第二章微生物的保護和保藏詳解

第二章微生物的保護和保藏詳解演示文稿現(xiàn)在是1頁\一共有29頁\編輯于星期四（優(yōu)選）第二章微生物的保護和保藏現(xiàn)在是2頁\一共有29頁\編輯于星期四云南大學云南省生物資源保護與利用重點實驗室已建成西南微生物種質(zhì)資源庫、基因與蛋白、微生物發(fā)酵和次生代謝產(chǎn)物研究平臺?，F(xiàn)擁有2棟獨立科研大樓，總面積達5800平方米以上。設(shè)備總值達3000多萬元。實驗室的主要研究方向及研究領(lǐng)域為：（1）特色生物的物種與遺傳多樣性：特色生物的基因多樣性，物種演化和區(qū)系演變的規(guī)律及其與地理環(huán)境變化的關(guān)系；動物、植物與微生物協(xié)同進化的關(guān)系與規(guī)律；特色生物資源保護的策略。（2）資源微生物利用的基礎(chǔ)理論與關(guān)鍵技術(shù)：具重要應用前景的微生物資源評估和生物學基礎(chǔ)研究；微生物基因工程菌構(gòu)建及產(chǎn)業(yè)化開發(fā)；植物寄生線蟲微生物農(nóng)藥研究；具活性的微生物次生代謝產(chǎn)物及先導化合物研究。（3）生物多樣性的生態(tài)功能與修復：污染及極端環(huán)境中植物、微生物的抗性、適應及多樣性變化機制；山區(qū)土地植被變化與生物多樣性維持；關(guān)鍵區(qū)域受損生態(tài)系統(tǒng)的退化機制與恢復?，F(xiàn)在是3頁\一共有29頁\編輯于星期四微生物資源與人類生態(tài)系統(tǒng)生態(tài)系統(tǒng)在一定時間和空間內(nèi)，生物與其生存環(huán)境以及生物與生物之間相互作用，彼此通過物質(zhì)循環(huán)、能量流動和信息交換，形成的一個不可分割的自然整體?，F(xiàn)在是4頁\一共有29頁\編輯于星期四微生物與人類生態(tài)系統(tǒng)的相互影響

微生物對人類生態(tài)系統(tǒng)的影響

自然生態(tài)系統(tǒng)的主要分解者自然界中元素的平衡者土壤肥力的保持者人類生態(tài)系統(tǒng)對微生物的影響

環(huán)境影響自然界微生物的生存

現(xiàn)在是5頁\一共有29頁\編輯于星期四微生物資源保護的重要性

維持生態(tài)系統(tǒng)平衡推動生物技術(shù)發(fā)展---生物酶等基因資源庫大量微生物資源尚需發(fā)掘現(xiàn)在是6頁\一共有29頁\編輯于星期四微生物資源保護策略天然微生物資源的保護

保護微生物的棲息生存環(huán)境生產(chǎn)菌種和專利菌種的保護

知識產(chǎn)權(quán)保護

加強微生物資源保護法律法規(guī)建設(shè)和宣傳工作

把微生物資源作為國家的戰(zhàn)略資源來認識，開發(fā)與保護并重現(xiàn)在是7頁\一共有29頁\編輯于星期四

目的：確保微生物生產(chǎn)性能穩(wěn)定、不染菌、不死亡等。原理：“休眠”

二、微生物物種資源的保藏現(xiàn)在是8頁\一共有29頁\編輯于星期四（一）菌種保藏的原理菌種保藏主要是根據(jù)微生物生理生化特點，人工制造環(huán)境條件，使微生物代謝處于不活潑，生長繁殖受抑制的休眠狀態(tài)，即采取低溫、干燥、缺氧三個條件，使菌種暫時處于休眠狀態(tài)。挑選典型菌種的優(yōu)良純種一般采用微生物的休眠體（如孢子、芽孢等）創(chuàng)造適于微生物長時期休眠的環(huán)境條件（如干燥、低溫、缺氧、避光、缺乏營養(yǎng)以及添加保護劑或酸堿中和劑等）現(xiàn)在是9頁\一共有29頁\編輯于星期四幾個概念1.衰退（degeneration）：在微生物的生長過程中，由于變異的存在，使原有的優(yōu)良性狀發(fā)生負變，即菌種的衰退?，F(xiàn)在是10頁\一共有29頁\編輯于星期四2.復壯(rejuvenation)狹義的復壯是指在菌種已發(fā)生衰退的情況下，通過純種分離和生產(chǎn)性能測定等方法，從衰退的群體中找出未衰退的個體，以達到恢復該菌原有典型性狀的措施；廣義的復壯是指在菌種的生產(chǎn)性能未衰退前就有意識的經(jīng)常進行純種的分離和生產(chǎn)性能測定工作，以期菌種的生產(chǎn)性能逐步提高。實際上是利用自發(fā)突變（正變）不斷地從生產(chǎn)中選種現(xiàn)在是11頁\一共有29頁\編輯于星期四菌種的復壯措施純種分離純菌落的分離方法（平板表面涂布法，平板劃線分離法，瓊脂培養(yǎng)基澆注法）-菌落純純細胞的分離方法（利用培養(yǎng)皿或凹玻片等作分離小室進行單細胞分離；顯微操縱器進行單細胞分離；不長孢子的絲狀真菌，則可用無菌小刀切取菌落邊緣疏稀的菌絲尖端進行分離移植，也可用無菌毛細管插入菌絲尖端，菌絲尖端切割法進行單細胞分離）-菌株純現(xiàn)在是12頁\一共有29頁\編輯于星期四通過宿主體內(nèi)生長進行復壯（如Bacillusthuringiensis的復壯）對于寄生性微生物的退化菌株，可通過接種至相應的昆蟲或動、植物宿主體內(nèi)的措施來提高它們的致病性。例如，經(jīng)過長期人工培養(yǎng)的Bacillusthuringiensis，會發(fā)生毒力減退和殺蟲效率降低等現(xiàn)象。這時，可將已衰退的菌株去感染菜青蟲等的幼蟲（相當于一種活的選擇性培養(yǎng)基），然后可從病死的蟲體內(nèi)重新分離出典型的產(chǎn)毒菌株。如此反復進行多次，就可提高菌株的殺蟲效率。淘汰已衰退的個體（采用比較激烈的理化條件進行處理，以殺死生命力較差的已衰退個體）有人曾對Streptomycesmicroflavus“5406”抗生菌的分生孢子，采用－10～－30℃的低溫處理5～7天，使其死亡率達到80％。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，在抗低溫的存活個體中，留下了未退化的健壯個體，從而達到了復壯的目的。現(xiàn)在是13頁\一共有29頁\編輯于星期四

防止菌種衰退的方法1控制傳代的次數(shù)（一般在DNA的復制過程中，堿基的錯配率是5x10-4，自發(fā)突變的頻率為10-8~10-9，采用良好的菌種保藏方法，可以減少移種和傳代的次數(shù)）：意即盡量避免不必要的移種和傳代，并將必要的傳代降低到最低限度，以減少自發(fā)突變的幾率。2創(chuàng)造良好的培養(yǎng)條件：在赤霉素生產(chǎn)菌Gebberellafujikuroi的培養(yǎng)基中，加入糖蜜、天冬酰胺、谷氨酰胺、5′-核苷酸或甘露醇等豐富營養(yǎng)物時，有防止菌種衰退的效果；在Aspergillusterricola（棲土曲霉）3．942的培養(yǎng)中，有人曾用改變培養(yǎng)溫度的措施，即從28～30℃提高到33～34℃來防止它產(chǎn)孢子能力的衰退。現(xiàn)在是14頁\一共有29頁\編輯于星期四3利用不同類型的細胞進行接種傳代：對絲狀微生物而言，通常采用穩(wěn)定的單核孢子進行接種。在放線菌和霉菌中，由于它們的菌絲細胞常含幾個核或甚至是異核體，因此用菌絲接種就會出現(xiàn)不純和衰退，而孢子一般是單核的，用于接種時，就沒有這種現(xiàn)象發(fā)生。有人在實踐上創(chuàng)造了用滅過菌的棉團輕巧地對Streptomycesmi-croflavus“5406”抗生菌進行斜面移種，由于避免了菌絲的接入，因而達到了防止菌種衰退的效果；又有人發(fā)現(xiàn)，Aspergillusnidulans（構(gòu)巢曲霉）如以其分子孢子傳代就易退化，而改用子囊孢子移種則不易退化。現(xiàn)在是15頁\一共有29頁\編輯于星期四4采用有效的菌種保藏方法：在用于工業(yè)生產(chǎn)的菌種中，重要的性狀都屬于數(shù)量性狀，而這類性狀恰是最易退化的。即使在較好的保藏條件下，還是存在這種情況。例如，鏈霉素生產(chǎn)菌——Streptomycesgriseus（灰色鏈霉菌）ЛC-1以冷凍干燥孢子形式經(jīng)過5年的保藏，在菌群中衰退菌落的數(shù)目有所增加，而在同樣情況下，另一菌株773#只經(jīng)過23個月就降低23％的活性。即使在－20℃下進行冷凍保藏，經(jīng)12～15個月后，上述773#菌株和另一種環(huán)絲氨酸生產(chǎn)菌908#菌株的效價水平還是有明顯降低。由此說明有必要研究和采用更有效的保藏方法以防止菌種生產(chǎn)性狀的衰退?，F(xiàn)在是16頁\一共有29頁\編輯于星期四（二）微生物菌種保藏技術(shù)1.冷凍干燥或真空干燥保藏；2.超低溫或在液氮中冷凍保藏；3.

轉(zhuǎn)接培養(yǎng)或斜面?zhèn)鞔２兀?.土壤或陶瓷珠等載體干燥保藏?，F(xiàn)在是17頁\一共有29頁\編輯于星期四1.

冷凍保藏

冷凍保藏為保藏微生物菌種的最簡單而有效的方法。通過冷凍，使微生物代謝活動停止。一般而言，冷凍溫度愈低，效果愈好。為了獲得滿意的冷凍結(jié)果，通常應在培養(yǎng)物中加入一定的冷凍保護劑。冷凍保藏時溫度要求在-20℃以下，同時應認真掌握好冷凍速度和解凍速變。缺點之一：是培養(yǎng)物運輸較困難?，F(xiàn)在是18頁\一共有29頁\編輯于星期四冷凍保藏種類

(1)普通冷凍保藏技術(shù)(-20℃)(2)超低溫冷凍保藏技術(shù)(-60℃～-80℃)(3)液氮冷凍保藏技術(shù)

(-196℃)現(xiàn)在是19頁\一共有29頁\編輯于星期四超低溫冷凍保藏技術(shù)(-60一-80℃)要求長期保藏的微生物菌種，一般都要求在-60℃以下進行保藏。在超低溫冷藏柜中保藏菌種的一般方法是：

1．離心收獲對數(shù)生長中期至后期的微生物細胞；

2．用新鮮培養(yǎng)基重新懸浮所收獲的細胞；

3．加入等體積的20％甘油或10％二甲亞砜；

4．混勻后分裝入冷凍試管或安瓿中，于-70℃超低溫冰箱中保藏。

某些細菌和真菌菌種可通過此法保藏5年而活力不受影響。方法：菌種培養(yǎng)→15~30%甘油緩沖液懸浮→加入保藏管中→置-70℃冰箱保藏措施：低溫（-70℃）、保護劑（15~50%甘油）適用：細菌、酵母菌保藏期：約10年

現(xiàn)在是20頁\一共有29頁\編輯于星期四液氮冷凍保藏技術(shù)

方法：菌種培養(yǎng)→保護劑懸浮→加入保藏管中→置液氮瓶中措施：超低溫（-196℃）、保護劑適用：各大類保藏期：>15年

在液氮冷凍保藏中，最常用的冷凍保護劑是二甲亞砜和甘油，最終使用濃度一般為甘油10％、二甲亞砜5％。所使用的甘油—般用高壓蒸汽滅菌，而二甲亞砜最好為過濾滅菌。

現(xiàn)在是21頁\一共有29頁\編輯于星期四2.

凍干保藏

冷凍干燥的基本方法：是通過在減壓條件下使凍結(jié)的細胞懸液中的水分升華，使培養(yǎng)物干燥。此法是微生物菌種長期保藏的最為有效的方法之一冷凍干燥過程中必須使用冷凍保護劑，目前國內(nèi)常用脫脂乳和蔗糖，國外尚有運用動物血清等的。大部分微生物菌種可以在凍干狀態(tài)下保藏10年之久而不喪失活力。而且經(jīng)凍干后的菌株無需進行冷凍保藏，便于運輸。方法：菌種培養(yǎng)→用保護劑懸浮→加入安醅管中→低溫凍結(jié)（-25—-40℃）→抽真空（至0.01mmHg）→真空封口→檢查真空度→保藏措施：低溫、干燥，缺氧，有保護劑適用：各大類保藏期：5~15年或更長現(xiàn)在是22頁\一共有29頁\編輯于星期四培養(yǎng)物的凍干過程現(xiàn)在是23頁\一共有29頁\編輯于星期四3.其他保藏方法(1)斜面保藏法方法：接種適宜斜面培養(yǎng)基→培養(yǎng)→4℃保藏措施：低溫：4℃

適用：各大類保藏期：1~6個月用橡皮塞代替棉塞，可適當延長保藏時間(2)石蠟油封藏法方法：斜面或半固體接種→培養(yǎng)→加無菌液蠟高出培養(yǎng)基1cm→4~15℃保藏措施：低溫，隔氧適用：不能利用石油的各大類保藏期：1~2年優(yōu)點：簡便現(xiàn)在是24頁\一共有29頁\編輯于星期四(3)砂土管保藏法方法：孢子或芽孢懸液→加入無菌砂土管中→干燥→封口→保藏措施：無營養(yǎng)，缺氧，干燥適用：產(chǎn)孢子（芽孢）微生物保藏期：1~10年現(xiàn)在是25頁\一共有29頁\編輯于星期四4.

基因工程菌的保藏由載體質(zhì)粒等攜帶的外源DNA片段通常是遺傳不穩(wěn)定的、且很易丟失其外源質(zhì)粒復制子。質(zhì)粒基因通常為宿主細胞生長非必需。一般情況下當細胞丟失這些質(zhì)粒時，生長速度會加快。現(xiàn)在是26頁\一共有29頁\編輯于星期四當培養(yǎng)基中加入抗生素時，抗生素提供了一有利于攜帶質(zhì)粒的細胞群體的極有用的生長選擇壓。而且在運用基因工程菌進行發(fā)酵時，抗生素的加入可幫助維持質(zhì)粒復制與染色體復制的協(xié)調(diào)。基因工