(yīng)部位出現(xiàn)缺口。②另一條母鏈DNA與有缺口的子鏈DNA進(jìn)行重組交換，將母鏈DNA上相應(yīng)的片段填補(bǔ)子鏈缺口處，而母鏈DNA出現(xiàn)缺口。③以另一條子鏈DNA為模板，經(jīng)DNA聚合酶催化合成一新DNA片段填補(bǔ)母鏈DNA的缺口，最后由DNA連接酶連接，完成修補(bǔ)。DNA重組修復(fù)方式第44頁，共81頁，2023年，2月20日，星期五第45頁，共81頁，2023年，2月20日，星期五重組修復(fù)不能完全去除損傷，損傷的DNA段落仍然保留在親代DNA鏈上；只是重組修復(fù)后合成的DNA分子是不帶有損傷的，但經(jīng)多次復(fù)制后，損傷就被“沖淡”了，在子代細(xì)胞中只有一個細(xì)胞是帶有損傷DNA的。第46頁，共81頁，2023年，2月20日，星期五5SOS修復(fù)SOS修復(fù)是指DNA受到嚴(yán)重?fù)p傷、細(xì)胞處于危急狀態(tài)時所誘導(dǎo)的一種DNA修復(fù)方式，修復(fù)結(jié)果只是能維持基因組的完整性，提高細(xì)胞的生成率，但留下的錯誤較多，故又稱為錯誤傾向修復(fù)(errorpronerepair)，細(xì)胞有較高的突變率。（1）SOS反應(yīng)能誘導(dǎo)多種蛋白質(zhì)的合成

RecA蛋白：嚴(yán)重的DNA損傷產(chǎn)生大量單鏈缺口，激活RecA蛋白的水解酶活性，促進(jìn)LexA阻遏蛋白的裂解和SOS反應(yīng)的誘導(dǎo)。

LexA阻遏蛋白：調(diào)節(jié)所有SOS基因的轉(zhuǎn)錄。

DNA聚合酶Ⅱ：受SOS反應(yīng)的誘導(dǎo)。能進(jìn)行跨損傷復(fù)制。（2）SOS修復(fù)是易錯修復(fù)，導(dǎo)致突變增加。第47頁，共81頁，2023年，2月20日，星期五

SOS反應(yīng)的起始：是通過RecA的活化而引起。誘導(dǎo)信號:

可能由DNA釋放出的小分子組成的，或者是DNA本身某些結(jié)構(gòu)變化。RreA的激活導(dǎo)致LexA的基因產(chǎn)物的剪切。LexA是一種小分子蛋白（22KDa），具有蛋白酶活性，是很多操縱子的阻遏物。LexA被RecA激活后又可導(dǎo)致LexA自我催化它本身的裂解，這樣LexA的阻遏功能失去了活性，并且同時誘導(dǎo)了它所結(jié)合的操縱子。第48頁，共81頁，2023年，2月20日，星期五和SOS反應(yīng)有關(guān)的基因，包括RecA，lexA,UvrA,UvrB,umuC和himA。RecA也觸發(fā)細(xì)胞中其它靶物質(zhì)的剪切，包括各種原噬菌體的阻遏蛋白。

第49頁，共81頁，2023年，2月20日，星期五

DNA損傷誘導(dǎo)信號recA蛋白酶激活lexA阻遏物切斷

阻遏物蓄積蛋白酶水平下降信號水平下降DNA修復(fù)lexA基因recA基因mRNA

操縱子可誘導(dǎo)基因lexA阻遏物作用于lexA阻遏物所控制的其他基因lexA基因recA基因誘導(dǎo)基因lexA阻遏物recA蛋白嘧啶二聚體活化的recA蛋白切斷的lexA阻遏物非誘導(dǎo)狀態(tài)誘導(dǎo)狀態(tài)SOS修復(fù)中l(wèi)exA-recA調(diào)節(jié)子的作用機(jī)理第50頁，共81頁，2023年，2月20日，星期五修復(fù)過程：當(dāng)DNA兩條鏈的損傷鄰近時，損傷不能被切除修復(fù)或重組修復(fù)，這時在核酸內(nèi)切酶、外切酶的作用下造成損傷處的DNA鏈空缺，再由損傷誘導(dǎo)產(chǎn)生的一整套的特殊DNA聚合酶和SOS修復(fù)酶類，催化空缺部位DNA的合成，補(bǔ)上去的核苷酸幾乎是隨機(jī)的，但仍然保持了DNA雙鏈的完整性，使細(xì)胞得以生存。圖SOS修復(fù)第51頁，共81頁，2023年，2月20日，星期五

6限制－修飾系統(tǒng)(restrictionandmodificaion)本世紀(jì)50年代初，以Arber等人對λ噬菌體在大腸桿菌不同菌株上的平板培養(yǎng)效應(yīng)的研究為基礎(chǔ)，發(fā)現(xiàn)了原核生物體內(nèi)存在著寄生控制的限制(restriction)和修飾(modification)系統(tǒng)。第52頁，共81頁，2023年，2月20日，星期五結(jié)論：?菌體限制修飾系統(tǒng)中的限制性內(nèi)切酶能將外來DNA切斷,?菌體本身的DNA可受甲基化酶的保護(hù)。

兩者稱為限制-修飾作用

*E.coliK菌株和B菌株各有自己的限制修飾系統(tǒng),*E.coliC菌株沒有;細(xì)菌借助于限制-修飾系統(tǒng)來區(qū)別自己DNA和外源DNA。第53頁，共81頁，2023年，2月20日，星期五

自己DNA:

限制模式相同的DNA

同株系的不同個體DNA、寄生于其中的質(zhì)粒和噬菌體。

居民DNA(residentDNA)：同一個細(xì)胞內(nèi)的不同類型的DNA，包括細(xì)胞DNA，質(zhì)粒DNA，噬菌體DNA等。第54頁，共81頁，2023年，2月20日，星期五核酸內(nèi)切限制酶的類型及其主要特性特性I型II型III型限制和修飾活性單一多功能的酶分開的核酸內(nèi)切酶和甲基化酶

具有一種共同亞基的雙功能的酶核酸內(nèi)切限制酶的蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)3種不同的亞基單一的成份

2種不同的亞基

切割位點(diǎn)在距寄主特異性位點(diǎn)至少700bp的地方可能隨機(jī)地切割位于寄主特異性位點(diǎn)或其附近

距寄主特異性位點(diǎn)3，端24~26bp處甲基化作用的位點(diǎn)寄主特異性的位點(diǎn)寄主特異性的位點(diǎn)寄主特異性的位點(diǎn)識別未甲基化的序列進(jìn)行核酸內(nèi)切酶切割

能

能能序列特異的切割不是是是DNA克隆中的用處無用十分有用用處不大第55頁，共81頁，2023年，2月20日，星期五I類限制性內(nèi)切酶的特點(diǎn)1）

I類限制性內(nèi)切酶是異源多聚體，包含三個亞基R、M和S，其功能分別為限制性內(nèi)切酶、甲基化酶和DNA特異位點(diǎn)識別。2）

I類限制性內(nèi)切酶與DNA結(jié)合依賴M亞基與輔助因子S-腺苷甲硫氨酸（SAM）的相互作用。3）

I類限制性內(nèi)切酶與DNA分子結(jié)合后，根據(jù)該位點(diǎn)的甲基化狀態(tài)發(fā)揮相應(yīng)的酶活性，或修飾或切割。切割位點(diǎn)與識別位點(diǎn)相隔1-5kb。4）

I類限制性內(nèi)切酶的種類較少，研究的較多的有大腸桿菌的EcoK和EcoB。第56頁，共81頁，2023年，2月20日，星期五I類限制性內(nèi)切酶作用機(jī)制第57頁，共81頁，2023年，2月20日，星期五II類限制性內(nèi)切酶特點(diǎn)II類限制性內(nèi)切酶由H.O.Smith等1970年首先在流感嗜血桿菌Rd型菌株中發(fā)現(xiàn)。目前已有400多種II類限制性內(nèi)切酶被分離，它是分子量較小的單體蛋白，識別和切割雙鏈DNA分子時僅需要Mg2+,識別和切割位點(diǎn)的序列有嚴(yán)格的特異性。第58頁，共81頁，2023年，2月20日，星期五II類限制性內(nèi)切酶作用機(jī)制第59頁，共81頁，2023年，2月20日，星期五III類限制性內(nèi)切酶的特點(diǎn)III類限制性內(nèi)切酶由R亞基和MS亞基組成，其中MS亞基具有位點(diǎn)識別和甲基化修飾雙重活性。該類酶與DNA識別位點(diǎn)的結(jié)合嚴(yán)格依賴ATP。修飾作用和切割作用取決于兩個亞基之間的競爭。修飾作用在識別位點(diǎn)內(nèi)進(jìn)行。切割序列位于識別位點(diǎn)一側(cè)若干堿基對處，無序列特異性。第60頁，共81頁，2023年，2月20日，星期五目前對真核細(xì)胞的DNA修復(fù)的反應(yīng)類型、參與修復(fù)的酶類和修復(fù)機(jī)制了解還不多；DNA損傷修復(fù)與突變、壽命、衰老、腫瘤發(fā)生、輻射效應(yīng)、某些毒物的作用都有密切的關(guān)系。例如著色性干皮病(xerodermapigmentosum)是第一個發(fā)現(xiàn)的DNA修復(fù)缺陷性遺傳病。第61頁，共81頁，2023年，2月20日，星期五第三節(jié)基因突變第62頁，共81頁，2023年，2月20日，星期五DNA損傷的后果－突變

上述損傷會最終導(dǎo)致DNA分子結(jié)構(gòu)的變化，這種DNA分子水平上的突變(mutation)，是整體遺傳突變的基礎(chǔ)。突變（mutation）:是遺傳物質(zhì)中任何可檢測的能遺傳的改變，但不包括遺傳重組。第63頁，共81頁，2023年，2月20日，星期五1突變類型體細(xì)胞突變（somaticmutation）:對于一個多細(xì)胞生物來說，如果突變僅發(fā)生在體細(xì)胞中，那么這種突變是不會傳遞給后代的。但若突變發(fā)生在的生殖細(xì)胞中，那么這種突變就能通過配子傳遞給下一代，在后代個體的體細(xì)胞和生殖細(xì)胞中產(chǎn)生同樣的突變，這種突變就叫做種系突變（germ-limemutations）。突變可以發(fā)生在染色水平或者基因水平。染色體結(jié)構(gòu)和數(shù)目的改變叫做染色體畸變（chromosomalaberration），也稱為染色體突變（chromosomemutation）。當(dāng)染色體畸變涉及到基因組中染色體套數(shù)的改變稱為基因組突變（genomemutation），即整倍數(shù)改變。發(fā)生在基因水平的突變稱為基因突變（genemutation）。誘變劑處理所誘發(fā)的突變稱為誘發(fā)突變（inducedmutation），自然發(fā)生的突變是自發(fā)突變（spontaneousmutatiow）。第64頁，共81頁，2023年，2月20日，星期五2基因突變的類型2.1從堿基變化分：1）點(diǎn)突變(pointmutation)指DNA上單一堿基的變異。轉(zhuǎn)換(transition)：嘌呤替代嘌呤(A與G之間的替代)、嘧啶替代嘧啶(C與T之間的替代)；顛換(transvertion)：嘌呤變嘧啶或嘧啶變嘌呤。第65頁，共81頁，2023年，2月20日，星期五2）缺失(deletion)

指DNA鏈上一個或一段核苷酸的消失。3）插入(insertion)

指一個或一段核苷酸插入到DNA鏈中。4）倒位或轉(zhuǎn)位(transposition)

指DNA鏈重組使其中一段核苷酸鏈方向倒置、或從一處遷移到另一處。5）雙鏈斷裂

已如前述，對單倍體細(xì)胞一個雙鏈斷裂就是致死性事件。第66頁，共81頁，2023年，2月20日，星期五2.2從突變效應(yīng)分：

1）移碼突變(frameshiftmutaion)：在為蛋白質(zhì)編碼的序列中如缺失及插入的核苷酸數(shù)不是3的整倍數(shù)，則發(fā)生讀框移動(readingframeshift)，使其后所譯讀的氨基酸序列全部混亂。移碼突變大多數(shù)常產(chǎn)生無活性產(chǎn)物，有些移碼突變會在基因內(nèi)部形成終止密碼子，從而使所生成的多肽鏈長度變短。第67頁，共81頁，2023年，2月20日，星期五移碼突變第68頁，共81頁，2023年，2月20日，星期五2）錯義突變（missensemutation）是指DNA改變后mRNA中相應(yīng)密碼子發(fā)生改變，編碼另一種氨基酸，使蛋白質(zhì)中的氨基酸發(fā)生取代，可能削弱此蛋白的功能，以至影響到突變體的表型。3）無義突變（nonsensemutation）是由DNA的堿基突變使mRNA中產(chǎn)生了無義密碼子，翻譯時在相應(yīng)的位點(diǎn)會導(dǎo)致提前終止－平截或截短，產(chǎn)生一條不完整的多肽鏈，通常是沒有功能的。第69頁，共81頁，2023年，2月20日，星期五校正突變：移碼突變有時可由同一基因內(nèi)的另一堿基的缺失或插入所抵消，但要求第二個移碼突變發(fā)生在前一突變位點(diǎn)的下游。這樣的第二個移碼突變稱為校正突變(suppressormutation)。第70頁，共81頁，2023年，2月20日，星期五4）中性突變（neu