基因克隆質(zhì)粒載體

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第六講基因克隆的質(zhì)粒載體

吳乃虎

中國科學(xué)院遺傳與發(fā)育生物學(xué)研究所

2023年8月

基因克隆的質(zhì)粒載體

一、導(dǎo)言

1．質(zhì)粒是一類引人注目的亞細(xì)胞有機(jī)體

其結(jié)構(gòu)比病毒還要簡單，既無蛋白質(zhì)外殼，也無細(xì)胞外生命周期，只能在寄主細(xì)胞內(nèi)增殖，并隨著寄主細(xì)胞的分裂而被遺傳下去。2．質(zhì)粒的類型多種多樣

F質(zhì)粒：F因子或性質(zhì)粒(Sexplasmid)，它能夠使寄主染色體上的

基因與F因子(Ffactor)一道轉(zhuǎn)移到原先不存在該質(zhì)粒的寄主受體細(xì)胞中去。

R質(zhì)粒：通稱抗藥性因子(Resistantfactor,Rfactor)，編碼一種或

數(shù)種抗菌素抗性基因，并能將此抗性轉(zhuǎn)移到缺乏該質(zhì)的適合的受體細(xì)胞中去。

Col質(zhì)粒：所謂Col質(zhì)粒，即是一種產(chǎn)生大腸桿菌素的因子，編碼

控制大腸桿菌素合成的基因。大腸桿菌素可使不帶Col質(zhì)粒的親緣關(guān)系密切的細(xì)菌菌株致死。

3．質(zhì)粒載體

70年代在試驗室構(gòu)建的一類最普遍使用的基因克隆載體。

二、質(zhì)粒的一般特性1．質(zhì)粒DNA(細(xì)菌質(zhì)粒定義

*1.大腸桿菌的質(zhì)粒是獨立于寄主染色體以外的自主復(fù)制的共價、閉合、環(huán)形的雙鏈DNA分子(covalentlyclosedcircularDNA,cccDNA)。除了酵母的殺傷質(zhì)粒(Killerplasmid)是RNA質(zhì)粒外，所有的質(zhì)粒都是質(zhì)粒DNA。但是質(zhì)粒DNA的復(fù)制又必需依靠于寄主提供核酸酶及蛋白質(zhì)。*2.質(zhì)粒DNA分子大小

文獻(xiàn)中有3種說法：小的僅有103KD，僅能編碼2-3種蛋白質(zhì)；

大的可達(dá)105KD，兩者相差上百倍。1Kb～200Kb(Sambroketal.)5Kb～400Kb(Lehninger)

MD(megadaltons)=106D(兆道爾頓)1.5Kb≈1MD

*3.質(zhì)粒DNA與寄主染色體DNA間的關(guān)系

一般狀況下，質(zhì)粒DNA可持續(xù)地處于寄主染色體外的游離狀

態(tài)，但在一定條件下又可以可逆地整合到寄主染色體上，并隨之一道復(fù)制和細(xì)胞分裂而傳到后代。*4.質(zhì)粒DNA的分子構(gòu)型

SC構(gòu)型：即共價閉合環(huán)形的cccDNA所浮現(xiàn)的超螺旋構(gòu)型。

走在凝膠的最前面。

OC構(gòu)型：即開環(huán)DNA(ocDNA)所浮現(xiàn)的構(gòu)型，其中一條DNA

鏈保持完整的環(huán)形結(jié)構(gòu)，另一條鏈上則出現(xiàn)有一個至數(shù)個的缺口。走在凝膠的最終方部位。

L構(gòu)型：發(fā)生雙鏈斷裂形成的線性DNA分子所浮現(xiàn)的構(gòu)型，

通稱L型。走在凝膠中間部位。

2．質(zhì)粒克隆載體必需具備的條件(三種共同的組成部分)①具有復(fù)制區(qū)或復(fù)制因子(replicator)復(fù)制因子：

是指一段特定的質(zhì)粒DNA，它含有質(zhì)粒DNA的復(fù)制起點(ori)(originofreplication)，以及編碼質(zhì)粒DNA和質(zhì)粒復(fù)制所需要的DNA序列結(jié)構(gòu)。

*注意復(fù)制因子(replicator)和復(fù)制子(replicon)之間在概念上的

區(qū)別。

復(fù)制子(replicon)：系指含有一個復(fù)制起始位點的DNA復(fù)制單

位，例如細(xì)菌染色體、病毒基因組、質(zhì)?；?/p>

因組等，凡其DNA能夠進(jìn)行自主復(fù)制的遺傳單元均稱為復(fù)制子。

*在一般的狀況下，一個質(zhì)粒只含有一個復(fù)制起點，構(gòu)成一個獨立的復(fù)制子。但在少數(shù)的狀況下，由融合產(chǎn)生的質(zhì)粒也會含有兩個復(fù)制子，但其中只有一個有活性。②具有抗菌素抗性基因

一種理想的質(zhì)?？寺≥d體應(yīng)具有兩種抗菌素抗性基因，以便為寄主細(xì)胞提供易于檢測的表型性狀作為選擇記號，而且在有關(guān)的限制酶識別位點上插入外源DNA片段之后形成的重組質(zhì)粒，至少仍要保存一個強(qiáng)選擇記號。③具有若干限制酶單一識別位點

這樣的分子結(jié)構(gòu)特性，可以滿足基因克隆的需要，而且在其中插入適當(dāng)大小的外源DNA片段之后，應(yīng)不影響質(zhì)粒DNA的復(fù)制功能。

④具有較小的分子量和較高的拷貝數(shù)這類質(zhì)粒的優(yōu)點在于：

a.低分子量質(zhì)粒易于操作，克隆了外源DNA片段之后(一般不超過15Kb)仍可有效地轉(zhuǎn)化給受體細(xì)胞；

b.含有較高的拷貝數(shù)有利于質(zhì)粒DNA的制備，增加克隆DNA片段(基因)的產(chǎn)量；

c.低分子量的質(zhì)粒分子中對某種限制酶具多重識別位點的機(jī)率也就相應(yīng)下降；

3．質(zhì)粒DNA編碼的表型

①質(zhì)粒DNA的分子量較小，僅占細(xì)胞染色體的一小部分，一般約為3%。

②質(zhì)粒DNA盡管分子量小，但卻編碼著重要的遺傳性狀：a.抗性特征：抗菌素抗性、重金屬抗性、毒性陰離子抗性，以

及其它抗性。

b.代謝特征：抗菌素及細(xì)菌素合成；簡單的碳水化合物(例如乳

糖、蔗糖等)的新陳代謝；繁雜碳水化合物(甲苯、苯胺)及鹵代化合物的新陳代謝；蛋白質(zhì)新陳代謝；??固N(yùn)作用；H2S的合成；檸檬酸的利用；歐文氏菌的色素形成；產(chǎn)堿桿菌的反硝化活性；產(chǎn)堿桿菌和歐文氏菌的硫氨素的合成；

c.修飾寄主生活方式的因子：大腸桿菌腸毒素的合成；金黃色

葡萄球菌剝脫性毒素的合成；炭疽桿菌外毒素的合成；蘇蕓金芽孢桿菌?-內(nèi)毒素的合成；破傷風(fēng)

桿菌神經(jīng)毒素的合成；大腸桿菌定居抗原的合成；大腸桿菌及鏈球菌等的溶血素的合成；腸道細(xì)菌的血清抗性；耶爾森菌的毒力；炭疽芽孢桿菌的莢膜的合成；大腸桿菌中鐵的運轉(zhuǎn)。

d.其它特征：

鹽桿菌細(xì)胞中氣泡的形成；鏈霉菌之痘皰形成的(致死接合)；

肺炎克氏桿菌中的Kik+IncN質(zhì)粒的致死效應(yīng)；土壤桿菌對細(xì)菌素的敏感性；

麻風(fēng)桿菌之半透明/不透明菌落的變異；Nod+Flx+豌豆根瘤菌的根際蛋白質(zhì)的合成；Caedibacter包涵體的產(chǎn)生；葡萄球菌之內(nèi)肽酶活性。

4．質(zhì)粒DNA的轉(zhuǎn)移

①接合型質(zhì)粒和非接合型質(zhì)粒

*接合型質(zhì)粒(conjugativeplasmid)：又叫自我轉(zhuǎn)移質(zhì)粒，具有自我復(fù)制基因?？刂萍?xì)菌配對和質(zhì)粒接合轉(zhuǎn)移的基因；

*非接合型質(zhì)粒(non-conjugativeplasmid)：亦叫不能自我轉(zhuǎn)移的質(zhì)粒，具有自我復(fù)制基因，但失去了控制細(xì)胞配對和接合轉(zhuǎn)移的基因，因此不能夠從一個細(xì)胞轉(zhuǎn)移到另一個細(xì)胞。

加上大腸桿菌素基因——大腸桿菌Col

質(zhì)粒

非接合型質(zhì)粒

加上抗菌素抗性基因——大腸桿菌R

質(zhì)粒，也稱R因子。

帶上一段寄主染色體DNA——F?因

子

接合型質(zhì)粒(F因子)加上大腸桿菌素基因——大腸桿菌

素Col質(zhì)粒

加上抗菌素抗性基因——大腸桿菌

R質(zhì)粒，R因子

②接合型質(zhì)粒F因子是最有代表性的接合型質(zhì)粒：F因子在寄主菌中的三種存在方式：

a.染色體外雙鏈環(huán)形DNA，F(xiàn)+細(xì)胞

b.染色體外雙鏈環(huán)形DNAF?細(xì)胞

+

寄主染色體DNA片段

c.以線性DNA形式整合到Hfr細(xì)胞寄主染色體DNA上。

接合型質(zhì)粒F因子的接合轉(zhuǎn)移：

F+細(xì)胞和F-細(xì)胞，以及性須pilus結(jié)構(gòu)

↓

F+細(xì)胞和F-細(xì)胞混合培養(yǎng)，通過性須作用，細(xì)胞配

對，這個過程稱細(xì)菌的接合作用(conjcogation)

↓

在細(xì)胞配對期間，F(xiàn)+細(xì)胞中的F因子接滾環(huán)復(fù)制模

型，經(jīng)過性須通道進(jìn)入F-細(xì)胞(單鏈)

↓

F-細(xì)胞變成F+細(xì)胞

質(zhì)粒的接合轉(zhuǎn)移與基因工程的安全載體問題：

從基因工程的安全性角度考慮，我們感興趣的主要是非接合型質(zhì)粒：

理由是：①接合型質(zhì)不但自身轉(zhuǎn)移；②還可引起寄主染色體

片段轉(zhuǎn)移；③而假使F因子整合到寄主染色體上，則會牽動染色體發(fā)生高頻轉(zhuǎn)移；④引起其它非接合型質(zhì)粒發(fā)生遷移作用。

5．質(zhì)粒DNA的遷移作用(mobilization)①質(zhì)粒DNA遷移作用的概念

由共存的接合型質(zhì)粒引發(fā)的非接合型質(zhì)粒的轉(zhuǎn)移過程叫做質(zhì)粒DNA的遷移作用。

非接合型質(zhì)粒由于分子量小不足以編碼轉(zhuǎn)移過程所需的全部基因，因而不能夠發(fā)生自身轉(zhuǎn)移，但假使寄主細(xì)胞中存在著共存著一種接合型質(zhì)粒，那么它們尋常也就可以被轉(zhuǎn)移。②質(zhì)粒DNA遷移作用原理

ColE1質(zhì)粒是一種可遷移的非接合型質(zhì)粒ColE1質(zhì)粒遷移的生化過程：遷移條件

bom位點，(位于ColE1質(zhì)粒分子上)mob基因編碼的核酸酶，又叫遷移蛋白

*1.bom位點又叫nic位點，遷移蛋白作用于nic位點，從

而引動非接合型質(zhì)粒發(fā)生遷移作用。

mobgene=接合性動員基因conjugativemobilizationgene.

nicsite=自我轉(zhuǎn)移的接合型質(zhì)粒在起始接合性DNA轉(zhuǎn)移時，在轉(zhuǎn)移起點oriT進(jìn)行鏈特異性及以部位特異性的單鏈切割的DNA部位。

*2.大量質(zhì)粒載體在構(gòu)建過程中已失去了nic位點，故此不能被遷移。種nic-質(zhì)粒的轉(zhuǎn)移途徑是形成融合質(zhì)粒，從而使它們在形體上變成接合型質(zhì)粒的一部分。*3.重組缺陷(recA)寄主菌株的使用

在重組缺陷的寄主菌株中，nic-質(zhì)粒就不會同接合型質(zhì)粒發(fā)生重組，因此在recA寄主中，nic-質(zhì)粒比nic質(zhì)粒較為穩(wěn)定。*4.圖4-5解釋

6．質(zhì)粒DNA的復(fù)制類型

①低拷貝數(shù)質(zhì)?！皣?yán)緊型〞控制的(stringentplasmid)高拷貝數(shù)質(zhì)?！八沙谛通晱?fù)制控制的(relaxedplasmid)

②質(zhì)?？截悢?shù)定義：在文獻(xiàn)中常用有兩種定義

A．常用定義：生長在標(biāo)準(zhǔn)的培養(yǎng)基條件下，每個細(xì)菌細(xì)

胞中所含的質(zhì)粒DNA分子數(shù)。

B．特別定度：

培養(yǎng)在富足培養(yǎng)基中快速生長的細(xì)菌細(xì)胞，可擁有3-4條染色體DNA，而在碳源供應(yīng)不足的培養(yǎng)基中緩慢生長的細(xì)菌細(xì)胞，平均只有1.1條染色體DNA。因此有的文獻(xiàn)中質(zhì)?？截悢?shù)定義是：每個細(xì)菌細(xì)胞中每條染色體平均具有的質(zhì)粒DNA分子數(shù)。

C．本書定義：在LB液體培養(yǎng)基中生長的每個細(xì)胞中含

有高于20個以上質(zhì)粒DNA者，叫做高拷貝質(zhì)粒(High-copy-numberplasmids)；低于20個的則稱為低拷貝質(zhì)粒(low-copy-numberplasmids)。

7．質(zhì)粒的不親和性問題(incompatibility)不親和性，即不相容性

①定義：是指在沒有選擇壓力的狀況下，兩種親緣關(guān)系密切的不

同質(zhì)粒，不能夠在同一寄主細(xì)胞中穩(wěn)定共存的現(xiàn)象。

②注意：只有當(dāng)有確鑿的證據(jù)說明其次種B已經(jīng)進(jìn)入含有A質(zhì)粒

的寄主細(xì)胞，而且它的DNA不受寄主細(xì)胞限制體系的降解作用，但這兩種細(xì)胞卻不能長期共存，只有在這種狀況下，我們才能說A和B是不親和的質(zhì)粒。

③不親和群的概念：

彼此之間互不相容的質(zhì)粒，屬于同一不親和群(incompatibilitygroup)。彼此能夠共存的質(zhì)粒則屬于不同的不親和群。

同一不親和群的南粒在親緣關(guān)系上則比較接近。

④質(zhì)粒不親和性的分子基礎(chǔ)

質(zhì)粒不親和性的分子基礎(chǔ)，主要是由于它們在復(fù)制功能之間的相互干擾造成的：*1負(fù)反饋調(diào)理環(huán)(negetivefeed-backloop)

大多數(shù)質(zhì)粒產(chǎn)生可控制質(zhì)粒復(fù)制的阻遏蛋白質(zhì)，其數(shù)量與細(xì)胞中質(zhì)?？截悢?shù)成正比。

在質(zhì)?？截悢?shù)少的狀況下，細(xì)胞中阻遏蛋白質(zhì)亦相對降低，

于是阻遏蛋白質(zhì)與質(zhì)粒DNA中靶序列相互作用，使之發(fā)生復(fù)制。

隨著質(zhì)粒DNA復(fù)制的結(jié)果，質(zhì)?？截悢?shù)上升，于是所編碼產(chǎn)生的阻遏蛋白質(zhì)也就隨之增多。

細(xì)胞中阻遏蛋白質(zhì)濃度增多的結(jié)果，會形成二聚體，于是失去與質(zhì)粒DNA結(jié)合并促使其發(fā)生復(fù)制的能力。

結(jié)果質(zhì)粒復(fù)制中止，也就是說質(zhì)?？截悢?shù)是受阻遏蛋白質(zhì)的負(fù)反饋調(diào)理：

負(fù)反饋調(diào)理環(huán)(negetivefeed-backloop)

當(dāng)質(zhì)粒面臨高拷貝數(shù)和高濃度的阻遏蛋白時，其

復(fù)制活動便被抑制了。

當(dāng)質(zhì)粒處于低拷貝數(shù)和低濃度的阻遏蛋白時，其

復(fù)制活動更會繼續(xù)時行。*2.同一個細(xì)胞含兩種相容質(zhì)粒由于這兩種相容質(zhì)粒親緣關(guān)系遠(yuǎn)，故它們所產(chǎn)生的阻遏蛋白質(zhì)就不會相互影響另一個質(zhì)粒的復(fù)制。于是這兩種相容的質(zhì)粒在同一細(xì)胞中都保持著自己的正?？截悢?shù)。*3.同一細(xì)胞含兩種不相容的質(zhì)粒

鑒于這不相容的質(zhì)粒親緣關(guān)系密切，它們所產(chǎn)生的阻遏蛋白質(zhì)不僅影響自身質(zhì)粒DNA復(fù)制，還會彼此影響對方質(zhì)粒DNA的復(fù)制。這就出現(xiàn)了兩種阻遏蛋白質(zhì)聯(lián)合調(diào)控質(zhì)粒復(fù)制速率。

↓

質(zhì)粒拷貝數(shù)控制體系無法分辯這兩種不相容性質(zhì)粒，只是隨機(jī)地選擇其中一種進(jìn)行復(fù)制。于是出現(xiàn)拷貝數(shù)偏差。

↓

兩種不相容質(zhì)粒往往拷貝數(shù)不相當(dāng)，其中高拷貝數(shù)的對復(fù)制抑制劑的敏感性較低拷貝數(shù)的要差一些。因此在復(fù)制抑制劑(阻遏蛋白質(zhì))濃度低的狀況下，高拷貝質(zhì)粒仍可復(fù)制，從而最終使低拷貝質(zhì)粒被淘汰掉(稀釋掉)。

由于isopropanol或isobutanol兩者均能從DNA溶液中移去水，從而使DNA得到濃縮。這樣也就改變了DNAbuffer的體系的體積，所以事先得用DNAbuffer飽和isopropanol或isobutanol。

應(yīng)盡量除凈EtBr，因它影響酶切反應(yīng)。

四、質(zhì)粒DNA的復(fù)制與拷貝數(shù)的控制

1．ColE1質(zhì)粒DNA復(fù)制調(diào)理的機(jī)理(FromL.SnyderandW.Champrees.P.111-112)

(1)RNAI和RNAII分子：

RNAI和RNAII這兩種分子都是由ColE1DNA轉(zhuǎn)錄產(chǎn)生的，是控制ColE1質(zhì)粒復(fù)制的兩種關(guān)鍵因素。

RNAI和RNAII分子的互補(bǔ)關(guān)系：由于這兩種RNA分子是根

據(jù)同一區(qū)段DNA的正反鏈合成的，因此兩者的序列是彼此互補(bǔ)的。

RNAI是由ColE1質(zhì)粒的inc基因編碼的一種小分子量的RNA

分子，它通過干擾RNAII分子的加工而抑制質(zhì)粒DNA分子的復(fù)制。

RNAII也是由ColE質(zhì)粒DNA編碼的另一種小分子量的RNA

分子，它可形成質(zhì)粒DNA復(fù)制的引物，并在復(fù)制起點形成RNA-DNA雜交分子。

(2)RNase的功能：

RNase是一種核酸內(nèi)切酶，它切割RNAII分子釋放出3?-OH作為DNA聚合酶I催化的DNA復(fù)制的引物。但是，除非RNAII被RNaseH加工，否則它無*(見P.5-16頁)

這種蛋白質(zhì)形成二聚體，加強(qiáng)了RNAI和RNAII之間的堿基配對作用。結(jié)果RNAII(引物)的加工便被抑制，甚至于在RNAI分子處于相對低濃度的狀況下亦是如此。2．質(zhì)粒DNA拷貝數(shù)的控制(1)自然質(zhì)?？截悢?shù)的控制

試驗證明，一個細(xì)胞中每種質(zhì)?？截悢?shù)的多寡是通過控制DNA合成的啟動速率來調(diào)理的。

低拷貝質(zhì)?！诩?xì)胞分裂前只需復(fù)制少數(shù)幾次就夠了。高拷貝質(zhì)?！诩?xì)胞分裂前需要復(fù)制屢屢才能達(dá)到足夠

數(shù)量的拷貝數(shù)。

(2)雜種質(zhì)?？截悢?shù)的控制

pSC134質(zhì)粒是由ColE1和pSC101重組形成，這兩個質(zhì)粒的

拷貝數(shù)分別為18個和6個。

①從ColE1ori開始的復(fù)制，pSC134拷貝數(shù)可達(dá)16個，大體接近ColE1的拷貝數(shù)。

圖

ColE1及其派生質(zhì)粒的復(fù)制調(diào)理：RNAII分子在其能夠引發(fā)質(zhì)粒DNA進(jìn)行之前，必需經(jīng)受RNaseH的加工。(RNAII分子必需經(jīng)過RNaseH加工之后，才能引動質(zhì)粒DNA進(jìn)行復(fù)制)?！捌瘘corigin〞表示RNA引物和DNA之間的轉(zhuǎn)換點(transitionpoint)。在大部分時間中，RNAI和RNAII分子結(jié)合，從而抑制(RNaseH)對RNAII的加工，結(jié)果質(zhì)粒的拷貝數(shù)受到了調(diào)理。PRNAI和PRNAII是分別代表RNAI和RNAII轉(zhuǎn)錄的啟動子。RopProtein二聚體加強(qiáng)了RNAI和RNAII之間的起始配對。

法作為引物啟動質(zhì)粒DNA的復(fù)制，因此質(zhì)粒DNA的復(fù)制活動也就中止了。由于RNAI和RNAII這兩種RNA分子的

序列是彼此互補(bǔ)的，故可形成雙鏈的RNA雙螺旋分子。這種結(jié)構(gòu)的形成便阻止了RNAII分子的加工，從而阻止了質(zhì)粒DNA的復(fù)制。

(3)ColE1質(zhì)粒維持其拷貝數(shù)的機(jī)理

上述這些狀況解釋了為什么ColE1質(zhì)粒能夠維持其拷貝數(shù)的原因：

*1.由于RNAI分子先由ColE1質(zhì)粒DNA編碼合成的，所以當(dāng)質(zhì)粒拷貝數(shù)增多時，便可合成出較多數(shù)量的RNAI分子。而高濃度的RNAI分子又反過來干擾大多數(shù)RNAII分子的加工，于是質(zhì)粒DNA的復(fù)制便被抑制。當(dāng)細(xì)胞中質(zhì)粒的拷貝數(shù)達(dá)到大約16個時(ColE1質(zhì)粒的拷貝數(shù)是每個細(xì)胞16個)，質(zhì)粒DNA的復(fù)制便幾乎被完全抑制。*2.除了RNAI之外，質(zhì)粒編碼的一種叫做Rop的蛋白質(zhì)，也幫助維持ColE1質(zhì)粒的拷貝數(shù)。

3．質(zhì)粒復(fù)制控制的分子模型：

*抑制蛋白質(zhì)稀釋模型(Inhibitordilutionmodel)

關(guān)鍵論點是：阻遏蛋白質(zhì)是組成型合成，其濃度同質(zhì)粒的拷貝數(shù)

成正比。

*自體阻遏蛋白質(zhì)模型(Autorepressormodel)

關(guān)鍵論點是：阻遏蛋白質(zhì)的合成受負(fù)反饋(Negativefeedback)機(jī)

理調(diào)理，而且其濃度是恒定的。

1．抑制蛋白質(zhì)稀釋模型

觀點：a.質(zhì)粒DNA的復(fù)制，是受一種由質(zhì)粒DNA編碼的抑制蛋

白質(zhì)Cop調(diào)控的。

b.細(xì)胞中Cop蛋白質(zhì)的濃度是同質(zhì)粒分子的拷貝數(shù)成正比。

c.Cop蛋白質(zhì)抑制質(zhì)粒DNA復(fù)制活性的作用方式有兩種途徑：

第一種途徑：直接抑制途徑。

通過同質(zhì)粒DNA的復(fù)制起點(Ori)結(jié)合，直接地抑制質(zhì)粒的復(fù)制。

其次種途徑：間接抑制途徑

通過阻斷起始蛋白質(zhì)的合成，間接地抑制質(zhì)粒DNA的合成。

*一般認(rèn)為單體狀態(tài)的Cop抑制蛋白質(zhì)沒有活性，只有它處于多體狀態(tài)時是才有活性的；單體抑制蛋白質(zhì)

和多體抑制蛋白質(zhì)間的平衡，完全取決于細(xì)胞中的抑制蛋白質(zhì)自身的濃度；

作用機(jī)理：在細(xì)胞生長過程中，體積加大→抑制蛋白質(zhì)的濃度

隨之下降→形成單體的抑制蛋白質(zhì)→失去抑制活性，結(jié)果對質(zhì)粒DNA的復(fù)制的抑制作用也就被撤除了→質(zhì)粒DNA復(fù)制啟動→拷貝數(shù)不斷上升→到一定程度形成多體形式的抑制蛋白質(zhì)→具有抑制活性→重新導(dǎo)致質(zhì)粒DNA復(fù)制活性的抑制。

2．自體阻遏蛋白質(zhì)模型

第一種解釋：質(zhì)粒DNA的復(fù)制是由一種叫做起始因子蛋白質(zhì)Rep

引發(fā)的；

這種Rep蛋白質(zhì)是質(zhì)粒DNA復(fù)制啟動作用的限速因子，它的濃度決定著每個細(xì)胞每個世代之質(zhì)粒分子的最終復(fù)制總數(shù)；

Rep=起始因子蛋白質(zhì)

起始因子蛋白質(zhì)Rep的編碼基因rep和自體阻遏蛋白質(zhì)編碼基因atr，同屬于一個操縱子，共轉(zhuǎn)錄成一個mRNA分子；

Atr=自體阻遏蛋白質(zhì)

自體阻遏蛋白質(zhì)通過同啟動子-操縱單元(P/O)的結(jié)合作用，調(diào)理質(zhì)粒DNA的轉(zhuǎn)錄作用，以維持細(xì)胞中Atr和Rep蛋白質(zhì)處于恒定的水平；

由Atr蛋白質(zhì)調(diào)理產(chǎn)生的Rep蛋白質(zhì)，是通過同復(fù)制起點(ori)的結(jié)合，引發(fā)質(zhì)粒DNA的復(fù)制。

其次種解釋：Rep蛋白質(zhì)是一種具有雙重功能的蛋白質(zhì)：

a.它既有自體阻遏蛋白質(zhì)的功能，可同P/O區(qū)結(jié)合而抑制轉(zhuǎn)錄作用；

b.它又既有起始蛋白質(zhì)的功能，能對復(fù)制起點(ori)發(fā)生作用，引發(fā)質(zhì)粒DNA進(jìn)行復(fù)制。

自體阻遏蛋白質(zhì)提供的這種負(fù)反饋環(huán)(Negativefeedbackloop)。保證了細(xì)胞中的Rep蛋白質(zhì)的濃度，因而也就是質(zhì)粒DNA的復(fù)制速率，是處于恒定狀態(tài)，而與細(xì)胞的體積、生長速率或質(zhì)粒的拷貝數(shù)無關(guān)。

五、質(zhì)粒載體的構(gòu)建及其類型1．質(zhì)粒載體必需具備的條件

a.具有復(fù)制起點：這是質(zhì)粒增殖所必不可少的條件，亦可幫助維持

正常的質(zhì)粒拷貝數(shù)

b.具有抗菌素抗性基因：提供轉(zhuǎn)化子的選擇記號，理想的質(zhì)粒載

體應(yīng)具兩個抗菌素抗性基因。在外源DNA插入之后，仍應(yīng)保存一個強(qiáng)選擇記號。

c.具有若干種限制酶單一識別位點：

這一特點可滿足克隆需求，而且要求在插入了外源DNA片段之后，應(yīng)不影響質(zhì)粒DNA的復(fù)制功能。

d.具有較小的分子量和較高的拷貝數(shù)

易于操作，而且在插入了外源DNA(一般不超