生物化學(xué)教學(xué)課件：第20章 常用分子生物學(xué)技術(shù)的原理及應(yīng)用

常用分子生物學(xué)技術(shù)的原理及應(yīng)用ThePopularTechnologyinMolecularBiology:PrincipleandApplication第二十章第一節(jié)

分子雜交與印跡技術(shù)

MolecularHybridization&BlottingTechnology分子雜交技術(shù)的原理主要涉及分子雜交特性（見第二章）印跡技術(shù)探針技術(shù)核酸分子雜交(nucleicacidhybridization)利用DNA變性與復(fù)性這一基本性質(zhì)來進(jìn)行DNA或RNA定性或定量分析的一種技術(shù)。一、分子雜交與印跡技術(shù)的原理第二節(jié)聚合酶鏈反應(yīng)

PolymeraseChainReaction（PCR）一種可以將目的微量的DNA片斷擴(kuò)增100萬倍以上的技術(shù)

PCR是一種模擬自然DNA復(fù)制過程的核酸體外擴(kuò)增技術(shù)。

根據(jù)DNA變性、復(fù)性的特點(diǎn)設(shè)計。1993年諾貝爾化學(xué)獎獲得者KaryMullis

1985年由穆里斯首創(chuàng)。

可將微量的目的DNA片斷的數(shù)量擴(kuò)增100萬倍以上。PCR擴(kuò)增目的基因最初采用E-coliDNA聚合酶進(jìn)行PCR，由于該酶不耐熱，使這一過程耗時，費(fèi)力，且易出錯耐熱DNA聚合酶的應(yīng)用使得PCR能高效率的進(jìn)行，隨后PE-Cetus公司推出了第一臺PCR自動化熱循環(huán)儀各種PCR儀PCR體系基本組成成分含Mg2+的緩沖液dNTP耐熱DNA聚合酶TagDNA聚合酶特異性引物一對分別與待擴(kuò)增DNA序列5’端相同，3’端互補(bǔ)的寡核苷酸片段。模板DNA模板DNA引物TaqDNA聚合酶dNTP含Mg2+緩沖液PCR三步曲變性95?C延伸72?C退火Tm-5?C循環(huán)25~30次使模板DNA完全變性成單鏈。同時引物自身和引物之間存在的局部雙鏈得以消除使引物和模板DNA退火結(jié)合此溫度下DNA聚合酶以dNTP為底物催化DNA鏈的延長三個步驟為一個循環(huán)，每次循環(huán)產(chǎn)物作為下一輪模板進(jìn)入下一輪循環(huán)第一輪循環(huán)5/3/3/5/5/5/5/5/引物A引物B變性（95℃）6075859590807065555045403530℃退火（60℃）延伸（72℃）DNA-PolDNA-Pol溫度第二輪循環(huán)5/5/5/3/3/5/5/5/引物A引物B6075859590807065555045403530℃變性（95℃）退火（60℃）延伸（72℃）5/5/5/5/溫度DNA-PolDNA-PolDNA-PolDNA-Pol第三次循環(huán)5/5/5/5/5/5/5/6075859590807065555045403530℃5/變性（95℃）退火（60℃）延伸（72℃）溫度DNA-PolDNA-PolDNA-PolDNA-PolDNA-PolDNA-PolDNA-PolDNA-Pol基因組DNADNA樣品第一次循環(huán)第二次循環(huán)第三次循環(huán)第四次循環(huán)待擴(kuò)增序列引物A引物B3/5/3/5/5/3/5/3/PCR二、PCR的主要用途PCR的用途基因突變分析基因的體外突變目的基因的克隆DNA序列測定DNA和RNA的微量分析1、與反轉(zhuǎn)錄結(jié)合，直接從組織細(xì)胞中的mRNA獲得目的基因；2、利用特異性引物以cDNA或基因組DNA為模板獲得目的基因片段；3、利用簡并引物從cDNA文庫或基因組文庫中獲得具有一定序列相似性的基因片段；4、利用隨機(jī)引物從cDNA文庫中克隆基因。利用PCR技術(shù)可以隨意設(shè)計引物在體外對目的DNA的基因片段進(jìn)行嵌和、缺失、點(diǎn)突變等改造。PCR技術(shù)高度敏感，對DNA的含量要求很低。理論上只要存在一分子的模板就可以獲得目的片段。RNA需要反轉(zhuǎn)錄。利用PCR結(jié)合其它技術(shù)，可以提高基因突變檢測的敏感性。三、幾種重要的PCR衍生技術(shù)（一）逆轉(zhuǎn)錄PCR技術(shù)（二）原位PCR技術(shù)（三）實時PCR技術(shù)第三節(jié)基因文庫GeneLibrary基因組DNA文庫(genomicDNAlibrary)cDNA文庫(cDNAlibrary)基因文庫(genelibrary)是指一個包含了某一生物體全部DNA序列的克隆群體。一、基因組DNA文庫基因組DNA文庫是指生物的基因組DNA的信息（包括所有的編碼區(qū)和非編碼區(qū)）以DNA片段形式貯存的克隆群體。用于構(gòu)建基因組文庫的載體有噬菌體、粘粒和酵母人工染色體等?；蚪M文