植物生理指標(biāo)檢測方法

植物組織中可溶性糖含量的測定在作為養(yǎng)分物質(zhì)主要是指可溶性糖和淀粉。它們在養(yǎng)分中的作用主要有：合成纖維素組成細(xì)胞壁；轉(zhuǎn)化并組成其他有機(jī)物如核苷酸、核酸等；分解產(chǎn)物是其他很多有機(jī)物合成的原料，如糖在呼吸過程中形成的有機(jī)酸，可作為 NH 3的受體而轉(zhuǎn)化為氨基酸；糖類作為呼吸基質(zhì)，為作物的各種合成過程和各種生命活動供給了所需的能量。由于碳水化合物具有這些重要的作用，所以是養(yǎng)分中最根本的物質(zhì)，也是需要量最多的一類。Ⅰ蒽酮法測定可溶性糖一、原理糖在濃硫酸作用下，可經(jīng)脫水反響生成糠醛或羥甲基糠醛，生成的糠醛或羥甲基糠醛可與蒽酮反響生成藍(lán)綠色糠醛衍生物，在肯定范圍內(nèi)，顏色的深淺與糖的含量成正比，故可用于糖的定量測定。該法的特點是幾乎可以測定全部的碳水化合物，不但可以測定戊糖與己糖含量，而且可以測全部寡糖類和多糖類，其中包括淀粉、纖維素等〔由于反響液中的濃硫酸可以把多糖水解成單糖而發(fā)生反響〕，所以用蒽酮法測出的碳水化合物含量，實際上是溶液中全部可溶性碳水化合物總量。在沒有必要細(xì)致劃分各種碳水化合物的情況下，用蒽酮法可以一次測出總量，省去很多麻煩，因此，有特別的應(yīng)用價值。但在測定水溶性碳水化合物時，則應(yīng)留意切勿將樣品的未溶解殘渣參加反響液中，不然會由于細(xì)胞壁中的纖維素、半纖維素等與蒽酮試劑發(fā)生反響而增加了測定誤差。此外，不同的糖類與蒽酮試劑的顯色深度不同，果糖顯色最深，葡萄糖次之，半乳糖、甘露糖較淺，五碳糖顯色更淺，故測定糖的混合物時，常因不同糖類的比例不同造成誤差，但測定單一糖類時，則可避開此種誤差。糖類與蒽酮反響生成的有色物質(zhì)在可見光區(qū)的吸取峰為620nm，故在此波長下進(jìn)展比色。二、試驗材料、試劑與儀器設(shè)備〔一〕試驗材料任何植物鮮樣或干樣?！捕吃噭?0％乙醇。葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)溶液〔100 μg/mL 〕：準(zhǔn)確稱取100 mg 分析純無水葡萄糖，溶于蒸餾水并定容至 100mL10倍〔100μg/mL〕。3．蒽酮試劑：稱取1.0g蒽酮，溶于80%濃硫酸〔將98%濃硫酸稀釋，把濃硫酸緩緩參加到蒸餾水中〕1000mL2～3周?！踩硟x器設(shè)備分光光度計，分析天平，離心管，離心機(jī)，恒溫水浴，試管，三角瓶，移液管〔mL〕，剪刀，瓷盤，玻棒，水浴鍋，電爐，漏斗，濾紙。三、試驗步驟

5 、 1 、 0.5樣品中可溶性糖的提取稱取剪碎混勻的穎樣品0.5～1.0g〔或干樣粉末5～100mg〕，放入大試管中，參加15mL蒸餾水，在沸水浴中煮沸20min，取出冷卻，過濾入100mL容量瓶中，用蒸餾水沖洗殘渣數(shù)次，定容至刻度。標(biāo)準(zhǔn)曲線制作取60～5分別編號，按表24-1參加各試劑。試劑管號24-1試劑管號012345100μg/mL葡萄糖溶液〔mL〕00.20.40.60.81.0蒸餾水〔mL〕1.00.80.60.40.20蒽酮試劑〔mL〕5.05.05.05.05.05.0葡萄糖量〔μg〕020406080100將各管快速搖動混勻后，在沸水浴中煮10min，取出冷卻，在620nm波長下，用空白調(diào)零測定光密度，以光密度為縱坐標(biāo)，含葡萄糖量〔μg〕為橫坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。3．樣品測定取待測樣品提取液1.0mL5mL，同以上操作顯色測定光密度。重復(fù)3次。四、結(jié)果計算溶性糖含量〔％〕＝從標(biāo)準(zhǔn)曲線查得糖的量〔μg〕×提取液體積〔ml〕×稀釋倍數(shù)/[測定用樣品液的體積(ml)×樣品重量(g)×106]×100式中：C——從標(biāo)準(zhǔn)曲線查得葡萄糖量，μg。VT——,mL。V1——mL。W——樣品重〔g〕。植物體內(nèi)可溶性蛋白質(zhì)含量的測定植物體內(nèi)的可溶性蛋白質(zhì)大多數(shù)是參與各種代謝的酶類，測其含量是了解植物體總代謝的一個重要指標(biāo)。在爭論每一種酶的作用時，常以比活〔酶活力單位/mg蛋白〕表示酶活力大小及酶制劑純度。因此，測定植物體內(nèi)可溶性蛋白質(zhì)是爭論酶活的一個重要工程。常用測定方法有Lowry法和考馬斯亮藍(lán)G-250染料結(jié)合法。本試驗將分別介紹這兩種方法。1．考馬斯亮藍(lán)法一、試驗原理考馬斯亮藍(lán)G-250測定蛋白質(zhì)含量屬于染料結(jié)合法的一種?？捡R斯亮藍(lán)G-250在游離態(tài)下呈紅色，當(dāng)它與蛋白質(zhì)的疏水區(qū)結(jié)合后變?yōu)榍嗌?，前者最大光吸取?65nm。在肯定蛋白質(zhì)濃度范圍內(nèi)〔0-100

nm，后者在595μg/mL〕，蛋白質(zhì)－色素結(jié)合物在595nmG-250結(jié)合在2 min左右的時間內(nèi)到達(dá)平衡，完成反響格外快速，其結(jié)合物在室溫下1h內(nèi)保持穩(wěn)定。該反響格外靈敏，可測微克級蛋白質(zhì)含量，所以是一種比較好的蛋白質(zhì)定量法。二、試驗材料、儀器和試劑材料小麥葉片或其他植物組織儀器設(shè)備mL10.5mL2mL1mL3支。試劑1000μg/mL100μg/mL?？捡R斯亮藍(lán)G-250100mg考馬斯亮藍(lán)G-25050mL90%85%〔W/V〕磷酸100mL1000mL。此溶液在常溫下可放置一個月。(3) 90%乙醇(4) 磷酸〔85%，W/V〕三、試驗步驟：可溶性蛋白的提取0.5g5mL4oC50mmol/L，pH7.0磷酸緩沖液和少量石英砂研磨成勻漿后，轉(zhuǎn)入10mL4oC10min15000rpm/min下冷凍25min，上清液即為過氧化物粗提液。4oC下保存?zhèn)溆?。?biāo)準(zhǔn)曲線的繪制(1) 0-100μg/mL標(biāo)準(zhǔn)曲線的制作60-100μg/mL1mL0.1mL，分10mL5mL考馬斯亮藍(lán)G-2502min后，595nm下比色，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。 配制0-100μg/mL血清白蛋白液 管號123456100μg/mL牛血清蛋白量(mL)00.20.40.60.81.0蒸餾水量(mL)1.00.80.60.40.20蛋白質(zhì)含量(mg)00.020.040.060.080.10(2)0-1000μg/mL標(biāo)準(zhǔn)曲線的制作610-20-1000μg/mL1mL〔1〕操作一樣，0-1000μg/mL的標(biāo)準(zhǔn)曲線。配制0-1000μg/mL血清蛋白血液 管號7891011121000μg/mL牛血清白蛋白〔mL〕00.20.40.60.81.0蒸餾水量(mL)1.00.80.60.40.20蛋白質(zhì)含量(mg)00.20.40.60.81.0樣品提取液中蛋白質(zhì)濃度的測定吸取樣品提取液0.1 mL〔樣品提取見各酶活測定〕，放入具塞刻度試管中〔設(shè)兩個重復(fù)管〕，參加5mL考馬斯亮藍(lán)G-250試劑，充分混合，放置2min后在595nm下比色，記錄吸光度值，通過標(biāo)準(zhǔn)曲線查得蛋白質(zhì)含量。四、結(jié)果計算與分析C V樣品蛋白質(zhì)含量〔mg/g鮮重〕= aW式中C－查標(biāo)準(zhǔn)曲線所得每管蛋白質(zhì)含量〔mg〕；V－提取液總體積〔mL〕；a－測定所取提取液體積〔mL〕；W－取樣量〔g〕。葉綠素測定方法10.2g，放入容量瓶。250ml95%的乙醇。348-72小時，中間搖擺一次?！脖ＷC各批次浸提時間全都〕CA=13.95*D665-6.88*D649CB=24.96*D649-7.32*D665C單位：mg/L葉綠素a=CA*0.05/2葉綠素b=CB*0.05/2CA=13.95*D665-6.88*D649CB=24.96*D649-7.32*D665C單位：mg/L葉綠素a=CA*0.05/2葉綠素b=CB*0.05/2葉C其他=(1000*D470-2.05*CA-114.8CB)/245葉綠素=C其他 其他*0.05/2總?cè)~綠素含量為三者之和。一般葉綠素a/b3：14：1選擇的波長不一樣，計算公式就不一樣，網(wǎng)上也有其他的波長方法，計算公式里的系數(shù)響應(yīng)也有差異。淀粉含量的測定原理淀粉是由葡萄糖殘基組成的多糖，在酸性條件下加熱使其水解成葡萄糖，測定葡萄糖含量，依據(jù)葡萄糖含量換算成淀粉含量(C6H1O6n→(H1O5)n+nH2O625nm波長下的OD值與糖含量成正比。由于蒽酮試劑與糖反響的呈色強(qiáng)度隨時間變化，故必需在反響后馬上在同一時間內(nèi)比色儀器用具和試劑儀器用具：移液槍、10ml離心管、試管、50ml容量瓶、試管架、棕色瓶〔>=500ml〕、螺口瓶〔>=500ml〕、燒杯、移液管〔連續(xù)加樣器〕、離心機(jī)、分光光度計；試劑：葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)液4Ⅰ：準(zhǔn)確稱取0.1000g蔗糖〔分析純〕，于小燒杯中加水溶解，定容至100ml，加2-3滴濃H2S0，該溶液可長期保存；4葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)液4Ⅱ:準(zhǔn)確吸取1mg/ml的蔗糖標(biāo)準(zhǔn)液5ml，加水定容量50ml，得到濃度為0.1mg/ml蔗糖標(biāo)準(zhǔn)液；蒽酮溶液：100mg蒽酮溶于50ml濃H2S0〔化學(xué)純〕中，避光保存，當(dāng)天配制當(dāng)天使用；3mol/LNaOH溶液：12g氫氧化鈉溶于100ml蒸餾水；43mol/LHcl溶液：25ml濃鹽酸與75ml蒸餾水混勻。測定方法植物淀粉相關(guān)溶液的提?。合驕y可溶性糖所剩殘渣中參加7ml3mol/L的鹽酸，在沸水浴中煮沸45分鐘，取出冷卻，4000轉(zhuǎn)/分別心15分鐘，取上清到50ml容量瓶中，參加7ml3mol/LNaOH，用蒸餾水定容到50ml，作為待測樣品。標(biāo)準(zhǔn)曲線的配制：吸取0.1mg/ml葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)液按下表參加至11支試管：0123456789100.1mg/ml葡糖(ml)00.10.20.30.40.50.60.70.80.91.0蒸餾水(ml)20.90.80.70.60.50.40.30.20.10〔mg/ml〕00.010.020.030.040.050.060.070.080.090.1蒽酮試劑(ml)8.04.04.04.04.04.04.04.04.04.04.045℃水浴中顯色10~15分鐘，625nm處測OD值準(zhǔn)確吸取待測液1.0ml，加蒽酮4.0ml，在45 ℃水浴中顯色10-15分鐘，各管在參加蒽酮試劑時要快速，加完后用力振蕩混勻。625nm處測OD值，從標(biāo)準(zhǔn)曲線上得到提取液中可溶性總糖含量。結(jié)果計算葡萄糖糖含量〔%〕=標(biāo)準(zhǔn)曲線對應(yīng)含糖量×定容體積×100／〔樣品質(zhì)量×顯色吸取液體積×103〕粗淀粉含量〔%〕=葡萄糖含量×0.9強(qiáng)酸溶液，留意安全的測定一、試驗原理超氧化物歧化酶(superoxidedismutase，SOD，EC1.15.1.1)普遍存在于動、植物體內(nèi)，是一種去除超氧陰離子自由基的酶。本試驗依據(jù)超氧物歧化酶抑制氮藍(lán)四唑(NBT)在光下的復(fù)原作用來確定酶活性大小。O在氧化物質(zhì)存在下，核黃素可被光復(fù)原，被復(fù)原的核黃素在有氧條件下極易再氧化而產(chǎn)生氧自由基·ˉ，O22可將氮藍(lán)四唑復(fù)原為藍(lán)色的甲腙，后者在560nm處有最大吸取。而SOD可去除O·ˉ，從而抑制了甲腙的形成。于是光復(fù)原反響后，反響液藍(lán)色愈深，說明酶活性愈低，反之酶活性愈高。據(jù)此可以計算出酶活性的大小。2二、試驗材料、儀器和試劑：材料小麥葉片或其他植物組織儀器設(shè)備(4000Lx)；試管或指形管數(shù)支。試劑1.50mmol/L磷酸緩沖液(pH7.8)。2.130mmol/L甲硫氨酸(Met)1.9399gMet100mL。3.750μmol/L氮藍(lán)四唑(NBT)0.06133gNBT100mL，避光保存。4.100μmol/LEDTA-Na20.03721gEDTA-Na2用磷酸緩沖液定容至1000mL。5.20μmol/L0.0753g1000mL避光存。三、試驗步驟：顯色反響5mL指形管數(shù)支，測定管數(shù)目依據(jù)處理而定，另42依次參加以下各溶液比照0.25mL24000Lx20min左右，主要看顏色的變化，全部變成灰色，比照可能較淺。測定待反響完畢，以不照光的比照管做空白，依次測定其它各管的吸光值。2各溶液顯色反響用量試劑(酶)用量(mL)終濃度(比色時)0.05mol/L磷酸緩沖液1.5130mmol/LMet溶液0.313mmol/L750μmol/LNBT溶液0.375μmol/L100μmol/LEDTA–Na2液0.310μmol/L20μmol/L核黃素0.32.0μmol/L酶液/緩沖液〔比照〕0.1比照管以緩沖液代替酶液蒸餾水0.2總體積3.0四、結(jié)果計算與分析SOD活性單位以抑制NBT光化復(fù)原的50%為一個酶活性單位表示，按下式計算SOD活性。SOD總活性[u/gFW)]

(AckAE)VT0.5AckWVtSOD比活力[u/mg()]

SOD總活性蛋白質(zhì)含量式中：SOD總活性以酶單位每克鮮重表示。比活力單位以酶單位每毫克蛋白表示。Ack—照光比照管的吸光度。AE—樣品管的吸光度。VT—樣品液總體積，mL。Vt—測定時樣品用量，mL。W—樣品鮮重，g。蛋白質(zhì)含量單位為mg/g。五、留意事項配好的Met4℃冰箱中保存?zhèn)溆茫苑乐筂et活性損失。配好的NBT溶液須放入棕色，并在4℃冰箱中保存?zhèn)溆?，以防止NBT見光分解。配好的核黃素溶液須放入棕色避光保存。六、思考題在SOD?影響本試驗準(zhǔn)確性的因素是什么?應(yīng)如何抑制?試驗六植物抗氧化酶活性的測定酶液的提取0.5g5mL4oC50mmol/L，pH7.0磷酸緩沖液和少量石英砂研磨成勻漿后，轉(zhuǎn)入10mL4oC10min15000rpm/min下冷凍25min，上清液即為過氧化物粗提液。4oC下保存?zhèn)溆谩?．過氧化氫酶(CAT)的活性測定HO2植物在逆境下或年輕時，由于體內(nèi)活性氧代謝加強(qiáng)而導(dǎo)致H2O2累積。H2O2可以直接或間接地氧化細(xì)胞內(nèi)的核酸、蛋白質(zhì)等生物大分子，并使細(xì)胞膜患病損害，從而加速細(xì)胞的年輕和解體。過氧化氫酶可以HO22抗逆性親熱相關(guān)。一、試驗原理2H2O2

在240nm波長下有強(qiáng)吸取，過氧化氫酶(Catalase,CAT,EC1.11.1.6)能分解過氧化氫，使反響溶液吸光度(A240)隨反響時間而降低。依據(jù)測量吸光度的變化速度即可測出過氧化氫酶的活性。二、試驗材料、儀器和試劑材料小麥葉片或其他植物組織儀器設(shè)備10mL3支，恒溫水浴鍋。試劑0.2mol/LpH7.8磷酸緩沖液(1%聚乙烯吡咯烷酮)。0.1mol/LH2O2(0.1mol/L高錳酸鉀標(biāo)定)。三、試驗步驟：10mL32支為空白管將酶液煮死1劑。管號試劑(酶)管號試劑(酶)S0S1S2粗酶液(mL)0.20.20.2pH7.8磷酸緩沖液(mL)1.51.51.5蒸餾水(mL)1.01.01.02 25oC0.3mL0.1mol/L的HO12 240nm下測定吸光度，每隔lmin14min3支管全部測定完后，計算酶活性。四、結(jié)果計算與分析1minA2400.11個酶活單位(μ)。過氧化氫酶活性[u/(gmin)] 式中：ΔA240——AS0–(AS1+AS2)/2。

A240VT0.1V1tFWAS0——參加煮死酶液的比照管吸光度。A A ——A A ——S1 S2Vt——粗酶提取液總體積(mL)。V1——測定用粗酶液體積(mL)。FW——樣品鮮重(g)。0.1——A240每下降0.1為1個酶活單位(μ)。t——加過氧化氫到最終一次讀數(shù)時間(min)。留意：凡在240nm下有強(qiáng)吸取的物質(zhì)對本試驗有干擾。五、留意事項試劑中的H2O2的濃度對測定結(jié)果影響較大，要留意標(biāo)定的準(zhǔn)確性。緩沖液中必需加PVP，以防止酶活性降低。六、思考題影響過氧化氫酶活性測定的因素有哪些？超氧化物歧化酶(SOD)的測定七、試驗原理超氧化物歧化酶(superoxidedismutase，SOD，EC1.15.1.1)普遍存在于動、植物體內(nèi)，是一種去除超氧陰離子自由基的酶。本試驗依據(jù)超氧物歧化酶抑制氮藍(lán)四唑(NBT)在光下的復(fù)原作用來確定酶活性大小。在氧化物質(zhì)存在下，核黃素可被光復(fù)原，被復(fù)原的核黃素在有氧條件下極易再氧化而產(chǎn)生氧自由基O2·ˉ，可將氮藍(lán)四唑復(fù)原為藍(lán)色的甲腙，后者在560nm處有最大吸取。而SOD可去除O2·ˉ，從而抑制了甲腙的形成。于是光復(fù)原反響后，反響液藍(lán)色愈深，說明酶活性愈低，反之酶活性愈高。據(jù)此可以計算出酶活性的大小。八、試驗材料、儀器和試劑：材料小麥葉片或其他植物組織儀器設(shè)備(4000Lx)；試管或指形管數(shù)支。試劑1.50mmol/L磷酸緩沖液(pH7.8)。2.130mmol/L甲硫氨酸(Met)1.9399gMet100mL。3.750μmol/L氮藍(lán)四唑(NBT)0.06133gNBT100mL，避光保存。4.100μmol/LEDTA-Na20.03721gEDTA-Na2用磷酸緩沖液定容至1000mL。5.20μmol/L0.0753g1000mL避光存。九、試驗步驟：顯色反響5mL指形管數(shù)支，測定管數(shù)目依據(jù)處理而定，另42依次參加以下各溶液比照0.25mL24000Lx20min左右，主要看顏色的變化，全部變成灰色，比照可能較淺。測定待反響完畢，以不照光的比照管做空白，依次測定其它各管的吸光值。2各溶液顯色反響用量試劑(酶)用量(mL)終濃度(比色時)0.05mol/L磷酸緩沖液3130mmol/LMet溶液0.613mmol/L750μmol/LNBT溶液0.675μmol/L100μmol/LEDTA–Na2液0.610μmol/L20μmol/L核黃素0.62.0μmol/L酶液0.1比照管以緩沖液代替酶液蒸餾水0.5總體積6.0十、結(jié)果計算與分析SOD活性單位以抑制NBT50%為一個酶活性單位表示，按下式計算SOD活性。SOD總活性[u/gFW)]

(AckAE)VT0.5AckWVtSOD比活力[u/mg()]

SOD總活性蛋白質(zhì)含量式中：SOD總活性以酶單位每克鮮重表示。比活力單位以酶單位每毫克蛋白表示。Ack—照光比照管的吸光度。AE—樣品管的吸光度。VT—樣品液總體積，mL。Vt—測定時樣品用量，mL。W—樣品鮮重，g。蛋白質(zhì)含量單位為mg/g。十一、 留意事項配好的Met4℃冰箱中保存?zhèn)溆?，以防止Met活性損失。配好的NBT溶液須放入棕色，并在4℃冰箱中保存?zhèn)溆?，以防止NBT見光分解。配好的核黃素溶液須放入棕色避光保存。十二、 思考題在SOD?影響本試驗準(zhǔn)確性的因素是什么?應(yīng)如何抑制?3．過氧化物酶(POD)活性的測定一、試驗原理過氧化物酶(peroxidases,POD,EC1.11.1.7)光合作用及生長素的氧化等有親熱關(guān)系，當(dāng)植物受到環(huán)境脅迫時，酶活性就會發(fā)生變化。在過氧化氫存在下，過氧化物酶能使愈創(chuàng)木酚氧化，生成茶褐色物質(zhì)，該物質(zhì)在470nm處有最大吸取，可用分光光度計470nm的吸光度變化，測定過氧化物酶活性。二、試驗材料、儀器和試劑材料小麥葉片或其他植物組織儀器設(shè)備分光光度計，研缽，100mL容量瓶，吸管，離心機(jī)。試劑50mmol/L磷酸緩沖液pH7.0。30%613μL50mL，備用。含愈創(chuàng)木酚的混合液：取60.3μL50mmol/L磷酸緩沖液(pH7.0)的燒杯中，置于磁力攪拌器上加熱攪拌，直至愈創(chuàng)木酚溶解，待溶液冷卻后，用磷酸緩沖液pH7.0200mL，保存于冰箱中，備用。三、試驗步驟1cm21只中參加水或磷酸緩沖液(pH7.0)50μl2.9mL和過氧化60μL150μL(如酶活性過高可稀釋之)2.9mL和過氧化氫60μL，馬上開啟秒表記錄時間，于分光光度計上測量波長470nm1min讀數(shù)一次。四、結(jié)果計算與分析以每分鐘吸光度變化值表示酶活性大小，即以ΔA470/[min·g(FW)]表示之。也可以用每分鐘內(nèi)A470變0.011個過氧化物酶活性單位(u)表示。[u/(gmin)]

A470VTWVs0.01t式中：ΔA470——反響時間內(nèi)吸光度的變化。W——植物鮮重，g。VT——提取酶液總體積，mL。Vs——測定時取用酶液體積，mL。t——反響時間，min。五、留意事項愈創(chuàng)木酚的含量會影響測定結(jié)果，在配制愈創(chuàng)木酚溶液時，必需準(zhǔn)確量取。H2O2須準(zhǔn)確配制六、思考題在POD測定的過程中不設(shè)置比照對試驗結(jié)果有無影響？為什么？淀粉酶活力的測定方法α-淀粉酶、β-淀粉酶、葡萄糖淀粉酶和R-酶，它們廣泛存在于動物、植αβ-淀粉酶。-α-1,4糖苷鍵，單獨使用時最終生Ca2+α-淀粉酶活化和穩(wěn)定，它比較耐熱但不耐酸，pH3.6以下可使其鈍化。β-α-1,4糖苷鍵，遇到支鏈淀粉的α-1,6鍵時停頓。單獨作用時β-淀粉酶是一種巰基酶，不需要Ca2+及Cl—等關(guān)心因子，pHα淀粉酶相反，它不耐熱但覺耐酸，6015min可使其鈍化。α-β-淀粉酶同時存在?？梢韵葴y定〔αβ〕淀粉酶總活力，然℃加熱15minβ-α-淀粉酶活力，用總活力減去α-淀粉酶活力，就可求出β-淀粉酶活力。淀粉酶活力大小可用其作用于淀粉生成的復(fù)原糖與3,5-二硝基水楊酸的顯色反響來測3,5-3--5-顏色的深淺與復(fù)原糖的量成正比。以每克樣品在肯定時間內(nèi)生成的復(fù)原糖〔麥芽糖〕量表示酶活大小。1酶活測定方法〔1〕標(biāo)準(zhǔn)曲線的制作(見下表)20ml具塞刻度試管,預(yù)先干凈滅菌枯燥,編號,按表參加試劑。②搖勻,至沸水浴1標(biāo)準(zhǔn)麥芽糖溶液成分表及OD測定值,20ml,1號管作為空白調(diào)零點1標(biāo)準(zhǔn)麥芽糖溶液成分表及OD測定值試劑1234567〔mL〕00.20.61.01.41.82.0H2O〔mL〕2.01.81.41.00.60.203,5-二硝基水楊酸〔mL〕2.02.02.02.02.02.02.0〔mg〕00.20.61.01.41.82.0OD520(2)粗酶液淀粉酶活力測定①待測粗酶液的制備：24h4000r/min10min,65％飽和度的硫酸銨，待硫酸銨充分溶解后于4℃鹽析2h，然后5000r/min離心20min，得到初步純化的淀粉酶。②按以下挨次操作：取預(yù)先干凈滅菌枯燥試管,1ml3ml605min1ml2%40℃水,5min,參加氫氧化鈉溶液終止反響,20ml?！鷵u勻,用分OD520nm30min1mg麥芽糖所需的酶量為一個麥芽糖單位表示酶活性。酶活力測定公式：淀粉酶活力=麥芽糖含量〔mg〕·淀粉酶原液總體積〔mL〕/所加淀粉質(zhì)量的時間間隔要確定全都：2樣品酶活力測定步驟個〕樣品稀釋液〔個〕樣品稀釋液〔ml〕110蒸餾水605min001

樣品〔重復(fù)3

標(biāo)準(zhǔn)空白〔ml〕6030min

1.5 1.5

1.5依次參加DNS 試劑〔ml〕

1.5 1.5 1.51005min0.4mol/LNaOH溶液終止反響〔ml〕

20 20 20反響后的試樣在室溫下靜置10min，如消滅混濁需在離心機(jī)上以4,000rpm離心10min，520nm波特長測定樣品空白〔A0〕和樣品溶液〔A〕的吸光值，A－A0為實測吸光值。用直線回歸方程計算樣品淀粉酶的活性。2活性計算60℃、PH5.621mg1個酶活力單位〔U〕U按下式計算：×=U ×=S×〔30÷60〕×180U——樣品淀粉酶活性，U/ml；K——標(biāo)準(zhǔn)曲線斜率；F——樣品溶液反響前的總量，ml；60——160min；30——反響時間，min。試劑2%淀粉溶液0.4mol/L氫氧化鈉pH5.6檸檬酸緩沖液稱取檸檬酸20.01g1000mLA液。稱取檸檬酸鈉29.41g1000mLBA液13.7mL與B液26.3mL混勻，即為pH5.6之緩沖液。1g3,5-20mL1mol/L50mL蒸餾水，再參加30g酒石酸鉀鈉，待溶解后用蒸餾水稀釋至100Ml，蓋緊瓶塞，防止CO2進(jìn)入。植物組織游離脯氨酸含量的測定原理：植物在逆境條件下，游離脯氨酸便會大量積存，且積存指數(shù)與植物的抗逆性有關(guān)。因此，脯氨酸可作為植物抗逆性的一項生化指標(biāo)。承受磺基水楊酸提取植物體內(nèi)的游離脯氨酸，不僅大大削減了其他氨基酸的干擾，快速簡便，而且不受樣品狀態(tài)(干或鮮樣)限制。在酸性條件下，脯氨酸與茚三酮反響生成穩(wěn)定520nm處有一最大吸取峰。脯氨酸濃度的凹凸在肯定范圍內(nèi)與其消光度成正比。材料、儀器設(shè)備及試劑1．材料：植物葉片(20m1)；具塞刻度試管(20m1)注射器或滴管(5～lOml)。試劑：(1)3％磺基水楊酸溶液(2)甲苯；(3)2.56mo1.L-l3:2混合，作為溶劑進(jìn)展配制，此液在4℃下2～3天有效(4)脯氨酸標(biāo)準(zhǔn)溶液：準(zhǔn)確稱取25mg脯氨酸，用蒸餾水溶解250ml100ug.mL-l10ml，用蒸餾水稀釋至lOOml10μg．mL-1的脯氨酸標(biāo)準(zhǔn)液。11取7支具塞刻度試管按表9.2-140mi。(2)5ml0號管勻比照在波長520nm下比色?！?〕以消光值為縱坐標(biāo)，脯氨酸含量為橫坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，求線性回歸方程9．2．1各試管中試劑參加量試管0123456脯氨酸標(biāo)準(zhǔn)溶液(m1)00．20．40．81．21．62．0水(m1)21．81．61．20．80．4 0冰乙酸(m1)222222 2茚三酮顯色液(m1)樣品測定333333 3〔1〕脯氨酸提取：取不同處理的剪碎混勻植物葉片0．2～0．5g(干樣依據(jù)水分含量酌減)，分別置于大試5m13％磺基水楊酸溶液，管口加蓋玻璃球，于沸水浴中浸提10min。2m12m13m140min，下步操作按標(biāo)準(zhǔn)曲線制做方法進(jìn)展甲苯萃取和比色〔向各管參加5ml甲苯充分振蕩，以萃取紅色物質(zhì)。靜0520nm下比色〕。結(jié)果計算：從標(biāo)準(zhǔn)曲線中查出測定液中脯氨酸濃度脯氨酸含量的百分?jǐn)?shù)。脯氨酸[μg.g-1(干或鮮重)](C．V)·(a·W)－1式中：C一提取液中脯氨酸濃度(PS)，由標(biāo)準(zhǔn)曲線求得： V－提取液總體積〔ml〕 A---測定時所吸取得體積〔ml〕 W 樣品重〔g〕試驗一植物激素的酶聯(lián)免疫吸附測定法〔ELISA〕一、試驗?zāi)康膶W(xué)習(xí)植物激素的ELISA測定原理，把握激素測定技術(shù)和樣品提取方法。二、試驗原理免疫測定的方法是利用抗原、抗體特異性反響而建立的，依據(jù)可視化方法的不同可分為：酶聯(lián)免疫、放射免疫、熒光免疫、化學(xué)發(fā)光免疫測定、生物發(fā)光免疫測定、濁度免疫測定法等。由于酶聯(lián)免疫吸附分析法〔Enzyme-linkedImmunosorbentAssays,ELISA〕具有靈敏性高且快速、簡便、本錢低廉、無放射性污染等特點，而日益被廣泛應(yīng)用于植物激素測定。目前，幾大類植物激素IAA、ABA、GA3、GA4、iPA、ZR和DHZR等都建立了相應(yīng)的ELISA方法并有試劑盒出售。ELISA是建立在兩個重要的生物化學(xué)反響根底之上的，即抗原和抗體反響的高度專一性和敏感性；酶的高效催化特性。ELISA把這而這有機(jī)地結(jié)合在一起，即被分析物先與其相應(yīng)的抗體或抗原反響，然后再檢測抗體或抗原上酶標(biāo)記物的活性，從而到達(dá)定性或定量測定的目的。ELISA依據(jù)均相、非均相以及競爭與非競爭可分為非競爭固相免疫測定、非競爭均相免疫測定、競爭均相、競爭固相測定。常用的免疫測定均為非競爭固相和競爭固相免疫測定統(tǒng)稱為酶聯(lián)免疫吸附測定。所用的吸附載體為聚乙烯、聚丙烯、聚苯乙烯酶聯(lián)板以及硝酸纖維素膜〔dot-ELISA〕等。目前植物激素的酶聯(lián)免疫檢測方法有三種形式〔見以下圖〕：直接法，間接法和簡化的間接法?！怖糜坞x抗原和酶標(biāo)抗原與吸附的抗體進(jìn)展競爭。Ab+H+HE=AbH+AbHE其中Ab表示抗體，H表示游離激素，HE表示酶標(biāo)抗原。依據(jù)質(zhì)量作用定律，當(dāng)該反響體系中Ab及HEH越多，AbHAbHE形成的就越少，即結(jié)合在板上的酶標(biāo)抗原就越少；反之游離H越少，AbH形成的就越少，而AbHE形成的就越多，即結(jié)合在板上的酶標(biāo)抗原就越多。通過檢測酶的活性，就可以確定游離H量的多少。間接法和簡化的間接法是包被抗原〔間接法〕。利用游離抗原和吸附抗原與游離抗體進(jìn)展競爭。間接法是競爭后，再參加二抗標(biāo)記的酶，而簡化的間接法是在競爭的同時就參加二抗標(biāo)記的酶。Ab+H+HP=AbH+AbHP其中AbHHP表示吸附在板上的激素－蛋白質(zhì)復(fù)合物當(dāng)該反響體系中Ab及HP的量確定時，游離H越多，AbH形成的就越多，而AbHP形成的就越少，即結(jié)H越少，AbHAbHP形成的就越多，即結(jié)合在板上的抗體就越多。而板上的抗體可以與二抗標(biāo)記的酶結(jié)合，檢測酶的活性，就可以確定游離H量的多少。間接法直接法簡化間接法三、試驗材料、儀器和試劑材料穎植物材料儀器設(shè)備96量液體加樣器〔10μL，40μL，200μL，1000μL〕，帶蓋瓷盤〔內(nèi)鋪濕紗布〕。試劑3包被緩沖液稱取1.5gNa2CO3, 2.93gNaHCO3, 0.2gNaN〔可不加用量筒加1000mL蒸餾水，3pH9.6。磷酸鹽緩沖液〔PBS〕：稱取8.0gNaCl,0.2gKH2PO4, 2.96gNa2HPO4·12H2O，用量筒加1000mL蒸餾水，pH7.5。樣品稀釋液：500mLPBS0.1mLTween-20，0.5g明膠〔稍加熱溶解〕。5.10gC6H8O7·H2O〔檸檬酸〕，18.43gNa2HPO4·12H2O1000mL蒸餾1mLTween-20，pH5.0。洗滌液：1000mLPBS1mLTween-20。終止液：2mol/L硫酸。提取液：801mmol/LBHT(二叔丁基對甲苯酚為抗氧化劑，先用100%甲醇溶解BHT，80%的濃度。否則BHT難溶解)。各激素包被抗原、各激素抗體、激素標(biāo)準(zhǔn)物和辣根過氧化物酶〔HRP〕標(biāo)記的二抗〔間接和簡化間接酶免疫測定用試劑〕。各激素抗體、激素標(biāo)準(zhǔn)物和各激素酶標(biāo)物〔直接酶免疫測定用試劑〕。四、試驗步驟樣品中激素的提取稱取0.5-1.0g〔假設(shè)取樣后材料不能馬上測定-2℃的低溫冰箱中，2mL樣品提取液，在冰浴下研磨成勻漿，轉(zhuǎn)入10mL2mL提取液分次將研缽沖洗干凈，一并轉(zhuǎn)入試管中，搖勻后放置在4℃冰箱中。4℃下提取41000g離心15min試驗中離心機(jī)型號LDZ5-4000rpm),1mL41h，離心，合并上清液并記錄體積，殘渣棄去。上清液過C-18固相萃取柱。具體步驟是：80%甲醇〔1mL〕平衡柱→上樣→收集樣品→移開樣品后100%甲醇〔5mL〕洗柱→100%乙醚〔5mL〕洗柱→100%甲醇〔5mL〕洗柱→循環(huán)。5mL塑料離心管中，真空濃縮枯燥或用氮氣吹干，除去提取液中的甲醇，用樣品稀釋液定容〔0.5g1.5-3.0mL左右樣品稀釋液定容〕。樣品測定10mL包被緩沖液中參加肯定量的包被抗原〔最適稀釋倍數(shù)見試劑盒標(biāo)簽〕，混勻，在酶標(biāo)100μL。然后將酶標(biāo)板放入內(nèi)鋪濕紗布的帶蓋瓷盤內(nèi)，置于373h。洗板：將包被好的板取出，放在室溫下平衡。然后甩掉包被液，將下口瓶內(nèi)的洗滌液通過乳膠管均勻0.5min,3次，將板內(nèi)殘留洗滌液在吸水紙上甩干。競爭：即加標(biāo)準(zhǔn)物、待測樣和抗體。0.98mL20μL激素的標(biāo)樣試劑〔100μg/mL〕,2023ng/mL1000ng/mL,500ng/mL,250ng/mL,125ng/mL,62.5ng/mL，31.25ng/mL，15.625ng/mL，0ng/mL。將系列標(biāo)準(zhǔn)樣參加96孔酶標(biāo)板的前三行，每個濃度加3孔，每50μL，其余孔加待測樣，每個樣品重復(fù)三孔，每孔50μL。5mL樣品稀釋液中參加肯定量的抗體〔最適稀釋倍數(shù)見試劑盒標(biāo)簽〕,混勻后每孔加50μL，然后將酶標(biāo)板參加濕盒內(nèi)開頭競爭。370.5h。洗板：方法同包被之后的洗板。但要留意第一次參加洗滌液后要馬上甩掉。然后再接著加其次次。目的是防止各孔的相互干擾。加二抗：將肯定量的酶標(biāo)二抗，參加10mL樣品稀釋液中〔最適稀釋倍數(shù)見試劑盒標(biāo)簽〕，混勻后，100μL370.5h。洗板：方法同競爭之后的洗板〔步驟4〕，洗五次，10-20mg鄰苯二胺〔OPD〕10mL底物緩沖液中〔留神勿用手接觸OPD〕，2-4μL30%H0?；靹?，在每孔中加100μL〔在暗處操作〕，然后放入濕盒內(nèi)，當(dāng)顯色22〔0ng/mL2023ng/mLOD1.0左右時50μL2mol/L硫酸終止反響。比色：在酶聯(lián)免疫分光光度計上依次測定標(biāo)準(zhǔn)物各濃度和各樣品492nm處的OD值。五、結(jié)果計算與分析標(biāo)準(zhǔn)曲線用于ELISA結(jié)果計算最便利的是logit〔ng/mL的自然對數(shù)表示，縱坐標(biāo)用各濃度顯色值的logit值表示。Logit值的計算方法如下：B/B0 B0Logit〔B/B〕=ln————=ln————01-B/B0 B0-BB00ng/mL孔的顯色值，B是其它濃度的顯色值。作出的logit曲線在檢測范圍內(nèi)應(yīng)是直線。待測樣品可依據(jù)其顯色值的logit值從標(biāo)準(zhǔn)曲線計算出所含激素濃度〔ng/mL〕的自然對數(shù)，再經(jīng)過反對數(shù)即可知其激素的濃度〔ng/mL〕。含量計算求得樣品中激素的濃度后，樣品中激素的含量〔ng/g·fw〕可用下式計算：N·V2·V3·BA=—————V1·W其中，A表示激素的含量〔ng/g·fw〕；V2表示提取樣品后，上清液的總體積；V1當(dāng)提取的上清液全部進(jìn)展真空濃縮枯燥時V1與V2的體積是相等的〕V3表示真空濃縮后用樣品稀釋液定容的體積；W表示樣品的鮮重；N表示樣品中激素的濃度〔ng/mL〕；B表示樣品的稀釋倍數(shù)〔樣品稀釋液定容以后的稀釋倍數(shù)〕。無菌技術(shù)與微生物分別培育一、 試驗室的主要儀器和常用器皿介紹主要儀器天平、光學(xué)顯微鏡、干熱滅菌用電烘箱、高壓蒸氣滅菌鍋、培育箱、冰箱、搖床、離心pH計、水浴鍋、細(xì)菌過濾器、磁力攪拌器等。常用玻璃器皿玻片、蓋玻片其它器具接種環(huán)、接種針、接種鉤、試管架、鋁鍋、染色缸、玻璃刮刀、洗瓶、注射器、酒精燈塞、濾紙、pH試紙、紗布、棉花、包扎繩。二、 一般光學(xué)顯微鏡觀看細(xì)胞示范光學(xué)顯微鏡可區(qū)分大于0.2um的物體，有肯定的適用范圍。假設(shè)有更高的試驗要求可以選擇掃描電子