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PAGEPAGE4生物技術(shù)實踐一、傳統(tǒng)發(fā)酵技術(shù)果酒制作:1)原理:酵母菌的無氧呼吸反應(yīng)式:C6H12O6eq\o(→,\s\up7(酶))2C2H5OH+2CO2+能量。2)菌種來源:附著在葡萄皮上的野生酵母菌或人工培養(yǎng)的酵母菌。3)條件:18-25℃,密封,每隔一段時間放氣(CO24)檢測:在酸性條件下,重鉻酸鉀與酒精反應(yīng)呈灰綠色。2、果醋制作:1)原理:醋酸菌的有氧呼吸。O2,糖源充足時,將糖分解成醋酸O2充足,缺少糖源時,將乙醇變?yōu)橐胰?,再變?yōu)榇姿帷2H5OH+O2eq\o(→,\s\up7(酶))CH3COOH+H2O2)條件:30-35℃,適時通入無菌空氣3、腐乳制作:1)菌種:青霉、酵母、曲霉、毛霉等,主要是毛霉(都是真菌)。2)原理:毛霉產(chǎn)生的蛋白酶將豆腐中的蛋白質(zhì)分解成小分子的肽和aa;脂肪酶將脂肪水解為甘油和脂肪酸。3)條件:15-18℃4)菌種來源:空氣中的毛霉孢子或優(yōu)良毛霉菌種直接接種。5)加鹽腌制時要逐層加鹽,隨層數(shù)加高而增加鹽量,鹽能抑制微生物的生長,避免豆腐塊腐敗變質(zhì)。4、泡菜制作:1)原理:乳酸菌的無氧呼吸,反應(yīng)式:C6H12O6eq\o(→,\s\up7(酶))2C3H6O3+能量2)制作過程:①將清水與鹽按質(zhì)量比4:1配制成鹽水,將鹽水煮沸冷卻。煮沸是為了殺滅雜菌,冷卻之后使用是為了保證乳酸菌等微生物的生命活動不受影響。②將新鮮蔬菜放入鹽水中后,蓋好壇蓋。向壇蓋邊沿的水槽中注滿水,以保證乳酸菌發(fā)酵的無氧環(huán)境。3)亞硝酸鹽含量的測定:①方法:比色法;②原理:在鹽酸酸化條件下,亞硝酸鹽與對氨基苯磺酸發(fā)生重氮化反應(yīng)后,與N-1-萘基乙二胺鹽酸鹽結(jié)合形成玫瑰紅色染料。二、微生物的培養(yǎng)與應(yīng)用1、培養(yǎng)基的種類:按物理性質(zhì)分為固體培養(yǎng)基和液體培養(yǎng)基,按化學(xué)成分分為合成培養(yǎng)基和天然培養(yǎng)基,按用途分為選擇培養(yǎng)基和鑒別培養(yǎng)基。2、培養(yǎng)基的成分一般都含有水、碳源、氮源、無機鹽P143、微生物在固體培養(yǎng)基表面生長,可以形成肉眼可見的菌落。4、培養(yǎng)基還需滿足微生物對PH、特殊營養(yǎng)物質(zhì)以及O2的要求。5、獲得純凈培養(yǎng)物的關(guān)鍵是防止外來雜菌的入侵。6、常用滅菌方法有:灼燒滅菌,將接種工具如接種環(huán)、接種針滅菌;干熱滅菌:如玻璃器皿、金屬用具等需保持干燥的物品。高壓蒸汽滅菌:如培養(yǎng)基的滅菌。7、用固體培養(yǎng)基對大腸桿菌純化培養(yǎng),可分為兩步:制備培養(yǎng)基和純化大腸桿菌。8、固體培養(yǎng)基的制備:計算→稱量→溶化→滅菌→倒平板9、微生物常用的接種方法:平板劃線法和稀釋涂布平板法。10、平板劃線法是通過連續(xù)劃線,將菌種逐步稀釋分散到培養(yǎng)基表面,稀釋涂布平板法是將菌液進行一系列的梯度稀釋,分別涂布到培養(yǎng)基表面。當(dāng)它們稀釋到一定程度后,微生物將分散成單個細胞,從而在培養(yǎng)基上形成單個菌落。11、微生物的計數(shù)方法:活菌計數(shù)法、顯微鏡直接計數(shù)法、濾膜法。12、活菌計數(shù)法就是當(dāng)樣品的稀釋度足夠高時,培養(yǎng)基表面生長的一個菌落,來源于樣品稀釋液中的一個活菌。通過統(tǒng)計平板上的菌落數(shù),就能推測出樣品中大約含有多少個活菌。統(tǒng)計的菌落數(shù)往往比活菌的實際數(shù)目低。因為當(dāng)兩個或多個細胞連在一起時,平板上觀察的只是一個菌落。13、顯微鏡直接計數(shù)也是測定微生物數(shù)量的常用方法,但它包括了死亡的微生物。14、設(shè)置對照的主要目的是排除實驗組中非測試因素對實驗結(jié)果的影響。提高實驗結(jié)果的可信度。①如何證明培養(yǎng)基是否受到污染:實驗組的培養(yǎng)基中接種要培養(yǎng)的微生物,對照組中的培養(yǎng)基接種等量的蒸餾水(設(shè)置空白對照)。②如何證明某選擇培養(yǎng)基是否有選擇功能:實驗組中的培養(yǎng)基用該選擇培養(yǎng)基,對照組中培養(yǎng)基用普通培養(yǎng)基(牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基)。如果普通培養(yǎng)基的菌落數(shù)明顯大于選擇培養(yǎng)基中的數(shù)目,則說明該選擇培養(yǎng)基有選擇功能。15、如何分離分解尿素的細菌?培養(yǎng)基中以尿素為唯一氮源,加入酚紅指示劑,如果PH升高,指示劑變紅,可初步鑒定該菌能分解尿素。16、如何分離分解纖維素的微生物?以纖維素為唯一碳源的培養(yǎng)基。17、纖維素酶是一種復(fù)合酶,至少包括三組分:C1酶、CX酶和葡萄糖苷酶。前兩種酶使纖維素分解成纖維二糖,第三種酶將纖維二糖分解成葡萄糖。18、篩選纖維素分解菌的方法:剛果紅染色法,其原理是剛果紅可以與像纖維素這樣的多糖物質(zhì)形成紅色復(fù)合物,但并不和水解后的纖維二糖和葡萄糖發(fā)生這種反應(yīng)。當(dāng)纖維素被纖維素酶分解后,剛果紅—纖維素的復(fù)合物無法形成,培養(yǎng)基中會出現(xiàn)以纖維素分解菌為中心的透明圈。(產(chǎn)生了透明圈,說明纖維素被分解了,說明有纖維素分解菌)5、加酶洗衣粉的作用原理:堿性蛋白酶能將血漬、奶漬等含有的大分子蛋白質(zhì)水解成可溶性的氨基酸或小分子的肽,使污跡容易從衣物上脫落。同樣道理,脂肪酶、淀粉酶和纖維素酶也能將大分子的脂肪、淀粉和纖維素水解為小分子物質(zhì)。6、固定化技術(shù)包括:包埋法、化學(xué)結(jié)合法和物理吸附法。一般來說,酶更適合采用化學(xué)結(jié)合法和物理吸附法固定化,而細胞多采用包埋法固定化。因為細胞個大,而酶分子很??;個大的細胞難以被吸附或結(jié)合,而個小的酶容易從包埋材料中漏出。7、固定化酵母細胞時,酵母細胞的活化用蒸餾水;配制海藻酸鈉溶液時,加熱要用小火,或者間斷加熱;要將海藻酸鈉溶液冷卻至室溫,再加入活化的酵母細胞。CaCl2溶液有利于凝膠珠形成穩(wěn)定的結(jié)構(gòu)。五、DNA和蛋白質(zhì)技術(shù)1、提取生物大分子的基本思路是選用一定的物理或化學(xué)方法分離具有不同物理或化學(xué)性質(zhì)的生物大分子。2、DNA溶解性:①DNA在不同濃度的NaCL溶液中溶解度不同。在0.14moL/L的NaCL溶液中,溶解度最小。②DNA不溶于酒精。3、DNA對酶、高溫和洗滌劑的耐受性:因為酶有專一性,蛋白酶能水解蛋白質(zhì),但對DNA沒有影響。DNA比較能耐高溫。洗滌劑能夠瓦解細胞膜,但對DNA無影響。4、在沸水浴條件下,DNA遇二苯胺會被染成藍色。5、提取DNA的材料一般用雞血而不用豬血,因為哺乳動物(豬)成熟的紅細胞無細胞核,無DNA。6、破碎雞血細胞時,可以加入一定量的蒸餾水,同時用玻璃棒攪拌,過濾后收集濾液即可。7、為了純化提取的DNA,需要將濾液進一步處理。在濾液中加入NaCL,使其濃度為2mol/L,過濾除去不溶的雜質(zhì),再加入蒸餾水,使NaCL濃度為0.14mol/L,析出DNA,過濾除去溶液中的雜質(zhì)。8、向溶解了DNA的NaCL溶液中加入體積分數(shù)為95%的冷卻的酒精溶液,目的是提取含雜質(zhì)更少的DNA。9、PCR原理:DNA體外復(fù)制10、PCR的條件:①一定的緩沖溶液;②DNA模板;③分別與兩條模板鏈相結(jié)合的兩種引物;④四種脫氧核苷酸;⑤耐熱的DNA聚合酶;⑥控制溫度的儀器設(shè)備。11、為什么要引物?因為DNA聚合酶不能從頭開始合成DNA,而只能從3′端延伸DNA鏈。DNA的合成方向總是從子鏈的5′端向3′端延伸。12、PCR三步驟:變性、復(fù)性和延伸。在PCR循環(huán)之前,常要進行一次預(yù)變性,以便增加大分子模板DNA徹底變性的概率。13、PCR的結(jié)果:特異地復(fù)制處于兩個引物之間的DNA序列,使這段固定長度的序列呈指數(shù)擴增。14、DNA在260nm的紫外線波段有一強烈的吸收峰。15、蛋白質(zhì)分離的方法:凝膠色譜法和電泳。16、凝膠色譜法是根據(jù)相對分子質(zhì)量的大小分離蛋白質(zhì)的有效方法。相對分子質(zhì)量較小的蛋白質(zhì),移動速度慢,后洗脫出來;相對分子質(zhì)量較大的蛋白質(zhì),移動速度快,先洗脫出來。17、電泳利用了待分離樣品中各種分子帶電性質(zhì)的差異以及分子本身的大小形狀的不同,使帶電分子產(chǎn)生不同的遷移速度,從而實現(xiàn)各種分子的分離。六、植物有效成分的提取。1、植物芳香油的提取方法:蒸餾、壓榨和萃取。2、水蒸汽蒸餾法是利用水蒸汽將揮發(fā)性較強的植物芳香油攜帶出來,形成油水混合物,冷卻后又重新分出油層和水層。如玫瑰油、薄荷油等(也可用萃取法)。3、柑橘、檸檬芳香油的制備常使用壓榨法,因為水中蒸餾會導(dǎo)致原料焦糊和有效成分水解。4、胡蘿卜素的提取一般用萃取法。萃取法是將粉碎、干燥的植物原料用有機溶劑浸泡,使芳香油溶解在有機溶劑中,然后蒸發(fā)出有機溶劑,獲取純凈的植物芳香油。5、石油醚具有較高的沸點,能充分溶解胡蘿卜素,并且不與水混溶,所以適宜用作胡蘿卜素的萃取劑。6、玫瑰精油的化學(xué)性質(zhì)穩(wěn)定,難溶于水,易溶于有機溶劑,能隨水蒸汽一同蒸餾。故適用于蒸餾法。7、玫瑰精油的油水混合物中加入NaCL目的是增加水層密度,使油水分層。
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