生物分離工程電泳1課件

Electrophoresis1電泳在生化分離中的應(yīng)用分離和純化手段（實(shí)驗(yàn)室）

蛋白、酶、核酸純化基礎(chǔ)理論研究

醋酸纖維薄膜電泳分析血清蛋白

瓊脂對(duì)流免疫電泳分析病人血清，早期診斷肝癌

高壓電泳分離肽段，研究蛋白質(zhì)一級(jí)結(jié)構(gòu)；

凝膠電泳技術(shù)分離分析酶，蛋白質(zhì)，核酸2電泳原理指帶電粒子在電場(chǎng)中朝與自身帶相反電荷的電極移動(dòng)的現(xiàn)象CATHODEANODE+--+3用支持體的電泳技術(shù)1.濾紙電泳2.醋酸纖維薄膜電泳3.薄層電泳4.非凝膠性支持體區(qū)帶電泳(淀粉，纖維素粉，玻璃粉，硅膠等)5.凝膠支持體區(qū)帶電泳(聚丙烯酰胺凝膠，瓊脂糖凝膠)不用支持體的電泳技術(shù)Tiselius或微量電泳

操作形式：1.區(qū)帶電泳2.等速電泳3.等電點(diǎn)電泳電泳形式分類5電泳速度v=EZe/(6пrη)+--Z，rEf’fE:電場(chǎng)強(qiáng)度,V/cmZ:

溶質(zhì)的荷電荷數(shù)η：溶液粘度e:1.610-19C1.粒子在電場(chǎng)中所受的力:

f=EZe2.粒子在液體中泳動(dòng)所受的阻力：根據(jù)Stoke定律f′=6пrηv平衡時(shí)：f=f’恒定泳動(dòng)速度:溶質(zhì)的遷移率：u0=v/E=Ze/(6пrη)6區(qū)帶電泳7影響泳動(dòng)速度的因素-1

帶電顆粒的性質(zhì)

所帶凈電荷的數(shù)量

顆粒大小

形狀

v=EZe/(6пrη)恒定泳動(dòng)速度:9影響泳動(dòng)速度的因素-2

粒子的pI和溶液pH值

protein白蛋白α2球蛋白β球蛋白γ球蛋白pI4.05.065.17.1白蛋白

>

α2球蛋白

>β球蛋白

>γ球蛋白血清中的四種蛋白pH8.6的電泳緩沖液中電泳，泳動(dòng)速度：10影響泳動(dòng)速度的因素-3

外加電流電壓

U，E，v(1)常壓電泳:

U=100~500V，E=2~10V/cm

t=幾小時(shí)至數(shù)天

適合于分離蛋白質(zhì)等大分子物質(zhì)(2)高壓電泳：U=500~1000V，E=50~200V/cm

t=幾分鐘

分離氨基酸，肽，核苷酸，糖類等小分子物質(zhì)

由于電壓升高，電流也隨之增大，故需冷卻裝置

v=EZe/(6пrη)恒定泳動(dòng)速度:11影響泳動(dòng)速度的因素-5

電滲作用

在電場(chǎng)中液體對(duì)固體支持物的相對(duì)移動(dòng)濾紙電泳CellulosepH=8.6電泳血清蛋白+-γ球蛋白-濾紙的纖維間具有大量孔隙帶有負(fù)電荷與帶電顆粒一樣可以吸引正離子介質(zhì)向陰極移動(dòng)γ球蛋白:顆粒大，凈電荷少13電滲作用—石英毛細(xì)管電泳

CapillaryElectrophoresis

pH>3內(nèi)表面帶負(fù)電毛細(xì)管管壁分布有

大量的硅烷醇（Si-OH）陽(yáng)離子被吸附在管壁而形成了雙電層

V=V(電滲流)＋V(電泳)V(正)>V(中)>V(負(fù))14影響泳動(dòng)速度的因素-6

對(duì)支持物的選擇

支持物均勻，吸附力小，否則電場(chǎng)強(qiáng)度不均勻，影響區(qū)帶的分離

瓊脂糖和淀粉在電場(chǎng)作用下易電離帶負(fù)電荷，產(chǎn)生電滲流，應(yīng)用范圍受限制。聚丙烯酰胺凝膠常用。15凝膠電泳17

凝膠電泳法鑄膠電泳染色脫色凝膠電泳樣本處理Trypsin濃縮層膠體分離層膠體取出膠體染色脫色18Pierce商品供應(yīng)預(yù)鑄膠片梯度或固定濃度膠體10,12.15樣本槽中性pH緩沖液拋棄式塑料外殼

膠體1mm厚度19濃縮層內(nèi)的等速電泳21濃縮層膠體中的三個(gè)主要作用角色Glycine:Negativecharged

Nonetcharge

Chlorideion:Proteins:小分子大分子22SDSGelElecrtophoresis23SDS測(cè)定蛋白質(zhì)相對(duì)分子量SDS：陰離子去污劑、水溶液中以單體和分子團(tuán)存在。能破壞蛋白質(zhì)分子之間及與其他分子間的非共價(jià)鍵，形成帶負(fù)電荷的蛋白質(zhì)-SDS復(fù)合物，使蛋白質(zhì)喪失了原有電荷狀態(tài)，形成僅保持原有分子大小為特征的負(fù)離子團(tuán)。25SDS測(cè)定蛋白質(zhì)相對(duì)分子量操作：分離膠12%濃縮膠5%加樣電泳染色、脫色凝膠干燥確定分子量26三種不同性質(zhì)蛋白質(zhì)的電泳比較MolecularWeightpINativePAGESDS-PAGEMobilityProteinQuaternaryStructureXYZTetramer(40,000)x4Monomer88,000Monomer60,0005.85.29.3FastSlowMediumSlowUpwardFastXYZ--+29單元體分子量的測(cè)定：SDS0.51.0kD33022067603618.5kD946743