放免技術(shù)的資料

放免技術(shù)的資料第1頁/共70頁第一節(jié)概述一、熒光的基本知識二、熒光物質(zhì)第二節(jié)熒光抗體技術(shù)一、標(biāo)本的制作二、熒光抗體的制備三、熒光抗體染色與結(jié)果判斷四、熒光顯微鏡的基本結(jié)構(gòu)第三節(jié)熒光免疫分析的類型一、時間分辨熒光免疫測定二、熒光偏振免疫測定三、熒光酶免疫測定第四節(jié)熒光免疫技術(shù)在醫(yī)學(xué)檢驗中的應(yīng)用一、熒光抗體技術(shù)的應(yīng)用二、熒光免疫測定的應(yīng)用第2頁/共70頁

第一節(jié)概述

第3頁/共70頁熒光（fluorescence）

熒光物質(zhì)吸收激發(fā)光的能量后，電子從基態(tài)躍遷到激發(fā)態(tài)，當(dāng)其回復(fù)至基態(tài)時，以發(fā)射光形式釋放出能量，稱為熒光。

一、熒光的基本知識取決于物質(zhì)本身的結(jié)構(gòu)及其周圍的介質(zhì)環(huán)境光致熒光化學(xué)熒光陰極射線熒光第4頁/共70頁發(fā)射光譜和激發(fā)光譜

發(fā)射光譜是指固定激發(fā)波長，在不同波長下記錄的樣品發(fā)射熒光的強度。激發(fā)光譜是指固定檢測發(fā)射波長，用不同波長的激發(fā)光激發(fā)樣品記錄的相應(yīng)的熒光發(fā)射強度。

熒光的基本知識第5頁/共70頁熒光效率定義:熒光物質(zhì)分子將光能轉(zhuǎn)變成熒光的百分率計算公式:

熒光效率=

如何得到最高的熒光效率？熒光的基本知識第6頁/共70頁熒光淬滅

定義:熒光物質(zhì)在某些理化因素作用下，發(fā)射熒光減弱甚至消退稱為熒光淬滅。如紫外線照射、亞甲藍、堿性復(fù)紅、低濃度的高錳酸鉀、I-等。作用：以減弱非特異性本底。熒光的基本知識第7頁/共70頁熒光壽命定義:熒光物質(zhì)被激發(fā)后所產(chǎn)生的熒光衰減到一定程度時所用的時間。各種熒光物質(zhì)的熒光壽命不同。

熒光的基本知識第8頁/共70頁熒光偏振

FH－FLP＝──────

FH＋FL熒光的基本知識第9頁/共70頁熒光物質(zhì)是一類能吸收激發(fā)光的光能而發(fā)射熒光的物質(zhì)。

具備的條件二、熒光物質(zhì)（1）具有能與蛋白質(zhì)分子形成共價鍵的化學(xué)基團，結(jié)合蛋白質(zhì)后不易解離，而未與蛋白質(zhì)結(jié)合的色素及其降解產(chǎn)物容易被清除；（2）熒光效率高，與蛋白質(zhì)結(jié)合后，仍能保持較高的熒光效率；（3）熒光的顏色與背景組織的顏色對比鮮明。（4）結(jié)合蛋白質(zhì)后，不影響蛋白質(zhì)的生化性質(zhì)及免疫學(xué)活性，而且色素與蛋白質(zhì)結(jié)合的方法簡單而快速，結(jié)合物穩(wěn)定，易于保存。（5）安全無毒，不具有附加的抗原性。第10頁/共70頁熒光物質(zhì)最大吸收光譜最大發(fā)射光譜應(yīng)用異硫氰酸熒光素(FITC)490～495nm520～530nm（黃綠色）FAT、熒光偏振免疫測定四乙基羅丹明(RB200)570～575nm595～600nm（橘紅色）FITC的襯比染色或雙標(biāo)記FAT四甲基異硫氰酸羅丹明(TRITC)550nm620nm（橙紅色）FITC的襯比染色或雙標(biāo)記FAT藻紅蛋白（PE）490-560nm595nm（紅色）雙標(biāo)記FAT、流式細(xì)胞術(shù)Eu3+螯合物340nm613nm時間分辨熒光免疫測定常用的熒光物質(zhì)第11頁/共70頁

第二節(jié)

熒光抗體技術(shù)

第12頁/共70頁熒光抗體技術(shù)的基本原理

熒光色素與特異性抗體以共價鍵牢固結(jié)合，而不影響該免疫血清的抗體活性，成為熒光標(biāo)記的抗體，在一定條件下使之在涂片上或組織切片上與標(biāo)本中的待測抗原特異性地結(jié)合，然后采用高發(fā)光效率的點光源，透過濾色板發(fā)出一定波長的光，激發(fā)標(biāo)本中結(jié)合的熒光素而產(chǎn)生熒光，借助熒光檢測儀察看熒光現(xiàn)象或測量熒光強度，從而判斷抗原或抗體的有無、定位和分布情況，或檢測受檢標(biāo)本中抗原（抗體）的含量等。第13頁/共70頁熒光抗體技術(shù)的內(nèi)容

抗體的純化抗體的熒光色素標(biāo)記標(biāo)記抗體的純化熒光標(biāo)記抗體染色熒光顯微鏡檢查第14頁/共70頁抗體要求

高純度高特異性高親和力高效價一、熒光抗體的制備第15頁/共70頁有能與蛋白質(zhì)形成共價健的化學(xué)基團，與蛋白質(zhì)結(jié)合后不易解離，而未結(jié)合的色素及其降解產(chǎn)物易于清除。熒光效率高，與蛋白質(zhì)結(jié)合后，仍保持較高的熒光效率。熒光色澤與背景組織的色澤對比鮮明。與蛋白質(zhì)結(jié)合后不影響蛋白質(zhì)原有的生化與免疫性質(zhì)。標(biāo)記方法簡單、安全無毒。與蛋白質(zhì)的結(jié)合物穩(wěn)定，易于保存。熒光素要求熒光抗體的制備第16頁/共70頁抗體的熒光素標(biāo)記標(biāo)記原理:利用抗體蛋白的自由氨基（-NH2）與FITC的異硫氰基(-N=C=S)在堿性溶液中形成硫碳酰胺鍵，使抗體與FITC結(jié)合成熒光抗體。標(biāo)記方法:

攪拌法：適于標(biāo)記體積較大、蛋白含量較高的抗體。標(biāo)記時間短，熒光素用量少，但有非特異性染色。

透析法：適于標(biāo)記樣品量少，蛋白含量低的抗體。標(biāo)記比較勻，非特異染色較低，但熒光素用量多。熒光抗體的制備第17頁/共70頁溫度、時間pH蛋白含量熒光素純度熒光素用量熒光抗體標(biāo)記影響因素?zé)晒饪贵w的制備第18頁/共70頁去除游離熒光素及其降解產(chǎn)物：透析或凝膠過濾去除熒光素未結(jié)合和結(jié)合過度的抗體：陰離子交換層析法去除交叉反應(yīng)或非期望抗體：動物肝粉吸收或固相抗原吸收熒光抗體的純化熒光抗體的制備目的？第19頁/共70頁熒光素與蛋白結(jié)合率：

F/P=抗體效價：雙向免疫擴散試驗抗體特異性：免疫電泳或交叉免疫電泳抗體特異性染色滴度：倍比稀釋熒光抗體的鑒定熒光抗體的制備第20頁/共70頁-20℃：保存1～2年真空干燥：長期保存熒光抗體的保存熒光抗體的制備第21頁/共70頁組織切片：冷凍切片、石蠟切片（最常用）印片：肝、脾、淋巴結(jié)等器官或組織

涂片：各種體液、穿刺液、細(xì)菌培養(yǎng)物和細(xì)胞懸液培養(yǎng)細(xì)胞：單層培養(yǎng)細(xì)胞標(biāo)本的類型二、標(biāo)本的制作第22頁/共70頁冷凍切片：操作簡單，抗原損失少，組織細(xì)胞結(jié)構(gòu)欠清晰。

石蠟切片：組織細(xì)胞結(jié)構(gòu)顯現(xiàn)清楚，抗原損失多。組織切片的類型標(biāo)本的制作第23頁/共70頁固定劑：丙酮、乙醇、甲醇、甲醛等

保存：立即使用或-20℃保存標(biāo)本的固定和保存標(biāo)本的制作第24頁/共70頁直接法直接熒光抗體染色法示意圖熒光素標(biāo)記的特異性抗體直接與相應(yīng)抗原反應(yīng)。三、熒光抗體染色及結(jié)果判斷第25頁/共70頁間接法特異性抗體與相應(yīng)抗原反應(yīng)，熒光素標(biāo)記的抗抗體再與第一抗體結(jié)合。

間接熒光抗體染色法示意圖熒光抗體染色及結(jié)果判斷第26頁/共70頁雙標(biāo)記法

兩種熒光素分別標(biāo)記的兩種不同的特異性抗體，與同一標(biāo)本反應(yīng)，熒光顯微鏡觀察兩種顏色熒光。熒光抗體染色及結(jié)果判斷第27頁/共70頁

設(shè)立實驗對照:陽性對照和陰性對照

區(qū)分特異和非特異染色

陽性細(xì)胞顯色分布:胞質(zhì)型、胞核型和膜表面型熒光抗體染色結(jié)果判斷熒光抗體染色及結(jié)果判斷第28頁/共70頁

“-”：無或僅見極微弱熒光。

“+”：熒光較弱但清楚可見。

“++”：熒光明亮。

“+++”：耀眼強熒光。特異熒光強度“++”以上判定為陽性，對照光應(yīng)呈“-”或“±”。根據(jù)呈"++"的血清最高稀釋度判定特異性抗體效價。

熒光抗體染色結(jié)果判斷熒光抗體染色及結(jié)果判斷第29頁/共70頁熒光顯微鏡

利用一定波長的激發(fā)光對樣品進行激發(fā)，產(chǎn)生一定波長的熒光，對樣品結(jié)構(gòu)或其組分進行定性、定位、定量觀察檢測。

四、熒光顯微鏡的基本結(jié)構(gòu)第30頁/共70頁光源：高壓汞燈、氙燈濾光片：隔熱、激發(fā)和吸收濾光片光路：透射光、落射光聚光器：明視野、暗視野和相差熒光聚光器鏡頭：消色差鏡頭

熒光顯微鏡熒光顯微鏡的基本結(jié)構(gòu)第31頁/共70頁隔熱濾光片：阻斷紅外線通過而隔熱。激發(fā)濾光片：位于光源和物鏡之間，能選擇性地透過紫外線可見波長的光域，提供合適的激發(fā)光。

吸收濾光片：位于物鏡和目鏡之間，阻斷激發(fā)光而使發(fā)射的熒光透過，保護眼睛。熒光顯微鏡濾光片熒光顯微鏡的基本結(jié)構(gòu)第32頁/共70頁透射光：照明光線從標(biāo)本下經(jīng)聚光器透過標(biāo)本進入物鏡。落射光：照明光線從標(biāo)本上經(jīng)垂直照明器落射到標(biāo)本，經(jīng)標(biāo)本反射進入物鏡。透射熒光顯微鏡光路(a)落射熒光顯微鏡光路(b)熒光顯微鏡光路熒光顯微鏡的基本結(jié)構(gòu)第33頁/共70頁

第三節(jié)

流式熒光免疫技術(shù)

第34頁/共70頁

第四節(jié)

熒光免疫分析的類型

第35頁/共70頁熒光免疫分析的基本原理

將抗原抗體反應(yīng)與熒光物質(zhì)發(fā)光分析相結(jié)合，用熒光檢測儀檢測抗原抗體復(fù)合物中特異性熒光強度，對液體標(biāo)本中微量或超微量物質(zhì)進行定量測定。第36頁/共70頁熒光抗體技術(shù)熒光免疫測定均相熒光免疫測定（homogeneousfluorescenceimmunoassay）

非均相熒光免疫測定（heterogeneousfluorescenceimmunoassay）熒光免疫技術(shù)熒光免疫技術(shù)是將抗原抗體反應(yīng)的特異性與熒光技術(shù)的敏感性相結(jié)合，對抗原或抗體進行定性、定位或定量檢測。熒光免疫技術(shù)的類型第37頁/共70頁熒光免疫測定的方法類型

非均相熒光免疫測定：

時間分辨熒光免疫測定、熒光酶免疫測定均相熒光免疫測定：

熒光偏振免疫測定第38頁/共70頁自發(fā)熒光壽命短:1ns～10ns鑭系元素壽命長:10μs～1000μs短壽命熒光完全衰變后再測定鑭系元素特異熒光基本原理時間分辨檢測原理示意圖時間分辨一、時間分辨熒光免疫測定第39頁/共70頁stokes位移:激發(fā)光譜和發(fā)射光譜的波長差鑭系元素Stokes位移大(273nm)，激發(fā)光譜和發(fā)射光譜不重疊stokes位移基本原理時間分辨熒光免疫測定第40頁/共70頁發(fā)射光譜帶較窄：613nm±10nm，干擾少激發(fā)光譜帶較寬：30nm～500nm，靈敏度高基本原理發(fā)射光譜和激發(fā)光譜時間分辨熒光免疫測定第41頁/共70頁比活性：單位時間每個標(biāo)記分子被探測的信號量熒光激發(fā)光源1000次/S激發(fā)，比活性提高基本原理熒光標(biāo)記物的相對比活性時間分辨熒光免疫測定第42頁/共70頁結(jié)合β-二酮體Eu3+解離酸性增強液熒光增強Eu3+標(biāo)記抗原抗體復(fù)合物基本原理信號增強時間分辨熒光免疫測定第43頁/共70頁

鑭系元素銪(Eu3+)（最常用）釤(Sm3+)鋱(Tb3+)釹(Nd3+)鏑(Dy3+)標(biāo)記物熒光物質(zhì)熒光壽命(ns)熒光物質(zhì)熒光壽命(ns)非特異熒光背景1～10Sm3+-β-NTA65000人血清蛋白4.1Sm3+-PTA60000球蛋白3.0Eu3+-β-NTA714000細(xì)胞色素C3.5Eu3+-PTA925000FITC4.5Tb3+-PTA96000丹黃酰氯14Dy3+-PTA1000羅丹明B3.0常見熒光物質(zhì)的熒光壽命時間分辨熒光免疫測定第44頁/共70頁標(biāo)記方法

雙功能螯合劑：1-（對-苯偶氮）-EDTA異硫氰酸苯基-EDTA異硫氰酸苯甲基-DTTA二乙烯三胺五乙酸（DTPA）標(biāo)記方法：一步法：先螯合Eu3+，再連接蛋白質(zhì)二步法：先連接蛋白質(zhì)，再螯合Eu3+時間分辨熒光免疫測定第45頁/共70頁方法類型

雙抗體夾心法固相抗體競爭法固相抗原競爭法時間分辨熒光免疫測定第46頁/共70頁方法類型時間分辨熒光免疫測定（雙抗體夾心法）示意圖雙抗體夾心法固相抗體和Eu3+標(biāo)記抗體與待檢抗原結(jié)合，形成固相抗體-待檢抗原-Eu3+標(biāo)記抗體復(fù)合物，酸性增強液下，Eu3+解離，340nm激發(fā)光下發(fā)射613nm熒光。時間分辨熒光免疫測定第47頁/共70頁方法類型固相抗體競爭法待檢抗原和Eu3+標(biāo)記抗原與固相抗體競爭結(jié)合,溫育洗滌后在固相中加入熒光增強液,測定熒光強度，熒光強度與待檢抗原含量成反比。時間分辨熒光免疫測定第48頁/共70頁方法類型固相抗原競爭法待檢抗原和固相抗原競爭結(jié)合定量的Eu3+標(biāo)記抗體，溫育洗滌后在固相中加入熒光增強液,測定熒光強度，熒光強度與待檢抗原含量成反比。時間分辨熒光免疫測定第49頁/共70頁靈敏度高：最小檢出量10-18mol/L分析范圍寬：4～5個數(shù)量級標(biāo)記物穩(wěn)定：有效使用期長測量快速，易自動化易受污染，本底增高方法評價時間分辨熒光免疫測定第50頁/共70頁光線通過偏振濾光片后，形成一個方向的平面光稱為偏振光。偏振熒光(綠光,525nm～550nm)偏振光(藍光,485nm)熒光物質(zhì)基本原理二、熒光偏振免疫測定第51頁/共70頁

抗原抗體競爭反應(yīng)AgF分子小，轉(zhuǎn)動速度快，偏振熒光弱AgF-Ab分子大，轉(zhuǎn)動速度慢，偏振熒光強若待檢抗原多，則AgF-Ab少，AgF多，偏振熒光弱待檢抗原含量與偏振熒光強度成反比熒光偏振免疫測定原理示意圖基本原理熒光偏振免疫測定第52頁/共70頁方法評價

樣品用量少熒光素標(biāo)記試劑穩(wěn)定，使用壽命長重復(fù)性好快速，易自動化適于小、中等分子物質(zhì)檢測靈敏度較非均相熒光免疫測定法低熒光偏振免疫測定第53頁/共70頁基本原理熒光酶免疫測定熒光物質(zhì)產(chǎn)生示意圖

堿性磷酸酶標(biāo)記抗體或抗原，固相載體包被抗原或抗體，酶分解4-MUP，脫磷酸根基團形成4-MU，360nm激發(fā)光照射，發(fā)出450nm熒光。三、熒光酶免疫測定第54頁/共70頁酶和熒光底物熒光酶免疫測定標(biāo)記用酶及熒光底物

標(biāo)記酶底物熒光產(chǎn)物激發(fā)光(nm)熒光(nm)相應(yīng)信號堿性磷酸酶4-MUP4-MU36045010β-半乳糖苷酶4-MUG4-MU36045010辣根過氧化物酶HPA二聚體3174140.03熒光酶免疫測定第55頁/共70頁方法類型

雙抗體夾心法雙抗原夾心法固相抗原競爭法熒光酶免疫測定第56頁/共70頁方法類型雙抗體夾心法固相抗體和酶標(biāo)記抗體與待檢原反應(yīng)，形成固相抗體-抗原-酶標(biāo)抗體復(fù)合物，加入底物進行酶促發(fā)光反應(yīng)，發(fā)光量與待檢抗原含量成正比。熒光酶免疫測定（雙抗體夾心法）示意圖熒光酶免疫測定第57頁/共70頁方法類型雙抗原夾心法固相抗原和酶標(biāo)抗原與待檢抗體反應(yīng)，形成固相抗原-待檢抗體-酶標(biāo)抗原復(fù)合物，加入底物進行酶促發(fā)光，發(fā)光量與待檢抗體含量成正比。

熒光酶免疫測定第58頁/共70頁方法類型固相抗原競爭法待檢抗原和固相抗原競爭結(jié)合定量的酶標(biāo)抗體，洗滌除去未結(jié)合部分，固相抗原與酶標(biāo)抗體形成的復(fù)合物被留下來，加入底物進行酶促發(fā)光反應(yīng)，熒光強度與待檢抗原含量成反比。熒光酶免疫測定第59頁/共70頁方法評價

用酶和熒光底物的化學(xué)反應(yīng)作為放大系統(tǒng)，提高靈敏度背景熒光干擾測定，用固相熒光酶免疫測定效果好熒光酶免疫測定第60頁/共70頁

第四節(jié)

熒光免疫技術(shù)在醫(yī)學(xué)檢驗中的應(yīng)用

第61頁/共70頁①自身抗體檢測抗核抗體(均質(zhì)型)抗核抗體(核膜型)抗核抗體(斑點型)一、熒光抗體技術(shù)的應(yīng)用第62頁/共70頁②病原體檢測寄生蟲（猴胚腎細(xì)胞內(nèi)弓形蟲）細(xì)菌（藤黃微球菌)熒光抗體技術(shù)的應(yīng)用第63頁/共70頁③免疫病理檢測腫瘤（人肝癌細(xì)胞）熒光抗體技術(shù)的應(yīng)用第64頁/共70頁④細(xì)胞表面抗原和受體檢測將游離細(xì)胞作熒光抗體特異染色后，在特殊設(shè)計的儀器中通過噴嘴逐個流出，經(jīng)單色激光照射發(fā)出的熒光信號由熒光檢測計檢