操作培訓(xùn) 液相色譜基礎(chǔ)知識

操作培訓(xùn)液相色譜基礎(chǔ)知識第1頁/共95頁LC-20AProminence第2頁/共95頁第一部分色譜基礎(chǔ)知識第3頁/共95頁色譜起源石油醚碳酸鈣顆粒色素混合物色譜分離組分第4頁/共95頁色譜法：利用組分在兩相間分配系數(shù)不同而進(jìn)行分離的技術(shù)流動相：攜帶樣品流過整個系統(tǒng)的流體固定相：靜止不動的一相，色譜柱色譜定義色譜是一種分離技術(shù).色譜的主要目的是對混合物中的目標(biāo)物分離和定量第5頁/共95頁色譜分類高效液相色譜

HighPerformanceLiquidChromatography(HPLC)氣相色譜

GasChromatography(GC)薄層色譜

Thin-LayerChromatography(TLC)毛細(xì)管電泳

CapillaryElectrophoresis(CE)第6頁/共95頁色譜優(yōu)點(diǎn)同時分析分離性能好靈敏度高

(ppm-ppb)進(jìn)樣量小

(1-100uL)第7頁/共95頁

液相色譜：以液體作為流動相的色譜分離方法適用于高沸點(diǎn)、大分子、強(qiáng)極性和熱穩(wěn)定性差的化合物的分析流動相具有運(yùn)載樣品分子和選擇性分離的雙重作用HPLCvsGC

氣相色譜：以氣體作為流動相的色譜分離方法適用于沸點(diǎn)較低、熱穩(wěn)定性好的中小分子化合物的分析流動相只起運(yùn)載樣品分子的能力

第8頁/共95頁HPLC分類分配色譜正相模式(NP-LC)反相模式(RP-LC)反相離子對色譜

(IPC)離子交換色譜(IEC)尺寸排阻色譜

(GPC/GFC)第9頁/共95頁一、分配色譜反相模式(RP)C18(ODS)C8(octyl)C4(butyl)苯基TMS氰基-Si-C18H37Si非極性第10頁/共95頁相互作用力是什么?OHOHC18(ODS)強(qiáng)弱疏水性Si第11頁/共95頁

疏水性如果樣品有CH3CH2CH2---:碳鏈

:芳香基如果樣品有-COOH :羧基-NH2 :氨基-OH :羥基作用力強(qiáng)作用力弱第12頁/共95頁反相模式下流動相的選擇優(yōu)化水相（緩沖液）和有機(jī)相的比例非常重要甲醇，乙腈和

THF

是常用的有機(jī)溶劑在有緩沖液的情況下,緩沖液的濃度和pH值非常重要第13頁/共95頁增加流動相極性20%

H2O

30%

H2O

40%

H2O1:

對羥基苯甲酸甲酯2:

對羥基苯甲酸乙酯3:

對羥基苯甲酸丙酯4:

對羥基苯甲酸丁酯有機(jī)相:MeOH第14頁/共95頁固定相極性變化對分離的影響C18(ODS)強(qiáng)樣品SiC8樣品一般Si樣品C4弱Si第15頁/共95頁分析條件柱

:Shim-packCLC-ODS流動相

:MeOH:H2O=7:3流速

:1.0mL/min溫度

:40C進(jìn)樣體積

:10uL檢測器

:UV-254nm峰1.苯甲酸甲脂2.苯甲酸乙脂3.n-苯甲酸丙酯4.n-苯甲酸丁酯ODSC8

TMS固定相極性變化對分離的影響第16頁/共95頁離子對試劑

陰離子化合物氫氧化四丁基銨溴化四丁基銨陽離子化合物丁烷基磺酸鈉

(C4)戊烷基磺酸鈉(C5)己烷基磺酸鈉

(C6)庚烷基磺酸鈉

(C7)辛烷基磺酸鈉

(C8)癸烷基磺酸鈉

(C10)十二烷基磺酸鈉

(SDS)離子對色譜第17頁/共95頁離子對色譜影響因素離子對試劑的類型離子對試劑的濃度流動相的

pH第18頁/共95頁正相色譜硅膠柱

:

常用氰基柱

:常用氨基柱

:分析糖二醇基柱

:分析蛋白質(zhì)硅膠SiSi-Si-CH2CH2CH2CN-Si-CH2CH2CH2NH2-Si-CH2CH2CH2OCH(OH)-CH2(OH)化學(xué)鍵合相第19頁/共95頁相互作用力是什么?OHHOSiOHSiOH強(qiáng)弱非常弱氫鍵力第20頁/共95頁

氫鍵力如果樣品有-COOH

:羧基-NH2 :氨基-OH :羥基氫鍵力強(qiáng)。如果樣品沒有任何官能團(tuán)，象碳水化合物如果樣品有大的基團(tuán),由于空間障礙氫鍵力弱。第21頁/共95頁正相模式下流動相的選擇主要試劑烷烴

(戊烷,己烷,庚烷,辛烷)芳香烴

(苯,甲苯,二甲苯)二氯甲烷氯仿四氯化碳輔助試劑甲基-t-丁基醚

(MTBE),乙醚,四氫呋喃

(THF),二氧雜環(huán)乙烷,嘧啶,乙酸乙酯,乙腈,丙酮,異丙醇,乙醇,甲醇為了調(diào)整保留時間，可以選擇主要試劑然后再加入輔助試劑。第22頁/共95頁增加流動相極性0%MeOH

2%MeOH

5%/MeOH

1:

鄰苯二甲酸二辛酯

2:

鄰苯二甲酸二丁酯

3:

鄰苯二甲酸二乙酯

4:

鄰苯二甲酸二甲酯

主要試劑

:己烷第23頁/共95頁反相色譜

流動相極性大于固定相極性能溶于水/有機(jī)混合物的中性或非離子化合物正相色譜

流動相極性小于固定相極性不溶于水/有機(jī)混合液的親脂樣品、異構(gòu)體混合物和制備HPLC反相色譜與正相色譜的對比第24頁/共95頁

反相保留時間重復(fù)性好固定相耐用正相對立體異構(gòu)體有很好的分離(VitaminE等)保留時間重復(fù)性稍差

反相色譜與正相色譜的對比第25頁/共95頁二、離子交換色譜N+RRR樣品SO3-樣品+++++++++++++離子吸引力第26頁/共95頁離子交換色譜應(yīng)用生物領(lǐng)域

(蛋白質(zhì),農(nóng)藥,氨基酸分析)離子分析陽離子交換劑強(qiáng)陽離子交換劑

(SCX) (R-SO3-)弱陽離子交換劑

(WCX) (R-COO-)陰離子交換劑強(qiáng)陰離子交換劑

(SAX) (R4N+)弱陰離子交換劑

(WAX)

(DEAE)第27頁/共95頁體積排除色譜的分離機(jī)理小分子可以擴(kuò)散到凝膠空隙，由其中通過，出峰最慢；中等分子只能通過部分凝膠空隙，中速通過；大分子被排斥在外，出峰最快；溶劑分子小，故在最后出峰。

分子篩效應(yīng)

三、尺寸排阻色譜法（SEC）第28頁/共95頁三、尺寸排阻色譜法（SEC）流出順序第29頁/共95頁第二部分柱子基本性能參數(shù)第30頁/共95頁硅膠純度填料硅膠的純度與殘留金屬離子濃度色譜柱尺寸填料床的長度和內(nèi)徑顆粒形狀球型或不規(guī)則型粒徑平均顆粒直徑,通常3-10μm表面積顆粒外表面和內(nèi)部孔表面的總和,以m2/g表示孔徑顆粒的孔或腔的平均尺寸,范圍80-300?碳百分率與基體物質(zhì)相連的鍵合相的量封尾用短鏈將裸露的硅羥基鍵合后封閉起來表征色譜柱的參數(shù)第31頁/共95頁硅膠特性[無定型]

[球形]

制備用

分析用第32頁/共95頁硅膠性質(zhì)粒徑

5um5um的粒子是最常用的.然而,這是指平均粒徑為

5um，也存在

3um和10um的粒子.對于好的柱子，窄范圍的粒徑分布是非常重要的.粒徑第33頁/共95頁表征色譜柱性能的參數(shù)容量因子理論塔板數(shù)理論塔板高度分離度拖尾因子第34頁/共95頁容量因子,k’t1=

組分峰的保留時間tm=死時間(非保留時間)tmt1k’=tm

t1-tm第35頁/共95頁理論塔板數(shù),N中國/日本藥典:N=5.54x(Rt/W1/2)2美國藥典:

N=16x(Rt/W)2WW1/2H1/2HRtArea理論塔板高度,H

H=L/NL：色譜柱長N：理論塔板數(shù)第36頁/共95頁分離度,Resolution相鄰兩峰完全分離其分離度

Rs≥1.5.第37頁/共95頁完全分離時的分離度

Rs=1.0Rs=1.5峰形不是三角形

，而是高斯分布第38頁/共95頁拖尾因子，TT=W0.05/2d0.05

W0.05：5％峰高處峰寬

d0.05：5％峰高處的前半峰寬d0.05W0.05H0.05H第39頁/共95頁第三部分HPLC硬件基礎(chǔ)知識日常分析注意點(diǎn)第40頁/共95頁液相色譜簡易流程圖輸液泵進(jìn)樣器色譜柱柱溫箱檢測器溶劑數(shù)據(jù)處理第41頁/共95頁采用“HPLC”級溶劑避免使用會引起柱效損失或保留特性變化的溶劑對試樣有適宜的溶解度溶劑粘度要小與檢測器相匹配流動相的選擇第42頁/共95頁水的等級水的等級純化水蒸餾水去離子水波長(nm)純化水去離子水因?yàn)椴患兾锏拇嬖?，去離子的吸光率較高純化水中去除了無機(jī)和有機(jī)的污染物吸光率第43頁/共95頁HPLC用水可以通過以下幾個方法得到：

專門的純水機(jī)或超純水機(jī):理想的HPLC用水應(yīng)為18.2MΩ

的超純水，并通過0.22μm的濾膜，除去熱源、有機(jī)物、無機(jī)離子等。去離子水重蒸；二次或三次重蒸水；

不管采用何種途徑，配制流動相應(yīng)用新鮮水。水的等級第44頁/共95頁

未注入樣品時空白梯度的色譜圖水中不純物的出峰水中的不純物保留在柱中，隨之被乙腈洗脫.水的等級第45頁/共95頁有機(jī)溶劑的等級HPLC級優(yōu)級純分析純都經(jīng)過蒸餾和0.45u的過濾(除纖維毛,未溶解的機(jī)械顆粒)優(yōu)級純的純度比分析純大,但里面含有防腐劑和抗氧化劑HPLC級經(jīng)過0.2u的過濾,且除去有紫外吸收的雜質(zhì)微量分析、梯度洗脫有機(jī)溶劑的等級第46頁/共95頁甲醇乙腈正己烷分析純級和HPLC級溶劑的吸光度比較圖有機(jī)溶劑的等級第47頁/共95頁選擇緩沖液的步驟

1.確定最佳分離狀態(tài)時的流動相pH2.選擇具有與流動相pH相近的pKa的緩沖液（即使?jié)舛认∫簿哂休^強(qiáng)能力的緩沖液）3.確認(rèn)檢測波長下緩沖液是否有大的吸收（在波長210nm附近進(jìn)行檢測時，不能用醋酸和檸檬酸的緩沖液）緩沖鹽第48頁/共95頁pK1pK2pK3醋酸4.87檸檬酸3.134.766.40磷酸2.167.2112.32緩沖鹽常用代表性的弱酸的pKa值第49頁/共95頁緩沖液的使用

使用前必須過濾使用后一定要進(jìn)行清洗，以免造成腐蝕、磨損、阻塞:

用含5%甲醇的水溶液沖洗30min（1ml/min），再用甲醇沖洗30min

用純水沖洗泵頭清洗管路易受到細(xì)菌和霉菌的影響不能直接用有機(jī)溶劑沖洗緩沖鹽溶液緩沖液第50頁/共95頁流動相的更換不互溶的流動相不能直接更換緩沖鹽不能直接用有機(jī)溶劑更換水正己烷異丙醇緩沖鹽有機(jī)溶劑水第51頁/共95頁-乙腈黏度低

在相同流速時有較低的柱壓-當(dāng)和水混合時黏度有變化柱壓也相應(yīng)有變化

乙腈和甲醇

…黏度溶劑的黏度Water/methanolWater/methanolWater/acetonitrileWater/acetonitrilePressure(MPa)Water(100%)Organicsolvent(100%)Water/Organicsolvent1:1第52頁/共95頁過濾：0.45um或更小孔徑濾膜

目的：除去溶劑中的微小顆粒，避免堵塞色譜柱，尤其是使用無機(jī)鹽配制的緩沖液時。濾膜類型：

聚四氟乙烯濾膜：適用于所有溶劑，酸和鹽。

醋酸纖維濾膜：不適用于有機(jī)溶劑，特別適用于水基溶劑。尼龍66濾膜：適用于絕大多數(shù)有機(jī)溶劑和水溶液，可以用于強(qiáng)酸，不適用于二甲基甲酰胺。

再生纖維素濾膜：蛋白吸收低，同樣適用于水溶性樣品和有機(jī)溶劑溶劑前處理-過濾第53頁/共95頁

脫氣：除去流動相中溶解或因混合而產(chǎn)生的氣泡

氣泡對測定的影響：

1）泵中氣泡使液流波動，改變保留時間和峰面積

2）柱中氣泡使流動相繞流，峰變形

3）檢測器中的氣泡產(chǎn)生基線波動

溶劑前處理-脫氣第54頁/共95頁0

50

100

乙醇體積(%)100200氧的飽和容量(uL)氧氣在1ml水-乙醇混合溶劑中的溶解度溶劑前處理-脫氣第55頁/共95頁常用脫氣方法超聲脫氣減壓脫氣在線脫氣第56頁/共95頁目的單元流速范圍 特性和應(yīng)用

LC-20AD0.0001-10ml/min無脈動，適于半微量LC

和LC-MS分析

LC-20AT0.001-10ml/min非凡的耐用性，適于常量分析

LC-20AB 0.0001-10ml/min無脈動，適于半微量LC

和LC-MS分析分析

LC-10ATvp0.001-9.999ml/min

LC-10ADvp

0.001-9.999ml/min島津液相輸液泵第57頁/共95頁LC-20AT串聯(lián)式柱塞往復(fù)泵LC-20AD

并聯(lián)式微體積柱塞往復(fù)泵柱塞泵的基本結(jié)構(gòu)LC-10ATvp

LC-10ADvp

單向閥單向閥單向閥LC-2010第58頁/共95頁LC-20ATLC-20AT第59頁/共95頁LC-20AD第60頁/共95頁LC-20AB第61頁/共95頁泵工作示意圖

凸輪柱塞桿柱塞密封圈單向閥

泵頭流動相入口流動相出口第62頁/共95頁單向閥結(jié)構(gòu)拋光面

球座寶石球單向閥工作原理吸液沖程排液沖程出口單向閥進(jìn)口單向閥泵頭單向閥工作原理第63頁/共95頁輸液泵進(jìn)樣器色譜柱柱溫箱檢測器單一或混合溶劑等度洗脫第64頁/共95頁

A泵進(jìn)樣器色譜柱柱溫箱檢測器B泵AB時間B

濃度梯度洗脫第65頁/共95頁梯度洗脫裝置：高壓梯度：用兩臺高壓輸液泵將兩種溶劑輸入低壓梯度：在常壓下將兩種溶劑（或多元溶劑）混合，然后用高壓輸液泵將流動相輸入到色譜柱中。HPGE梯度混合器低壓梯度比例閥LPGE高壓常壓高壓/低壓梯度系統(tǒng)常壓高壓第66頁/共95頁分析時間長分離度差

MeOH/H2O=6/4MeOH/H2O=8/2(column:ODS)使用梯度洗脫的原因當(dāng)?shù)榷认疵摃r：第67頁/共95頁95%30%甲醇濃度在最短時間內(nèi)獲得最佳的分離使用梯度洗脫的原因當(dāng)采用梯度洗脫時：第68頁/共95頁梯度洗脫：優(yōu)點(diǎn)：可提高分離度、縮短分離時間、降低最小檢測量和提高分離精度注意事項(xiàng)：溶劑的純度要高，否則梯度洗脫的重現(xiàn)性差梯度混合的溶劑互溶性要好梯度洗脫應(yīng)使用對流動相組成變化不敏感的選擇性檢測器（如紫外吸收檢測器或熒光檢測器），而不能使用對流動相組成變化敏感的通用型檢測器（如示差折光檢測器）查看空白實(shí)驗(yàn)的數(shù)據(jù)遵守分析周期（最初的分析數(shù)據(jù)不采用）梯度洗脫要點(diǎn)第69頁/共95頁1.使用流動相溶解樣品

--減少溶劑峰，尤其是組分峰靠近溶劑峰時尤為重要

--保證樣品在流動相中的溶解度，避免樣品在系統(tǒng)中，尤其在柱中產(chǎn)生沉淀

2.進(jìn)樣前最好使用0.45um的濾膜進(jìn)行過濾如果樣品很臟，要使用0.22um的濾膜進(jìn)行過濾3.對于含有復(fù)雜基質(zhì)的樣品，最好前處理后再進(jìn)樣。樣品前處理第70頁/共95頁進(jìn)樣器自動進(jìn)樣器手動進(jìn)樣器原理：（六通閥）注入方式：

1）全量注入

2）部分注入第71頁/共95頁第72頁/共95頁手動進(jìn)樣器的原理圖load位置inject位置

柱

泵

泵

柱

定量環(huán)１２３５４６１２３５４６第73頁/共95頁進(jìn)樣量和檢測器響應(yīng)的關(guān)系示意圖進(jìn)樣體積

檢測器響應(yīng)值定量環(huán)體積的一半3倍定量環(huán)體積全量注入部分注入手動進(jìn)樣器的進(jìn)樣體積第74頁/共95頁部分注入：一般要求進(jìn)樣量最多為定量環(huán)體積的一半，如20μl的定量環(huán)最多進(jìn)樣10μl的樣品，并且要求每次進(jìn)樣體積準(zhǔn)確、相同全量注入：進(jìn)樣量最少為定量環(huán)體積的3至5倍，即20μl的定量環(huán)最少進(jìn)樣60至100μl的樣品，這樣才能完全置換樣品定量環(huán)內(nèi)殘留的溶液，達(dá)到所要求的精密度及重現(xiàn)性。部分注入和全量注入第75頁/共95頁交叉污染的原因

紅色表示殘留樣品第76頁/共95頁手動進(jìn)樣方法一般的方法

1.在進(jìn)樣狀態(tài)下清洗針口

2.在裝填狀態(tài)下插入微量注射器

3.注入樣品

4.切到進(jìn)樣狀態(tài)第77頁/共95頁便捷的方法（不需清洗）

1.進(jìn)樣狀態(tài)下插入微量注射器

2.切換到裝填狀態(tài)

3.注入樣品

4.切換回進(jìn)樣狀態(tài)手動進(jìn)樣方法第78頁/共95頁柱溫箱分析結(jié)果重現(xiàn)性好提高柱效降低柱壓保證檢測穩(wěn)定性

第79頁/共95頁柱壓低于20MPa柱溫在40℃左右，最高使用溫度為50℃緩沖液pH使用范圍為2～7.5流動相有機(jī)溶劑比例過低,柱效下降快ODS柱的使用注意點(diǎn)硅膠在pH為3～4時穩(wěn)定性最好堿濃度越低，流動相含水量越低，硅膠越穩(wěn)定。第80頁/共95頁色譜柱的類型及適用范圍硅膠基底聚合物基底pH范圍2-7.5寬范圍有機(jī)溶劑所有有限制壓力<20MPa低壓溫度寬范圍<50℃第81頁/共95頁分析柱的維護(hù)在使用新柱之前，最好用強(qiáng)溶劑在低流量下(0.2-0.3ml/min)沖洗30min，長時間未用的分析柱也要同樣處理定期使用強(qiáng)溶劑沖洗柱子3、使用緩沖鹽時，要先用含5%甲醇的水溶液沖洗，再用有機(jī)溶劑沖洗4、凈化樣品5、分離條件6、不使用時，要蓋上蓋子，避免固定相干涸第82頁/共95頁常用檢測器紫外檢測器（包括二極管陣列檢測器）熒光檢測器示差折光檢測器電導(dǎo)檢測器蒸發(fā)光散射檢測器質(zhì)譜檢測器第83頁/共95頁原理：基于被分析組分對特定波長紫外光的選擇性吸收定量基礎(chǔ)：朗伯-比耳定律，A＝kCL優(yōu)點(diǎn)：1）靈敏度高

2）對溫度和流速不敏感

3）可用于梯度洗脫缺點(diǎn)：僅適用于測定有紫外吸收的物質(zhì)紫外檢測器第84頁/共