分子克隆技術(shù)第三章

第一節(jié)基因克隆技術(shù)概述第三章載體一、 基因克隆技術(shù)第三章載體基因克隆技術(shù)包括把來自不同生物的基因同有自主復(fù)制能力的載體DNA在體外人工連接，構(gòu)建成新的重組的DNA,然后送入受體生物中去表達(dá)，從而產(chǎn)生遺傳物質(zhì)和狀態(tài)的轉(zhuǎn)移和重新組合。二、 目的基因的取得1、 直接2、 反轉(zhuǎn)錄酶3、 化學(xué)合成4、 基因文庫5、 PCR?首先利物理方法（如剪切力、超聲波等）或酶化學(xué)方法（如限制性內(nèi)切核酸酶）將生物細(xì)胞染色體DNA切割成為基因水平的許多片段，繼而將這些片段與適當(dāng)?shù)妮d體結(jié)合。將重組DNA轉(zhuǎn)入受體菌擴(kuò)增，獲得無性繁殖的基因文庫，再結(jié)合篩選方法，從眾多的轉(zhuǎn)化子菌株中選出含有某一基因的菌株，從中將重組的DNA分離、回收。這種方法也就是應(yīng)用基因工程技術(shù)術(shù)分離目的基因，其特點(diǎn)是繞過直接分離基因的難關(guān)，在基因組DNA文庫中篩選出目的基因?？梢哉f這是利用“溜散彈射擊”原理去“命中”某個(gè)基因。由于目的基因在整個(gè)基因組太小，在像當(dāng)程度上還得靠“碰運(yùn)氣”，所以人們稱這個(gè)方法為“鳥槍法”或“散彈槍”實(shí)驗(yàn)法。

?面包酵母吲哚甘油磷酸脫氫酶基因的制取，先用EcoRI把面包酵母DNA切成許多片段，使這些片段與2載體連成重組DNA，可把這些重組DNA導(dǎo)入“吲哚甘油磷酸脫氫酶型組氨酸缺陷型”大腸桿菌，在基本培養(yǎng)基中培養(yǎng)。只有引入了該基因的細(xì)菌才能生長。進(jìn)一步分離這種菌株，可以得到目的基因。三、重組體的構(gòu)建1、載體要把一個(gè)有用的基因通過基因工程手段送進(jìn)生物細(xì)胞中，需要運(yùn)載工具，攜帶外源基因進(jìn)入受體細(xì)胞的這種工具叫載體（Vector）。（1） 質(zhì)粒（plasmid）（2） 噬菌體九的衍生物（3） 科斯質(zhì)粒（cosmid）（4） 單鏈DNA噬菌體M13（5）病毒

2、 載體的性質(zhì)1） 它必須具有能夠在某些宿主細(xì)胞中獨(dú)立地自我復(fù)制和表達(dá)的能力。2） 載體DNA的分子量應(yīng)該較小。3） 載體上最好應(yīng)具有兩個(gè)以上的容易檢測的遺傳標(biāo)記（如抗藥性基因等），以賦予宿主細(xì)胞以不同的表型。4） 載體應(yīng)該具有多個(gè)限制性內(nèi)切酶的單一切點(diǎn)；載體上的單一酶切位點(diǎn)最好是位于檢測表型的遺傳標(biāo)記基因之內(nèi)，這樣目的基因是否已連接載體就可以通過這一表型的改變與否而得知，利于篩選重組體。3、 酶系的選用四、轉(zhuǎn)化及重組子篩選鑒定1、 轉(zhuǎn)化(transformation)獲得重組DNA以后，必須將它導(dǎo)入宿主細(xì)胞中以擴(kuò)增表達(dá)，這個(gè)導(dǎo)入宿主細(xì)胞的過程稱為轉(zhuǎn)化(transformation)感受態(tài)(competence)、電擊2、 重組子3、 重組子的篩選方法(1)載體上的報(bào) 告基因(reportergene)抗藥性基因、lac基因的顯色反應(yīng)、發(fā)光基因(lux)單菌落擴(kuò)增菌落雜交第二節(jié)質(zhì)粒載體(PlasmidVector)一、 質(zhì)粒的概念附加體(整合質(zhì)粒，intergrativeplasmid)二、 質(zhì)粒的一般生物學(xué)特性1、質(zhì)粒DNASC構(gòu)型：共價(jià)閉合環(huán)形DNA(closedcircleDNA,ccDNA)OC構(gòu)型開環(huán)DNA(opencircleDNA,ocDNA)L型線性DNA(linkerDNA,lDNA)質(zhì)粒名稱質(zhì)粒來源核苷酸長度(kb)分子量(MD)pTiAch5土壤農(nóng)桿菌213142ToL假單胞菌11778F大腸桿菌9563RP4假單胞菌5436ColE1大腸桿菌6.364.2pBR322大腸桿菌4.3622.9pBR345大腸桿菌0.70.462、質(zhì)粒的復(fù)制與遺傳根據(jù)質(zhì)粒與宿主菌的相關(guān)程度某種質(zhì)粒在一個(gè)細(xì)菌細(xì)胞內(nèi)的數(shù)目就稱為這種質(zhì)粒的拷貝數(shù)(copynumber)嚴(yán)密型質(zhì)粒(stringentplasmid)松弛型質(zhì)粒(relaxedplasmid)根據(jù)質(zhì)粒是否帶有轉(zhuǎn)移基因(tra基因)接合型質(zhì)粒(傳遞性質(zhì)粒)非接合型質(zhì)粒嚴(yán)密型質(zhì)粒(stringentplasmid)嚴(yán)密型質(zhì)粒通常是一些具有自身傳遞能力的大質(zhì)粒，復(fù)制與宿主菌密切相關(guān)，宿主菌內(nèi)只有1-2個(gè)質(zhì)?？截惔嬖冢?dāng)宿主菌蛋白合成停止時(shí)，質(zhì)粒的DNA復(fù)制也就隨之停止松弛型質(zhì)粒(relaxedplasmid)松弛型質(zhì)粒通常是分子量較小，不具傳遞能力的質(zhì)粒，它在宿主菌內(nèi)通?？珊?0-200個(gè)拷貝，而且不受宿主菌蛋白合成的影響，當(dāng)宿主菌蛋白質(zhì)合成停止時(shí)，例如當(dāng)宿主菌遇上有抑制蛋白質(zhì)合成并阻斷細(xì)菌染色體復(fù)制的氯霉素或壯觀霉素存在時(shí)，質(zhì)粒DNA的復(fù)制仍可繼續(xù)進(jìn)行，甚至可將數(shù)十個(gè)增至幾千個(gè)。?接合型質(zhì)粒又叫傳遞性質(zhì)粒，接合型質(zhì)?？梢詮囊粋€(gè)細(xì)胞自主地轉(zhuǎn)移到原來不存在這種質(zhì)粒的另一個(gè)細(xì)胞中去。接合型質(zhì)粒的分子比較大，編碼一套控制質(zhì)粒DNA轉(zhuǎn)移的基因。這一過程是由接合型質(zhì)粒上的轉(zhuǎn)移基因(tragenes)控制的。?非接合型質(zhì)粒，由于分子小，不足以編碼全部轉(zhuǎn)移體系所需要的基因，因而不能夠自我轉(zhuǎn)移。?所謂質(zhì)粒的不親和性，有時(shí)也稱為不相容性，是指在沒有選擇壓力的情況下，兩種親緣關(guān)系密切的不同質(zhì)粒，不能夠在同一個(gè)寄主細(xì)胞系中穩(wěn)定地共存的現(xiàn)象?只有在確實(shí)證明第二種質(zhì)粒B已經(jīng)進(jìn)入含有第一種質(zhì)粒A的寄主細(xì)胞，而它的DNA并不受寄主細(xì)胞限制體系的降解作用，但這兩種質(zhì)粒卻不能長期穩(wěn)定共存，在這種情況下，我們才能夠說A和B是不親和的質(zhì)粒?質(zhì)粒不親和的分子基礎(chǔ)，主要是由于它們?cè)趶?fù)制功能之間的相互干擾造成的。根據(jù)質(zhì)粒上帶有特殊用途的基因1)生殖性質(zhì)粒(fertilityplasmid)這類質(zhì)粒簡稱“F質(zhì)?！?，它有tra基因，主要用于細(xì)胞間的接合生殖(F因子)2)抗性質(zhì)粒(resistanceplasmid)抗性質(zhì)粒簡稱R質(zhì)粒，它攜帶有賦予宿主細(xì)胞一種或多種抗生素抗性的基因，這些抗生素包括土霉素，氨芐霉素等。(R因子)3)Col質(zhì)粒Col質(zhì)?？梢跃幋a一種可殺死其他細(xì)菌的蛋白colicin。4)降解質(zhì)粒(degradativeplasmid)降解質(zhì)粒主要是使宿主細(xì)菌消化一些非“正?！钡姆肿?，如水楊酸等。5)致病質(zhì)粒(virulenceplasmid)致病質(zhì)粒賦予宿主細(xì)菌細(xì)胞以病原菌侵染性，例如土壤農(nóng)桿菌中的Ti質(zhì)粒(誘導(dǎo)腫瘤質(zhì)粒，Tumorinducingplasmid)可以在大多數(shù)雙子葉植物和少數(shù)單子葉植物上誘導(dǎo)形成冠癭病。?3、構(gòu)建質(zhì)?？寺≥d體的基本策略分子量盡可能小，多拷貝，而且便于提取和純化。分子量越小越能抵抗機(jī)械剪切力的切割，可容納外源性DNA就越長。分子量小的質(zhì)粒往往屬于松弛型質(zhì)粒。缺失tra基因，質(zhì)粒就不會(huì)從一個(gè)細(xì)菌接觸轉(zhuǎn)移到另一個(gè)細(xì)菌，所以是非接合型質(zhì)粒。質(zhì)粒序列中具有一個(gè)或多個(gè)單一的限制性內(nèi)切酶位點(diǎn)。具有一個(gè)或幾個(gè)報(bào)告基因，而且引入的基因應(yīng)在限制性內(nèi)切酶的單切點(diǎn)之內(nèi)，由于插入外源基因，這個(gè)報(bào)告基因滅活，從而便于篩選重組體?！?、質(zhì)粒的改造?“天然質(zhì)粒”：它一般是指那些沒有經(jīng)過以基因克隆為目標(biāo)的體外修飾改造的質(zhì)粒。?在大腸桿菌中，常見的可用于基因克隆的天然質(zhì)粒有ColEI、RSF2124和pSC101。?第一個(gè)用于基因克隆的是天然質(zhì)粒PSC101,它對(duì)于EcoRI限制酶只有一個(gè)識(shí)別位點(diǎn)，而且在此克隆外源DNA既不會(huì)影響它的復(fù)制功能，也不會(huì)破壞其唯一的四環(huán)素抗性選擇記號(hào)（Tetp。三、常用的質(zhì)粒載體（一）pBR322質(zhì)粒載體?萬能質(zhì)粒之稱1、標(biāo)準(zhǔn)的質(zhì)粒載體命名法則“P”表示它是一種質(zhì)?！癇R”則是分別取自該質(zhì)粒的兩位主要構(gòu)建者F.Bolivar和R.L.Rodriguez姓氏的頭一個(gè)字母“322”系指實(shí)驗(yàn)編號(hào)“BR"恰好與“細(xì)菌抗藥性”（bacterialresistance）兩個(gè)詞的第一個(gè)英語字母等同2、2、pBR322質(zhì)粒載體的物理圖譜EcoRIGAATTC3、pBR322質(zhì)粒載體的構(gòu)建PBR322質(zhì)粒的親本之一是pMB1質(zhì)粒。復(fù)制子的來源。PBR322質(zhì)粒上的氨芐青霉素抗性基因（Ampr）是取自于PSF2124質(zhì)粒?來源于PSC1O1質(zhì)粒的四環(huán)素抗性基因（Tetr）;?在PBR322質(zhì)粒載體的構(gòu)建過程中的一個(gè)重要目標(biāo)是縮小基因組的體積，這就需要從質(zhì)粒DNA上移去一些對(duì)基因克隆載體無關(guān)緊要的DNA片段，同時(shí)也伴隨著消除掉若干個(gè)對(duì)DNA克隆無用的限制酶識(shí)別位點(diǎn)。還要設(shè)法使質(zhì)粒內(nèi)存在的任何易位子統(tǒng)統(tǒng)失去功能。31J74363/1來自pMBI的DNA區(qū)段的DZA區(qū)段圖4-23PBR322質(zhì)粒載體的結(jié)構(gòu)來源4、PBR322質(zhì)粒載體的優(yōu)點(diǎn)?具有較小的分子量。統(tǒng)一規(guī)定pBR322質(zhì)粒DNA分子核苷酸的計(jì)數(shù)從EcoRI限制酶的識(shí)別位點(diǎn)開始，并公認(rèn)該序列--GAATTC--中的第一個(gè)T為核苷酸1。?克隆載體的分子大小最好不要超過10kb（6kb）。?具有兩種抗菌素抗性基因可供作轉(zhuǎn)化子的選擇記號(hào)。因DNA插入而導(dǎo)致基因失活的現(xiàn)象，稱之為插入失活效應(yīng)。AmpsTets，AmprTets，AmpsTetr?具較高的拷貝數(shù)，而且經(jīng)過氯霉素?cái)U(kuò)增之后，每個(gè)細(xì)胞中可累積1000?3000個(gè)拷貝。（二）pUC質(zhì)粒載體1、概述?在PBR322質(zhì)粒載體的基礎(chǔ)上，組入了一個(gè)在其5'-端帶有一段多克隆位點(diǎn)（multiplecloningsites,MCS）的lacZ基因而發(fā)展成為具有雙功能檢測特性的新型質(zhì)粒載體系列。pUC,是因?yàn)樗怯擅绹永Ｄ醽喆髮W(xué)（UniversityofCalifornia）的科學(xué)家J.Messing和J.Vieria于1987年首先構(gòu)建的。2、pUC質(zhì)粒載體的結(jié)構(gòu)（i） 來自pBR322質(zhì)粒的復(fù)制起點(diǎn)（ori）；（ii） 氨芐青霉素抗性基因（Amp1）,但它的DNA核苷酸序列已經(jīng)發(fā)生了變化，不再含有原來的核酸內(nèi)切限制酶的單識(shí)別位點(diǎn)；（iii） 大腸桿菌卩-半乳糖酶基因（lacZ）的啟動(dòng)子及其編碼a-肽鏈的DNA序列，此結(jié)構(gòu)特稱為lacZ'基因；（iv） 位于lacZ'基因中的靠近5'-端的一段多克隆位點(diǎn)（MCS）區(qū)段，但它并不破壞該基因的功能。3、pUC質(zhì)粒載體的優(yōu)點(diǎn)1、具有更小的分子量和更高的拷貝數(shù)在pBR322基礎(chǔ)上構(gòu)建pUC質(zhì)粒載體時(shí)，僅保留下其中的氨芐青霉素抗性基因及復(fù)制起點(diǎn)，使其分子大小相應(yīng)地縮小了許多2、適用于組織化學(xué)方法檢測重組體pUC8質(zhì)粒結(jié)構(gòu)中具有來自大腸桿菌lac操縱子的lacZ'基因，所編碼的a-肽鏈可參與a-互補(bǔ)作用。因此，在應(yīng)用pUC8質(zhì)粒為載體的重組實(shí)驗(yàn)中，可用X-gal顯色的組織化學(xué)方法一步實(shí)現(xiàn)對(duì)重組體轉(zhuǎn)化子克隆的鑒定3、具有多克隆位點(diǎn)MCS區(qū)段（三）TA克隆載體■TaqDNA聚合酶具有一種非模板依賴性活性，這種活性可以在PCR產(chǎn)物的3'端加上一個(gè)非配對(duì)的脫氧腺嘌呤核苷（A）。根據(jù)這一特點(diǎn)研制出了一種線性質(zhì)粒，其5'端各帶