動(dòng)物細(xì)胞工程1課件

動(dòng)物細(xì)胞工程動(dòng)物細(xì)胞工程常用的技術(shù)手段：動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)、動(dòng)物細(xì)胞核移植、動(dòng)物細(xì)胞融合、單克隆抗體動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)是其他動(dòng)物細(xì)胞工程技術(shù)的基礎(chǔ)。提問(wèn)：植物細(xì)胞工程常用的技術(shù)手段有哪些？植物組織培養(yǎng),植物體細(xì)胞雜交一動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)就是從動(dòng)物機(jī)體內(nèi)取出相關(guān)的組織，將它分散成單個(gè)細(xì)胞，然后，放在適宜的培養(yǎng)基中，讓這些細(xì)胞生長(zhǎng)和增殖。思考：動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)的過(guò)程是怎樣的呢？閱讀思考：為什么細(xì)胞培養(yǎng)要分散成單個(gè)細(xì)胞培養(yǎng)？怎樣分散？用胰蛋白酶分散細(xì)胞，說(shuō)明細(xì)胞間的物質(zhì)主要成分是什么？用胃蛋白酶行嗎？3什么是細(xì)胞貼壁和細(xì)胞接觸抑制？什么是原代培養(yǎng)和傳代培養(yǎng)？傳代培養(yǎng)的細(xì)胞具有什么特點(diǎn)？為什么細(xì)胞培養(yǎng)要分散成單個(gè)細(xì)胞培養(yǎng)？怎樣分散？1.成塊的組織中細(xì)胞與細(xì)胞靠在一起，彼此限制了細(xì)胞的生長(zhǎng)和增值。2.從健康動(dòng)物體內(nèi)取出組織塊，剪碎，用胰蛋白酶或膠原蛋白酶處理用胰蛋白酶分散細(xì)胞，說(shuō)明細(xì)胞間的物質(zhì)主要成分是什么？用胃蛋白酶行嗎？1.在進(jìn)行動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)時(shí)，用胰蛋白酶分散細(xì)胞，說(shuō)明細(xì)胞間的物質(zhì)主要是蛋白質(zhì)。2.動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)適宜的PH為7.2—7.4，此環(huán)境下胃蛋白酶（2.0）沒(méi)有活性，而胰蛋白酶(7.2-8.4)的活性較高。動(dòng)物細(xì)胞生長(zhǎng)特性：細(xì)胞貼壁：懸液中分散的細(xì)胞很快就貼附在瓶壁上，稱為細(xì)胞貼壁。要求：

培養(yǎng)瓶或培養(yǎng)皿的內(nèi)表面光滑、無(wú)毒、易于貼附。細(xì)胞的接觸抑制：當(dāng)貼壁細(xì)胞分裂生長(zhǎng)到表面相互接觸時(shí)，細(xì)胞就會(huì)停止分裂增殖，這種現(xiàn)象稱為細(xì)胞的接觸抑制。

什么是原代培養(yǎng)和傳代培養(yǎng)？傳代培養(yǎng)的細(xì)胞具有什么特點(diǎn)？原代培養(yǎng)：將動(dòng)物組織用胰蛋白酶處理成單個(gè)細(xì)胞，配制成一定濃度的懸浮液，放入培養(yǎng)瓶中在培養(yǎng)箱中培養(yǎng)的過(guò)程傳代培養(yǎng)：培養(yǎng)瓶中的細(xì)胞越來(lái)越多，用胰蛋白酶處理使細(xì)胞從瓶壁上脫離下來(lái)，配制成懸浮液，分瓶培養(yǎng)的過(guò)程動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)過(guò)程胚胎或幼齡動(dòng)物的組織器官細(xì)胞懸液10代細(xì)胞50代細(xì)胞剪碎胰蛋白酶洗滌、稀釋、分離原代培養(yǎng)用胰蛋白酶分散細(xì)胞，說(shuō)明細(xì)胞間的物質(zhì)主要是蛋白質(zhì)。動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)適宜的PH為7.2—7.4，此環(huán)境下胃蛋白酶（2.0）沒(méi)有活性，而胰蛋白酶(7.2-8.4)的活性較高。比老齡動(dòng)物的組織細(xì)胞增殖能力強(qiáng)，有絲分裂旺盛。分化程度越低，增殖能力越強(qiáng)，越容易培養(yǎng)。動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)不能最終培養(yǎng)成生物體細(xì)胞增殖緩慢，核型可能變化動(dòng)物組織細(xì)胞間隙中含有一定量的彈性纖維等蛋白質(zhì)，將細(xì)胞網(wǎng)絡(luò)起來(lái)形成具有一定彈性和韌性的組織和器官。貼壁生長(zhǎng)接觸抑制10代以內(nèi)，保持正常二倍體核型傳代培養(yǎng)細(xì)胞系討論：多細(xì)胞動(dòng)物和人體的細(xì)胞都生活在內(nèi)環(huán)境中，根據(jù)你所學(xué)的內(nèi)環(huán)境知識(shí)，思考并討論以下問(wèn)題：1.體外培養(yǎng)細(xì)胞時(shí)需要提供哪些物資？2.體外培養(yǎng)的細(xì)胞需要什么樣的環(huán)境件？充足的營(yíng)養(yǎng)(葡萄糖、氨基酸、無(wú)機(jī)鹽、維生素、促生長(zhǎng)因子和動(dòng)物血清等。)氣體無(wú)菌、無(wú)毒的環(huán)境適宜的溫度和PH動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)條件：1、無(wú)菌、無(wú)毒的環(huán)境（添加一定量的抗生素，定期更換培養(yǎng)液）2、營(yíng)養(yǎng)（葡萄糖、氨基酸、無(wú)機(jī)鹽、維生素、動(dòng)物血清等。）3、溫度和PH

36.5+（-）0.5度,7.2-7.44、氣體環(huán)境：O2和CO2（95%空氣和5%CO2）保證細(xì)胞順利的生長(zhǎng)增殖動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)液的主要成分：葡萄糖、氨基酸、無(wú)機(jī)鹽、維生素和動(dòng)物血清等。與植物培養(yǎng)基相比其特點(diǎn)是：（1）液體培養(yǎng)基（2）含有動(dòng)物血清動(dòng)物體細(xì)胞大都生活在液體的環(huán)境1、在動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)過(guò)程中，下列哪種現(xiàn)象是不可能的（）A．細(xì)胞一直在細(xì)胞懸液中分裂生長(zhǎng)B．有少部分細(xì)胞可能在培養(yǎng)條件下無(wú)限地傳代下去C．有部分細(xì)胞核型會(huì)發(fā)生變化D.個(gè)別細(xì)胞會(huì)發(fā)生基因突變2、下列過(guò)程與細(xì)胞培養(yǎng)無(wú)關(guān)的是------------------（）A.檢測(cè)有毒物質(zhì)B.生產(chǎn)單克隆抗體C.篩選抗癌藥物D.雜交育種

AD練習(xí)：強(qiáng)調(diào)一：細(xì)胞貼壁過(guò)程■細(xì)胞貼壁：在培養(yǎng)瓶懸液中分散的細(xì)胞很快就貼附在瓶壁上，稱為細(xì)胞貼壁。■培養(yǎng)瓶或培養(yǎng)皿壁要求：表面光滑、無(wú)毒、易于帖附。■當(dāng)貼壁細(xì)胞分裂生長(zhǎng)到表面相互接觸時(shí),細(xì)胞就會(huì)停止分裂增殖，這種現(xiàn)象稱為細(xì)胞的接觸抑制。強(qiáng)調(diào)二：接觸抑制

我們能否用植物組織培養(yǎng)的方法使動(dòng)物細(xì)胞發(fā)育成動(dòng)物個(gè)體？

根據(jù)動(dòng)物細(xì)胞核仍具有全能性的特點(diǎn),怎樣將動(dòng)物細(xì)胞的全能性表達(dá)；把兩種動(dòng)物的優(yōu)良性狀集合在一塊兒?思考：二動(dòng)物體細(xì)胞核移植技術(shù)

和克隆動(dòng)物動(dòng)物體細(xì)胞核移植技術(shù):將動(dòng)物的一個(gè)細(xì)胞的細(xì)胞核，移入一個(gè)已經(jīng)去掉細(xì)胞核的卵母細(xì)胞中，使其重組并發(fā)育成一個(gè)新的胚胎，這個(gè)新的胚胎最終發(fā)育成動(dòng)物個(gè)體。用核移植的方法得到的動(dòng)物稱為克隆動(dòng)物核移植胚胎細(xì)胞核移植體細(xì)胞核移植（難度高）

◆取供體細(xì)胞傳代培養(yǎng)10代以內(nèi)的細(xì)胞.為什么？◆用的是去核的減數(shù)第二次分裂中期細(xì)胞（MⅡ中期）為什么？◆激活方法：◆激活目的：◆促融方法：電刺激◆胚胎移植至代孕受體內(nèi)

妊娠、分娩2.）核移植流程供體：優(yōu)質(zhì)高產(chǎn)奶牛受體：普通奶牛（卵母細(xì)胞的采集與培養(yǎng)）

1.體積大，易操作。2.含有促使細(xì)胞核表達(dá)全能性的物質(zhì)和營(yíng)養(yǎng)條件。有人說(shuō)它三個(gè)母親，對(duì)嗎？過(guò)程供體細(xì)胞（供核）細(xì)胞培養(yǎng)體細(xì)胞卵母細(xì)胞（減２中期：供質(zhì)）去核無(wú)核卵母細(xì)胞注入電刺激重組細(xì)胞重組胚胎胚胎移植代孕母體新個(gè)體(與母體相同的個(gè)體)3.你認(rèn)為用上述體細(xì)胞核移植方法生產(chǎn)的克隆動(dòng)物，是對(duì)體細(xì)胞供體動(dòng)物進(jìn)行了100%的復(fù)制嗎？為什么？絕大部分DNA來(lái)自于供體細(xì)胞核，但其核外還有少量的DNA，即線粒體DNA是來(lái)自于受體卵母細(xì)胞。此外，即便動(dòng)物的遺傳基礎(chǔ)完全相同，但動(dòng)物的一些行為、習(xí)性的形成與所處環(huán)境有很大關(guān)系，核供體動(dòng)物生活的環(huán)境與克隆動(dòng)物所生活的環(huán)境不會(huì)完全相同，其形成的行為、習(xí)性也不可能和核供體動(dòng)物完全相同，從這一角度看，克隆動(dòng)物不會(huì)是核供體動(dòng)物100%的復(fù)制。應(yīng)用前景1、加快家畜遺傳改良進(jìn)程2、保護(hù)頻危物種3、器官移植供體4、利用生物反應(yīng)器生產(chǎn)生物蛋白前景應(yīng)用前景1、加快家畜遺傳改良進(jìn)程2、保護(hù)頻危物種3、器官移植供體4、利用生物反應(yīng)器生產(chǎn)生物蛋白存在問(wèn)題成功率低存在健康問(wèn)題克隆動(dòng)物食品的安全問(wèn)題許多克隆動(dòng)物表現(xiàn)出遺傳和生理缺陷，如體型過(guò)大，異常肥胖，發(fā)育困難，臟器缺陷，免疫失調(diào)等。小結(jié)：動(dòng)物體細(xì)胞核移植技術(shù)

和克隆動(dòng)物過(guò)程應(yīng)用前景存在問(wèn)題

動(dòng)物細(xì)胞工程動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)培養(yǎng)過(guò)程培養(yǎng)條件應(yīng)用動(dòng)物細(xì)胞融合與1、定義：指用自然或人工方法使兩個(gè)或多個(gè)不同的動(dòng)物細(xì)胞融合成一個(gè)細(xì)胞的過(guò)程。一、動(dòng)物細(xì)胞融合

2.結(jié)果：形成了單核的雜交細(xì)胞3.原理：細(xì)胞膜的流性4、誘導(dǎo)方式：物理法：離心、振動(dòng)、電激化學(xué)法：聚乙二醇（PEG)生物法：滅活的病毒

細(xì)胞融合是正常的生命活動(dòng)兩個(gè)細(xì)胞正在融合

受精作用

把兩個(gè)不同的動(dòng)物細(xì)胞放在一起，用滅活的病毒處理細(xì)胞，它們先發(fā)生質(zhì)融合，再出現(xiàn)核融合，進(jìn)而形成雜交細(xì)胞。

融合后的雜交細(xì)胞經(jīng)過(guò)有絲分裂后仍能形成兩個(gè)完整的雜交細(xì)胞動(dòng)物細(xì)胞融合的過(guò)程

思考討論：為什么細(xì)胞融合過(guò)程中使用的病毒需要滅活？不滅活行嗎？

因?yàn)闇缁畹牟《灸苁辜?xì)胞膜上的蛋白質(zhì)分子和脂質(zhì)分子重新排布，細(xì)胞膜打開(kāi)，細(xì)胞發(fā)生融合，不滅活的話會(huì)感染細(xì)胞，而不能誘導(dǎo)細(xì)胞融合。3、動(dòng)物細(xì)胞融合技術(shù)的應(yīng)用細(xì)胞融合技術(shù)突破了有性雜交的局限，使遠(yuǎn)緣雜交成為可能。利用細(xì)胞融合技術(shù)，制備單克隆抗體。人們獲得抗體的傳統(tǒng)方運(yùn)用法是?將抗原注入動(dòng)物體,然后從動(dòng)物血清中提取抗體這種方法的缺點(diǎn)是什么?產(chǎn)量有限，純度低，特異性差，反應(yīng)不夠靈敏運(yùn)用已學(xué)知識(shí)，設(shè)想怎樣獲得化學(xué)性質(zhì)單一、特異性強(qiáng)的抗體？

每一個(gè)B淋巴細(xì)胞只分泌一種化學(xué)性質(zhì)單一，特異性強(qiáng)的抗體如果利用單個(gè)B淋巴細(xì)胞進(jìn)行無(wú)性繁殖（克隆），形成細(xì)胞群，這樣的細(xì)胞群就有可能產(chǎn)生出化學(xué)性質(zhì)單一、特異性強(qiáng)的抗體——單克隆抗體。能否用單個(gè)B淋巴細(xì)胞通過(guò)克隆形成的細(xì)胞群來(lái)產(chǎn)生單一類型的抗體呢？B淋巴細(xì)胞在體外不能無(wú)限增殖。二：動(dòng)物細(xì)胞融合的成功應(yīng)用

——單克隆抗體的制備思考怎樣解決這一問(wèn)題呢？什么樣的細(xì)胞能夠在體外無(wú)限增殖呢？單克隆抗體的制備---極富創(chuàng)造性的方案如果把一種B淋巴細(xì)胞與能在體外大量增殖的骨髓瘤細(xì)胞進(jìn)行融合，所得到的融合細(xì)胞既能大量增殖，又能產(chǎn)生足夠數(shù)量的特定抗體

米爾斯坦(阿根廷)和科勒(德國(guó))因此在1984年獲諾貝爾獎(jiǎng)。B淋巴細(xì)胞注射特定抗原蛋白骨髓瘤細(xì)胞培養(yǎng)骨髓瘤細(xì)胞融合培養(yǎng)液中細(xì)胞有幾種類型？（只考慮兩兩融合）融合細(xì)胞幾種類型？5種B淋巴細(xì)胞、骨髓瘤細(xì)胞骨髓瘤細(xì)胞---骨髓瘤細(xì)胞B淋巴細(xì)胞---B淋巴細(xì)胞B淋巴細(xì)胞---骨髓瘤細(xì)胞3種骨髓瘤細(xì)胞---骨髓瘤細(xì)胞B淋巴細(xì)胞---B淋巴細(xì)胞B淋巴細(xì)胞---骨髓瘤細(xì)胞多種雜交細(xì)胞在具有篩選作用的培養(yǎng)基上培養(yǎng)專一抗體檢驗(yàn)陽(yáng)性克隆上述雜交細(xì)胞分開(kāi)不同雜交細(xì)胞，克隆專一抗體，檢驗(yàn)陽(yáng)性細(xì)胞單克隆抗體注射到小鼠體內(nèi)體外培養(yǎng)1、單克隆抗體的制備過(guò)程第1次篩選目的：得到雜交瘤細(xì)胞（多種）。第2次篩選目的：在雜交瘤細(xì)胞中篩選出能產(chǎn)生所需抗體的雜交瘤細(xì)胞。該細(xì)胞繼承雙親細(xì)胞的遺傳特性，既能產(chǎn)生專一抗體又能無(wú)限增殖。雜交瘤細(xì)胞有何特點(diǎn)？特異性強(qiáng)，靈敏度高雜交細(xì)胞滅活的病毒等手段小鼠骨髓瘤細(xì)胞B淋巴細(xì)胞經(jīng)免疫的小鼠提取雜交瘤細(xì)胞第一次篩選用特定的選擇性培養(yǎng)基第二次篩選能產(chǎn)生特定抗體、培養(yǎng)條件下能無(wú)限增殖的雜交瘤細(xì)胞體外培養(yǎng)注射到小鼠腹腔提取單克隆抗體1.單克隆抗體的制備過(guò)程：特點(diǎn)：既能產(chǎn)生專一抗體又能大量繁殖單克隆抗體制備過(guò)程B淋巴細(xì)胞骨髓瘤細(xì)胞誘導(dǎo)融合B-B細(xì)胞B-瘤細(xì)胞瘤-瘤細(xì)胞選擇培養(yǎng)雜交瘤細(xì)胞（B-瘤細(xì)胞）克隆化培養(yǎng)抗體檢測(cè)產(chǎn)生所需抗體的雜交瘤細(xì)胞體外培養(yǎng)小鼠腹腔內(nèi)增殖單克隆抗體課堂小結(jié)單克隆抗體制備過(guò)程中應(yīng)用哪些細(xì)胞工程技術(shù)手段？動(dòng)物細(xì)胞融合技術(shù)動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)B淋巴細(xì)胞骨髓瘤細(xì)胞特點(diǎn)：特異性強(qiáng)靈敏度高可大量制備1、作為診斷試劑：在臨床生化診斷、病理組織定位、體內(nèi)腫瘤的定位等,與常規(guī)抗體相比,具有準(zhǔn)確、高效、簡(jiǎn)易、快速特點(diǎn).2、用于治療疾病和運(yùn)載藥物：主要用于癌癥治療。生物導(dǎo)彈：抗癌細(xì)胞的單克隆抗體+放射性同位素+化學(xué)藥物或細(xì)胞毒素。（單克隆抗體：導(dǎo)向。準(zhǔn)確找到癌細(xì)胞位置，原位殺死癌細(xì)胞。）2、單克隆抗體的優(yōu)點(diǎn)：特異性強(qiáng)，靈敏度高，可大量制備。3、單克隆抗體的應(yīng)用項(xiàng)目動(dòng)物細(xì)胞融合植物體細(xì)胞雜交原理細(xì)胞膜的流動(dòng)性細(xì)胞膜的流動(dòng)性和植物細(xì)胞的全能性融合前提分散成單個(gè)細(xì)胞去除細(xì)胞壁誘導(dǎo)方法聚乙二醇、離心、振動(dòng)、電激、滅活病毒聚乙二醇、離心、振動(dòng)、電激、結(jié)果獲得雜種細(xì)胞或細(xì)胞產(chǎn)物獲得雜種植株用途制備單克隆抗體培育作物新品種意義使遠(yuǎn)緣雜交成為可能克服遠(yuǎn)緣雜交障礙B體外培養(yǎng)骨髓瘤細(xì)胞雜交瘤細(xì)胞足夠數(shù)量的細(xì)胞群注射到小鼠腹腔AC

下圖為某同學(xué)根據(jù)雜交瘤技術(shù)的方法，設(shè)計(jì)的生產(chǎn)破傷風(fēng)桿菌單克隆抗體的實(shí)驗(yàn)方案2、