證券投資分析實(shí)習(xí)大綱

PAGEPAGE13脂肪酸生物標(biāo)記方法研究零排放豬舍基質(zhì)墊層微生物群落多樣性劉波1基金項(xiàng)目：國家科技部科技支撐計(jì)劃-華南村鎮(zhèn)塘壩地表飲用水安全保障適用技術(shù)研究與示范（2008ZX07425-002）；福建省財(cái)政專項(xiàng)-福建省農(nóng)業(yè)科學(xué)院科技創(chuàng)新團(tuán)隊(duì)建設(shè)基金（STIF-Y03）；福建省發(fā)展和改革委員會(huì)飼用益生菌產(chǎn)業(yè)化技術(shù)的研究項(xiàng)目的資助。作者簡(jiǎn)介：劉波（1957～），男，福建惠安人，博士、研究員，主要從事微生物生物技術(shù)和生物防治研究.E-mail:基金項(xiàng)目：國家科技部科技支撐計(jì)劃-華南村鎮(zhèn)塘壩地表飲用水安全保障適用技術(shù)研究與示范（2008ZX07425-002）；福建省財(cái)政專項(xiàng)-福建省農(nóng)業(yè)科學(xué)院科技創(chuàng)新團(tuán)隊(duì)建設(shè)基金（STIF-Y03）；福建省發(fā)展和改革委員會(huì)飼用益生菌產(chǎn)業(yè)化技術(shù)的研究項(xiàng)目的資助。作者簡(jiǎn)介：劉波（1957～），男，福建惠安人，博士、研究員，主要從事微生物生物技術(shù)和生物防治研究.E-mail:fzliubo@163.com，通訊作者。Foundationitem:TheprojectwasfinanciallysupportedbyNationalKeyTechnologyR&DProgram（2008ZX07425-002）,andFinancialDepartmentofFujianGovernment-ScienceandTechnologyInnovationFoundationofFAAS(STIF-Y03),ProbioticsR&DprojectofFujiangProvincialDevelopmentandReformcommittee.Biography:LIUBo,Ph.D.,Professor,mainlyengagedinmicrobialbiotechnologyandbiocontrol.E-mail:fzliubo@163.com,Correspondingauthor.（1.福建省農(nóng)業(yè)科學(xué)院農(nóng)業(yè)生物資源研究所，福建福州350003；2.中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院環(huán)境與可持續(xù)發(fā)展研究所，北京100081；3。福建省農(nóng)業(yè)科學(xué)院農(nóng)業(yè)工程研究所，福建福州350003；4.福建省寧德地區(qū)農(nóng)科所，福建寧德355003）摘要：用微生物群落脂肪酸生物標(biāo)記總量，分析零排放豬舍基質(zhì)墊層微生物群落的數(shù)量變化，日本洛東微生物菌種處理組和零排放I號(hào)菌種處理組各層微生物脂肪酸生物標(biāo)記含量變化趨勢(shì)相近?；|(zhì)墊層微生物群落脂肪酸生物標(biāo)記檢測(cè)出37個(gè)生物標(biāo)記，構(gòu)成微生物群落的指紋圖譜，含量最高的前四個(gè)生物標(biāo)記為：細(xì)菌16:00含量為431260，細(xì)菌18:1ω9c含量為413075，厭氧細(xì)菌18:1ω7c含量為101368，耗氧細(xì)菌i15:0含量為90328.不同的生物標(biāo)記多樣性指數(shù)在基質(zhì)墊層不同層次分布不同，可作為衡量特定微生物生物標(biāo)記功能的一個(gè)指標(biāo)。通過基質(zhì)墊層微生物脂肪酸生物標(biāo)記特征指數(shù)B的分析，提出了微生物群落分布的特征指標(biāo)，生物標(biāo)記特征指數(shù)B越高，表明微生物群落中的細(xì)菌和真菌含量越高，有利于基質(zhì)墊層分解糞便排泄物，可作為基質(zhì)墊層微生物群落變化優(yōu)劣的特征性指標(biāo)；通過基質(zhì)墊層耗氧細(xì)菌和厭氧細(xì)菌脂肪酸生物標(biāo)記含量比值，構(gòu)建發(fā)酵指數(shù)F，作為基質(zhì)墊層發(fā)酵特性的指標(biāo)，發(fā)酵指數(shù)F越高，表明耗氧細(xì)菌起的作用越大，反之，耗氧細(xì)菌起的作用越小，生物標(biāo)記的發(fā)酵指數(shù)可以作為研究糞便排泄物的微生物分解過程的指數(shù)。關(guān)鍵詞：零排放豬舍；基質(zhì)墊層；磷脂脂肪酸（PLFAs）、ThediversityofPLFAsbiomarkersforthemicrobialcommunityinthestromacushionofnon-pollutionpigstyLIUBo1*,ZHENGXue-Fang1,ZHUChang-Xiong2,LANJiang-Lin1,LINYing-Zhi1,LINBin3,YEYao-Hui4(1.AgriculturalBio-ResourcesResearchInstitute,FujianAcademyofAgriculturalSciences,FujianFuzhou350003;2.InstituteofEnvironmentandSustainableDevelopmentinAgriculture,ChineseAcademyofAgriculturalSciences,Beijing100081;3.AgriculturalEngineeringResearchInstitute,FujianAcademyofAgriculturalSciences,FujianFuzhou350003;4.FujianNingdeAgriculturalResearchInstitute,FujianNingde355003)Abstract:ThePLFAsbiomarkerswereintroducedintoanalyzingtheThediversityofPLFAsbiomarkersforthemicrobialcommunityinthestromacushionofnon-pollutionpigsty.ThemicrobialstrainsofLUODONandLPF#1wereusedtotreatthestromacushioninthenon-pollutionpigsty.Theresultsshowedthattheefficiencyoffomentationonthepigeffluentbythetwostrainsweresimilar.37ofPLFAsbiomarkersweredetectedoutbytheMIDImicrobialidentifysystem,whichconstructedthefingerprintingofthemicrobialcommunityinthestromacushioninthenon-pollutionpigsty.ThefourmosthighofPLFAswerethebacteriunbiomarkerof16:00with431260，bacteriumbiomarkerof18:1ω9cwith413075，theanaerobicbacteriumbiomarkerof18:1ω7cwith101368，theaerobicbacteriumofi15:0with90328.ThedifferentPLFAsbiomarkersweredistributedinthedifferentlayersofstromacushionwithdifferentdensities.Thenewcharacteristicindex(B)ofthePLFAsbiomarkerswasbuiltupasB=[PLFAsbacterium×PLFAsfungus]/[PLFAsactinomycetes×PLFAsprotest]toanalyzethestructureofmicrobialcommunity.Thenewfermentationindex(F)ofthePLFAsbiomarkerswasbuiltupasF=[aerobicbacteriumPLFAs/anaerobicbacteriumPLFAs]todistinguishthefermentationstateinthestromacushionofpigsty.KeyWords:non-pollutionpigsty;stromacushion;PLFAs生物發(fā)酵舍零排放養(yǎng)豬法是根據(jù)微生態(tài)理論和生物發(fā)酵理論，篩選環(huán)境益生菌和飼用益生菌，在豬舍內(nèi)鋪設(shè)由谷殼、鋸末、米糠等原料組成的基質(zhì)墊層作為培養(yǎng)基，接種環(huán)境益生菌，喂飼飼用益生菌，豬飼養(yǎng)在上面，其所排出的糞尿在豬舍內(nèi)經(jīng)微生物完全發(fā)酵迅速降解、消化，從而達(dá)到免沖洗豬欄、無臭味、零排放，從源頭實(shí)現(xiàn)環(huán)保、無公害養(yǎng)殖目的。微生物群落在零排放豬舍中起到?jīng)Q定性的作用，然而，基質(zhì)墊層中的微生物群落動(dòng)態(tài)研究，顯得十分的薄弱，一方面是由于許多功能微生物無法人工培養(yǎng)[1]，另一方面，用分離微生物的方法研究微生物群落動(dòng)態(tài)工作量繁重，使得了解微生物實(shí)際群落變化比較困難。脂肪酸生物標(biāo)記法可以完整檢測(cè)到樣品中微生物群落變化，如真菌、放線菌、耗氧細(xì)菌、厭氧細(xì)菌等。它的主要原理是不同微生物具有不同的特征脂肪酸[2]。White等（1979）[3]最先利用脂肪酸生物標(biāo)記法研究了河口沉積物中微生物群落數(shù)量的變化，隨后，脂肪酸生物標(biāo)記法在堆肥樣品、海河沉積物和土壤微生物研究中得到廣泛應(yīng)用[4~8]。但目前還未見應(yīng)用于零排放豬舍基質(zhì)墊層微生物群落的研究。作者引入FAME譜圖分析方法，研究微生物脂肪酸生物標(biāo)記（PLFAbiomarker）變化動(dòng)態(tài)，指示微生物群落的變化。FAME譜圖分析方法的原理是基于脂類幾乎是所有生物細(xì)胞膜的重要組成部分[9~11],不同微生物體內(nèi)往往具有不同的磷脂脂肪酸組成和含量水平，其含量和結(jié)構(gòu)具有種屬特征或與其分類位置密切相關(guān)，能夠標(biāo)識(shí)某一類或某種特定微生物的存在[12]，是一類最常見的、有效的生物標(biāo)記物[17~19]。但是古生菌不能使用FAME譜圖進(jìn)行分析,因?yàn)樗臉O性脂質(zhì)是以醚而不是酯鍵的形式出現(xiàn)[13]。此外,磷脂不能作為細(xì)胞的貯存物質(zhì),一旦生物細(xì)胞死亡，其中的磷脂化合物就會(huì)馬上消失,因此，磷脂脂肪酸可以代表微生物群落中“存活”的那部分群體[14~16]。本研究應(yīng)用PLFAs法分析零排放豬舍基質(zhì)墊層微生物群落磷脂脂肪酸生物標(biāo)記特征,并結(jié)合Shannon-Wiener(H1)和Pielou均勻度(J)等測(cè)定方法,進(jìn)行微生物群落脂肪酸生物標(biāo)記總量的比較、微生物群落脂肪酸生物標(biāo)記的檢測(cè)和聚類分析、微生物群落脂肪酸生物標(biāo)記多樣性指數(shù)、基質(zhì)墊層微生物脂肪酸生物標(biāo)記特征指數(shù)B的分析，基質(zhì)墊層耗氧細(xì)菌和厭氧細(xì)菌脂肪酸生物標(biāo)記比值發(fā)酵指數(shù)F的分析，揭示養(yǎng)豬糞便排放過程，基質(zhì)墊層微生物變化的特點(diǎn)，從而了解微生物群落的變化，找出零排放豬舍基質(zhì)墊層糞便分解功能的微生物指標(biāo)，作為監(jiān)控零排放豬舍基質(zhì)墊層功能發(fā)揮的標(biāo)準(zhǔn)。1材料與方法1.1基質(zhì)墊層微生物群落取樣零排放豬舍基質(zhì)墊層微生物群落取樣于寧德地區(qū)農(nóng)科所養(yǎng)殖場(chǎng)，基質(zhì)墊層用日本洛東微生物菌種（福州洛東公司生產(chǎn)）和零排放I號(hào)菌種（研究者自行研制，凝結(jié)芽孢桿菌LPF#1菌株[BacilluscoagulansLPF#1]，菌種產(chǎn)品質(zhì)量10億/mL），兩個(gè)欄緊靠著，基質(zhì)墊層高度80cm，配方由谷殼49%、鋸末49%、鮮豬糞1%，米糠1%組成。用處理菌種兌水稀釋1000倍，加入基質(zhì)墊層攪拌，使基質(zhì)墊層水分保持在45%，堆制發(fā)酵10天，而后攤平養(yǎng)豬，一個(gè)墊層可以使用三年。為了解短期內(nèi)（1-2個(gè)月內(nèi)）基質(zhì)墊層內(nèi)微生物結(jié)構(gòu)差異，取樣分別在前者60和后者30天后進(jìn)行；取樣層分為第1層（0-20cm）、第2層（20-40cm）、第3層（40-60cm）、第4層（60-80cm）；取樣方法為五點(diǎn)取樣，每層的樣本充分混合后取出小樣進(jìn)行微生物群落脂肪酸生物標(biāo)記分析。1.2微生物群落脂肪酸生物標(biāo)記的檢測(cè)PLFAs的提取方法參考Frostegard[20]和Kourtev[21]略做修改。脂肪酸提取步驟：1）脂肪酸的釋放和甲酯化，取10g土基質(zhì)墊料樣于50mLl離心管中，加入20mLl0.2mol/L的KOH甲醇溶液，斡旋震蕩５min，并于37℃度水浴溫浴１h，每10min斡旋樣品一次。2）中和溶液pH值：加入3mLl溶1.0mol/L的醋酸溶液，充分搖勻。3）脂肪酸的萃?。杭尤?0mLl正已烷，充分搖勻，2000r離心15min，取上層正己烷相于干凈玻璃試管中，吹干，溶劑揮發(fā)。4）在玻璃試管中加入0.6mLl體積比為1:1的正已烷:甲基丁基醚溶液中，充分溶解３-５min，轉(zhuǎn)入GC樣品脂肪酸成份檢測(cè)及成份分析參照Margesin等[22]。脂肪酸成份檢測(cè)：用微生物自動(dòng)分析儀（SherlockMIS美國MIDI公司生產(chǎn)）分析微生物脂肪酸生物標(biāo)記，在下述氣相色譜條件下平行分析脂肪酸甲酯混合物標(biāo)樣和待檢樣本：二階程序升高柱溫，170℃起始，經(jīng)5℃/min升至260℃，而后經(jīng)40℃/min升至310℃，維持90S；汽化室溫度250℃；檢測(cè)器溫度300℃；載氣為H2(2mLl/min)，進(jìn)樣模式為分流進(jìn)樣，分流比為100:1；輔助氣：Air（350mLl/min），H2（30mLl/min）；尾吹氣為N2(30mLl/min)；柱前壓10l0.00psi(1Psi=6.895kPa)；進(jìn)樣量1lμLl。脂肪酸成份分析：系統(tǒng)根據(jù)各組分保留時(shí)間計(jì)算等鏈長(zhǎng)(ECl)值確定目標(biāo)組分的存在、采用峰面積歸一化法計(jì)算各組分的相對(duì)含量，再將二者與系統(tǒng)譜庫中的標(biāo)準(zhǔn)菌株數(shù)值匹配計(jì)算相似度(similarityindex1.3微生物群落脂肪酸生物標(biāo)記總量的比較將兩個(gè)微生物菌種處理的基質(zhì)墊層各層微生物脂肪酸生物標(biāo)記分別計(jì)算總和，以微生物脂肪酸生物標(biāo)記總和代表微生物群落總量，作圖比較不同菌種處理的基質(zhì)墊層各層微生物群落總量的變化，分析處理的效果。1.4微生物群落脂肪酸生物標(biāo)記的檢測(cè)將樣本微生物脂肪酸生物標(biāo)記（PLFAs）分析的結(jié)果，以處理層次為指標(biāo)，以脂肪酸生物標(biāo)記為樣本，構(gòu)建表格，總體分析各脂肪酸生物標(biāo)記（PLFAs）在各處理基質(zhì)墊層中的分布。1.5微生物群落脂肪酸生物標(biāo)記的聚類分析將樣本微生物脂肪酸生物標(biāo)記（PLFAs）分析的結(jié)果，以處理層次為指標(biāo)，以脂肪酸生物標(biāo)記為樣本，構(gòu)建矩陣，將數(shù)據(jù)進(jìn)行中心化處理，歐氏距離為聚類尺度，用類平均法對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行系統(tǒng)聚類，分析各類的特點(diǎn)。1.6微生物群落脂肪酸生物標(biāo)記多樣性指數(shù)引入群落生態(tài)學(xué)Pielou均勻度指數(shù)（JJ），對(duì)微生物群落脂肪酸生物標(biāo)記在不同處理各層次分布的均勻度進(jìn)行分析，均勻度指數(shù)越高，表明微生物脂肪酸生物標(biāo)記（PLFAs）在基質(zhì)墊層各層次分布的頻次較高、含量的分布較為均勻，其計(jì)算公式為：J=-∑PilnPi/lnS式中，Pi=Ni/N，Ni為處理i種脂肪酸生物標(biāo)記的含量，N為試驗(yàn)中脂肪酸生物標(biāo)記的總含量，S為脂肪酸生物標(biāo)記種類總數(shù)。引入群落生態(tài)學(xué)多樣性指數(shù)香農(nóng)-威納指數(shù)（H），對(duì)微生物群落脂肪酸生物標(biāo)記在不同處理各層次分布的多樣性指數(shù)進(jìn)行分析，多樣性指數(shù)高，表明微生物生物標(biāo)記（PLFAs）在基質(zhì)墊層各層次分布的總量較高，分布的格局較復(fù)雜，Shannon-Wiener多樣性指數(shù)（HH1）的計(jì)算公式為：HH=-∑PilnPi式中，式中，Pi=Ni/N，Ni為處理i種脂肪酸生物標(biāo)記的含量，N為試驗(yàn)中脂肪酸生物標(biāo)記的總含量。1.7不同基質(zhì)墊層特征微生物脂肪酸生物標(biāo)記特征指數(shù)（B）的分析選用微生物脂肪酸生物標(biāo)記16:00代表細(xì)菌數(shù)量[23]，18:3ω6c(6,9,12)代表真菌數(shù)量[23,24]，20:4ω6,9,12,15c代表原生生物數(shù)量[23]，TBSA10Me18:0代表放線菌數(shù)量[25]，構(gòu)建生物標(biāo)記特征指數(shù)，生物標(biāo)記特征指數(shù)（B）公式定義為：特征指數(shù)B越小，表明細(xì)菌和真菌的含量相對(duì)較少，比較分析基質(zhì)墊層各層次微生物分布的情況。1.8不同基質(zhì)墊層耗氧細(xì)菌和厭氧細(xì)菌脂肪酸生物標(biāo)記發(fā)酵指數(shù)（F）的分析選用微生物脂肪酸生物標(biāo)記i17:0代表耗氧細(xì)菌[24]，18:1ω7c代表厭氧細(xì)菌[26,27]，計(jì)算耗氧細(xì)菌/厭氧細(xì)菌的比例，構(gòu)建發(fā)酵指數(shù)F，公式定義為：分析基質(zhì)墊層各層次耗氧細(xì)菌和厭氧細(xì)菌分布的情況。當(dāng)發(fā)酵指數(shù)高時(shí)，表明耗氧細(xì)菌含量較高，發(fā)酵處于耗氧狀態(tài)，反之，發(fā)酵處于厭氧狀態(tài)。2結(jié)果2.1微生物群落脂肪酸生物標(biāo)記的比較試驗(yàn)結(jié)果見圖1。各生物標(biāo)記脂肪酸含量的總和代表著微生物的總量。日本洛東微生物菌種處理組和零排放I號(hào)菌種處理組各層微生物生物標(biāo)記脂肪酸含量的總量變化趨勢(shì)相近，兩個(gè)處理的第2層微生物含量最低，其余較高；日本洛東微生物菌種處理組第1層為268249、第2層為133483、第3層為270406、第4層為271520；零排放I號(hào)菌種處理組203721、第2層184572、第3層220481、第4層236522。前者的各層微生物脂肪酸生物標(biāo)記含量比后者略高，但差異不顯著（P<0.05），表明在短時(shí)間內(nèi)（時(shí)間間隔30天），各層微生物結(jié)構(gòu)具有一定的穩(wěn)定性。圖1不同微生物菌種處理組各層脂肪酸生物標(biāo)記總量變化Fig1.AmountsofPLFAsbiomarkerscontentinthefourlayerstromacushionofnon-pollutionpigstytreatedbytwostrains2.2微生物群落脂肪酸生物標(biāo)記在基質(zhì)墊層中的分布試驗(yàn)結(jié)果見表1。從不同微生物菌種處理組基質(zhì)墊層的不同層次中分析出37個(gè)脂肪酸生物標(biāo)記，指示著不同類群的微生物，包括細(xì)菌、真菌、放線菌、原生生物等。不同脂肪酸生物標(biāo)記在基質(zhì)墊層的各層次的分部有幾種類型：（1）生物標(biāo)記數(shù)量小，在各層中的分布不完全，如i11:03OH指示著耗氧細(xì)菌，數(shù)量在220以下，在洛東微生物菌種處理組僅分布在第2層（20-40cm）,其余層次沒有分布，零排放I號(hào)微生物菌種處理組分布在第一、二、三層次，第4層次沒有分布；（2）生物標(biāo)記數(shù)量小，在各層次的分布為完全分布，如12:00指示著細(xì)菌，數(shù)量在576-1329之間，在兩種微生物菌種處理的基質(zhì)墊層的各層完全分布；（3）生物標(biāo)記數(shù)量大，在各層次的分布不完全，如i17:03OH指示著耗氧細(xì)菌，數(shù)量在1854-10315之間，在洛東微生物菌種處理組各層次中僅在第二、三層中分布，零排放I號(hào)微生物菌種處理組各層次中在第一、三、四層中分布，第2層沒有分布；（4）生物標(biāo)記數(shù)量大，在各層次的分布為完全分布，如18:1ω9c指示著細(xì)菌，數(shù)量在31320-107126之間，在兩種微生物菌種處理的基質(zhì)墊層的各層完全分布。表1不同微生物菌種處理組脂肪酸生物標(biāo)記在各層的分布Table1DistributionofPLFAsbiomarkersinthefourlayerstromacushionofnon-pollutionpigstytreatedbytwostrains序號(hào)No.生物標(biāo)記Biomarker微生物類型Microbialgroup洛東微生物菌種處理組TreatedbyLUODONstrains零排放I號(hào)微生物菌種處理組TreatedbyLPF#1第1層Layer1第2層Layer2第3層Layer3第4層Layer4第1層Layer1第2層Layer2第3層Layer3第4層Layer41i11:0細(xì)菌Bacteriaingeneral02200014919313902i11:03OH革蘭氏陽性性細(xì)菌Gram-positivebacteria4410383036500609312:00細(xì)菌Bacteriaingeneral77970678157613291155957968412:03OH革蘭氏陽性性細(xì)菌Gram-positive578054704804215563685i13:0黃桿菌屬Flavobacterium42703660365263433303614:00細(xì)菌Bacteriaingeneral351817653231210535863519366434447i14:0耗氧細(xì)菌AerobesG+18266031439102114811314145012118a15:0細(xì)菌Bacteriaingeneral1451844839568451811092108101223592689i15:0細(xì)菌Bacteriaingeneral1547952261249484371277511449131801128810i15:03OH革蘭氏陰性細(xì)菌Gram-negativebacteria332152133011301256433312378259011i15:1G細(xì)菌Bacteriaingeneral1531013435184495315825481216:00假單胞桿菌Pseudomonassp.59261323786050066735512354835856178566151310Me16:0硫酸鹽還原細(xì)菌Sulfate-reducingbacteria9400275592319427000680314a16:0革蘭氏陽性性細(xì)菌Gram-positivebacteria10414369097435775101091114315i16:0革蘭氏陽性性細(xì)菌Gram-positivebacteria1031350678556528170816696788573871616:0Nalcohol細(xì)菌（莫拉菌屬M(fèi)oraxella）54406466104857385608681716:1ω5c甲烷氧化菌Methane-Oxidizingbacterial180601665198512320128721701816:1ω9c革蘭氏陰性細(xì)菌Gram-negativebacteria00102700075601917:00節(jié)桿菌屬Arthrobacter321317933058282028962778331232902010Me17:0放線菌Actinobacteria1252818117756550637854359321a17:0革蘭氏陽性性細(xì)菌Gram-positivebacteria7216246150272967485547535438471522cy17:0革蘭氏陰性細(xì)菌Gram-negativebacteria5972218548562938579942415849580123i17:0耗氧細(xì)菌Aerobes4989198644092745366639664032369524i17:03OH革蘭氏陰性細(xì)菌Gram-negativebacteria01854103150766406417110202517:1ω8c革蘭氏陰性細(xì)菌Gram-negativebacteria2375110423992779183914711813190826i17:1ω9c細(xì)菌Bacteriaingeneral000044925370511902718:00嗜熱解氫桿菌Hydrogenobacter92406890103538698782072718510869328i18:0革蘭氏陽性性細(xì)菌Gram-positivebacteria607827944850427151744367440863322910Me18:0放線菌Actinobacteria357212983231154124352342251841273011Me18:1ω7c纖維菌屬Cellulomonas477918246336002428040443118:1ω7c厭氧細(xì)菌Anaerobes1624767221677213758112921271312503113613218:1ω9c真菌Fungi531133555459259107126349823132040981507403318:3ω6c(6,9,12)真菌Fungi2252151230472010181716911916222234cy19:0ω8c伯克霍爾德菌Burkholderiacepacia114536137110001126482746601894777623520:00細(xì)菌Bacteriaingeneral146217341257115911771122138412033620:1ω9c嗜熱解氫桿菌Hydrogenobacter710129111471181738869003720:4ω6,9,12,15c原生動(dòng)物原生生物Protozoa95431366592624413050160334603433注：i、a、cy和Me分別表示異、反異、環(huán)丙基和甲基分枝脂肪酸；ω、c和t分別表示脂肪酸端、順式空間構(gòu)造和反式空間構(gòu)造。Note:i,a,cyandMerefertoiso,anteiso,cyclopropylandmethy1branchingfattyacids,respectively;ω、candtrefertothealiphaticend,cisconfigurationandtransconfiguration,respectively.2.3微生物群落脂肪酸生物標(biāo)記的聚類分析分析結(jié)果見圖2。當(dāng)λ=6.791時(shí)，可將基質(zhì)墊層的微生物脂肪酸生物標(biāo)記分為3類，類型Ⅰ中含有脂肪酸生物標(biāo)記a15:0（耗氧細(xì)菌）、18:00（細(xì)菌）、i15:0（耗氧細(xì)菌）、i16:0（耗氧細(xì)菌）、18:1ω7c（厭氧細(xì)菌）、16:00（細(xì)菌）和18:1ω9c（細(xì)菌真菌），其特征為生物標(biāo)記含量高，數(shù)量在67475-431260之間，同時(shí)在不同層次基質(zhì)墊層中皆為完全分布、微生物都是細(xì)菌；類型Ⅱ中含有脂肪酸生物標(biāo)記cy17:0、cy19:0ω8c、i17:03OH和11Me18:1ω7c，其特征是生物標(biāo)記含量中等，cy17:0和cy19:0ω8c兩種脂肪酸標(biāo)記在不同層次基質(zhì)墊層中完全分布，i17:03OH和11Me18:1ω7c兩種脂肪酸標(biāo)記在不同層次基質(zhì)墊層中不完全分布；類型ⅢⅢ為其余的脂肪酸生物標(biāo)記，數(shù)量差異較大，但都在60000以下，在基質(zhì)墊層中分布的形式多樣化，有完全分布和不完全分布，微生物中含有細(xì)菌、真菌、放線菌、原生生物等。圖2基質(zhì)墊層微生物群落脂肪酸生物標(biāo)記的聚類分析Fig.2ClusteranalysisofPLFAsbiomarkersforthemicrobialcommunityinthestromacushionofnon-pollutionpigsty2.4微生物群落脂肪酸生物標(biāo)記多樣性指數(shù)試驗(yàn)結(jié)果見表2?；|(zhì)墊層微生物群落脂肪酸生物標(biāo)記按照總數(shù)量的高低分成4個(gè)組，即高含量組（67475-431260）、中含量組（21064-58266）、低含量組（10145-19411）、小含量組（701-7251）；生物標(biāo)記的分布頻次從2~-8，表明生物標(biāo)記所指示的微生物在不同微生物處理組的各層次的分布差異；生物標(biāo)記的香農(nóng)-威納指數(shù)和均勻度指數(shù)出現(xiàn)兩種狀態(tài)，一種是香農(nóng)-威納指數(shù)高，均勻度指數(shù)也高，如a15:0的香農(nóng)-威納指數(shù)為2.9059，均勻度指數(shù)為0.9686，表明生物標(biāo)記所指示的微生物在基質(zhì)墊層的各層次數(shù)量分布多，同時(shí)均勻度好；另一種是香農(nóng)-威納指數(shù)低，均勻度指數(shù)高，如i17:1ω9c香農(nóng)-威納指數(shù)為1.5810，均勻度指數(shù)為0.9975，表明生物標(biāo)記所指示的微生物在基質(zhì)墊層的各層次數(shù)量分布較少，但均勻度較好。在高含量組中，各脂肪酸生物標(biāo)記在各層基質(zhì)墊層中為完全分布，所指示的微生物種類主要是細(xì)菌，包括了耗氧菌和厭氧菌；香農(nóng)-威納指數(shù)SHANNON(H)大于2.9581，表明各生物標(biāo)記分布的多樣性指數(shù)較高，所指示的微生物在各層中有較好的分布特點(diǎn)，均勻度大于0.9593，表明生物標(biāo)記分布的均勻度指數(shù)較高，所指示的微生物在各層中分布較為均勻。在中含量組中，各脂肪酸生物標(biāo)記在各層基質(zhì)墊層中有完全分布和不完全分布，所指示的微生物種類有細(xì)菌、放線菌和原生生物，香農(nóng)-威納指數(shù)SHANNON(H)在2.1543-2.9799之間，表明各生物標(biāo)記分布的多樣性指數(shù)較高，但不同的生物標(biāo)記間差異較大，所指示的微生物在各層中有較好的分布特點(diǎn)，均勻度大于0.9278，表明生物標(biāo)記分布的均勻度指數(shù)較高，所指示的微生物在各層中分布較為均勻；在低含量組中，各脂肪酸生物標(biāo)記在各層基質(zhì)墊層中有完全分布和不完全分布，所指示的微生物種類有細(xì)菌和真菌，香農(nóng)-威納指數(shù)SHANNON(H)在1.5810-2.9851之間，表明各生物標(biāo)記分布的多樣性指數(shù)較高，但不同的生物標(biāo)記間差異較大，所指示的微生物在各層中分布數(shù)量多少差異較大，均勻度大于0.9442，表明生物標(biāo)記分布的均勻度指數(shù)較高，所指示的微生物在各層中分布較為均勻；在小含量組中，各脂肪酸生物標(biāo)記在各層基質(zhì)墊層中有完全分布和不完全分布，所指示的微生物種類主要是細(xì)菌，香農(nóng)-威納指數(shù)SHANNON(H)在0.9833-2.9537之間，表明各生物標(biāo)記分布的多樣性指數(shù)差異較大，所指示的微生物在各層中分布數(shù)量多少差異較大，均勻度大于0.9931，表明生物標(biāo)記分布的均勻度指數(shù)較高，所指示的微生物在各層中分布較為均勻。表2基質(zhì)墊層微生物群落脂肪酸生物標(biāo)記多樣性指數(shù)Table2ThediversityindexofthePLFAsbiomarkersofthemicrobialcommunityinthestromacushionofnon-pollutionpigsty序號(hào)No.類型Type脂肪酸生物標(biāo)記PLFAsbiomarkers頻次Freq脂肪酸總量PLFAstotalvalueSHANNON(H)均勻度（J）Evenness(J)12生物標(biāo)記高含量組HighPLFAsvaluegroup16:0084312602.97470.99163218:1ω9c84130752.87800.95933118:1ω7c81013682.95810.98609i15:08903282.94510.98178a15:08764922.90590.968634cy19:0ω8c8714382.96440.98812718:008674752.98920.996415生物標(biāo)記中含量組MiddlingPLFAsvaluegroupi16:08582662.96540.988528i18:08382742.96400.988022cy17:08376412.93190.97731310Me16:05376162.22010.956121a17:08374322.93600.978724i17:03OH5372702.15430.92783720:4ω6,9,12,15c8308222.72900.909723i17:08294882.95580.9853614:008248322.96040.98681917:008231602.97990.99332910Me18:0TBSA8210642.91200.970730生物標(biāo)記低含量組LowPLFAsvaluegroup11Me18:1ω7c5194112.19230.944210i15:03OH8193072.86040.95353318:3ω6c(6,9,12)8164672.96870.98962517:1ω8c8156882.95060.983526i17:1ω9c3149811.58100.99753520:008104982.98510.99507i14:08103452.94550.98181716:1ω5c6101452.55480.98833生物標(biāo)記小含量組MinPLFAsvaluegroup12:00872512.95370.984614a16:0864502.92200.97403620:1ω9c659362.54660.98522010Me17:0858322.88230.960811i15:1G755022.62590.93541616:0Nalcohol744512.78220.9910412:03OH629502.56700.99315i13:0621572.56350.99172i11:03OH417981.96860.98431816:1ω9c217830.98330.98331i11:047011.97480.98742.5不同基質(zhì)墊層微生物脂肪酸生物標(biāo)記特征指數(shù)B的分析試驗(yàn)結(jié)果見表3。細(xì)菌用16:00代表，真菌用18:3ω6c(6,9,12)代表，原生動(dòng)物原生生物用20:4ω6,9,12,15c代表，放線菌用TBSA10Me18:0代表，分析結(jié)果表明，在不同微生物菌種處理的基質(zhì)墊層的不同層次中，細(xì)菌含量>原生生物>放線菌>真菌。從細(xì)菌指示生物標(biāo)記看，不同微生物菌種處理組中，第3層≌第4層>第1層>第2層。不同的微生物指示生物標(biāo)記在各層的分布存在顯著差異。生物標(biāo)記特征指數(shù)B分析結(jié)果表明，在洛東微生物菌種處理組中，特征指數(shù)B的大小順序?yàn)椋旱?層>第3層>第4層>第1層，在零排放I號(hào)微生物菌種處理組中，特征指數(shù)B的大小順序?yàn)椋旱?層>第3層>第2層>第4層；特征指數(shù)B越大，表明指示細(xì)菌和真菌的生物標(biāo)記含量越高。表3基質(zhì)墊層特征微生物群落脂肪酸生物標(biāo)記含量的比較Table3PLFAsbiomarkscontentoftherepresentativemicrobialcommunityinthestromacushionofnon-pollutionpigsty脂肪酸生物標(biāo)記PLFAsbiomarks微生物種類型Microbialgroup洛東微生物菌種處理組TreatedbyLUODONstrains零排放I號(hào)微生物菌種處理組TreatedbyLPF#1第1層Layer1第2層Layer2第3層Layer3第4層Layer4第1層Layer1第2層Layer2第3層Layer3第4層Layer416:00細(xì)菌Bacteriaingeneral592613237860500667355123548358561785661518:3ω6c(6,9,12)真菌Fungi2252151230472010181716911916222220:4ω6,9,12,15c原生動(dòng)物Protozoa95431366592624413050160334603433TBSA10Me18:0放線菌Actinomycetes35721298323115412435234225184127生物標(biāo)記特征指數(shù)BPLFAsbiomarkscharacteristicindexB3.965027.61069.62787.005612.534911.010612.35468.87902.6不同基質(zhì)墊層耗氧細(xì)菌和厭氧細(xì)菌脂肪酸生物標(biāo)記發(fā)酵指數(shù)F的分析試驗(yàn)結(jié)果見表4和圖3。從表4可知，不同處理方法的基質(zhì)墊層耗氧細(xì)菌和厭氧細(xì)菌脂肪酸生物標(biāo)記在個(gè)各層次的分布差異顯著，總體上厭氧細(xì)菌指示生物標(biāo)記數(shù)量大于耗氧細(xì)菌。洛東微生物菌種處理組處理的時(shí)間較久大約兩個(gè)月，零排放I號(hào)微生物菌種處理組時(shí)間較短僅一個(gè)月，從總體上看，不同微生物處理方法相應(yīng)層次，時(shí)間長(zhǎng)的指示細(xì)菌生物標(biāo)記含量比時(shí)間短的來的略高，如洛東微生物菌種處理組細(xì)菌生物標(biāo)記總量第1層為21236、第2層為8708、第3層為21181、第4層為16503，零排放I號(hào)微生物菌種處理組細(xì)菌生物標(biāo)記總量第1層為14958、第2層為16679、第3層為16535、第4層為15056。表4不同基質(zhì)墊層耗氧細(xì)菌和厭氧細(xì)菌脂肪酸生物標(biāo)記的比例Table4TheproportionofaerobicbacteriumPLFAsandanaerobicbacteriumPLFAsindifferentstromacushion脂肪酸生物標(biāo)記PLFAsbiomarks洛東微生物菌種處理組TreatedbyLUODONstrain零排放I號(hào)微生物菌種處理組TreatedbyLPF#1strain第1層Layer1第2層Layer2第3層Layer3第4層Layer4第1層Layer1第2層Layer2第3層Layer3第4層Layer4i17:0耗氧細(xì)菌i17:0Aerobes4989198644092745366639664032369518:1ω7c厭氧細(xì)菌18:1ω7cAnaerobes162476722167721375811292127131250311361細(xì)菌生物標(biāo)記總量PLFAstotalvalue212368708211811650314958166791653515056發(fā)酵指數(shù)F表明了耗氧細(xì)菌和厭氧細(xì)菌的比例，發(fā)酵指數(shù)越大，耗氧菌含量越多，厭氧發(fā)酵的水平較低。從發(fā)酵指數(shù)F的變化看，不同的處理時(shí)間，發(fā)酵指數(shù)F變化規(guī)律不同，發(fā)酵時(shí)間長(zhǎng)的，發(fā)酵指數(shù)F隨著層次的增加而減小，發(fā)酵時(shí)間短的，發(fā)酵指數(shù)F的變化不明顯。各層洛東微生物菌種處理組處理的時(shí)間較長(zhǎng)約兩個(gè)月，發(fā)酵指數(shù)F隨著層次的增加而下降，第1層為0.3070、第2層為0.2954、第3層為0.2628、第4層為0.1995，零排放I號(hào)微生物菌種處理組處理的時(shí)間較短約一個(gè)月，發(fā)酵指數(shù)F在第1-2層次中與前者相比較變化不大（P>0.05），第1層為0.3246,第2層為0.3119；在第3-4層與前者相比有較大差異（P<0.05），第3層為0.3224，,第4層為0.3252，表明相差30天，洛東微生物菌種處理組在基質(zhì)墊層第3-4層厭氧細(xì)菌含量高于零排放I號(hào)微生物菌種處理組。圖3不同微生物菌種處理組發(fā)酵指數(shù)F的變化Fig3Changeoffermentationindex(F)withtwodifferentstraintstreating3討論零排放豬舍基質(zhì)墊層微生物群落脂肪酸生物標(biāo)記多樣性分析，從微生物群落脂肪酸生物標(biāo)記總量的比較、微生物群落脂肪酸生物標(biāo)記的檢測(cè)和聚類分析、微生物群落脂肪酸生物標(biāo)記多樣性指數(shù)、基質(zhì)墊層微生物脂肪酸生物標(biāo)記特征指數(shù)B的分析，基質(zhì)墊層耗氧細(xì)菌和厭氧細(xì)菌脂肪酸生物標(biāo)記發(fā)酵指數(shù)F的分析，揭示養(yǎng)豬糞便排放過程，基質(zhì)墊層微生物變化的特點(diǎn)，從而了解微生物群落的變化，找出零排放豬舍基質(zhì)墊層糞便分解功能的微生物指標(biāo)，作為監(jiān)控零排放豬舍基質(zhì)墊層功能發(fā)揮的指標(biāo)。盡管零排放豬舍基質(zhì)墊層的研究很多，但是，采用脂肪酸生物標(biāo)記研究微生物群落的未見報(bào)道。研究結(jié)果表明，用微生物脂肪酸生物標(biāo)記，分析零排放豬舍基質(zhì)墊層微生物群落變化規(guī)律，方法可行，指標(biāo)靈敏。從試驗(yàn)采用的兩種微生物菌種處理組看，除了時(shí)間差異造成的微生物群落的差異，其他差異不大，兩個(gè)菌種都能很好地發(fā)揮零排放豬舍基質(zhì)墊層分解糞便排泄物的功能。通過微生物群落脂肪酸生物標(biāo)記總量的比較，表征了基質(zhì)墊層微生物脂肪酸生物標(biāo)記數(shù)量變化；通過微生物群落脂肪酸生物標(biāo)記的檢測(cè)和聚類分析，檢測(cè)到微生物脂肪酸生物標(biāo)記37種，代表了不同類型的微生物，有細(xì)菌、真菌、放線菌和原生動(dòng)物原生生物；聚類分析結(jié)果將具有完全分布特性的，同時(shí)含量高的生物標(biāo)記聚成一類，他們成為分解糞便排泄物的主要微生物的指示生物標(biāo)記。通過微生物群落脂肪酸生物標(biāo)記多樣性指數(shù)的分析，可以看到不同的微生物生物標(biāo)記，在基質(zhì)墊層不同層次分布的多樣性不同，提示了不同的微生物在不同的時(shí)間和層次內(nèi)發(fā)揮的作用不同，可作為衡量特定微生物生物標(biāo)記功能的一個(gè)指標(biāo)；通過基質(zhì)墊層微生物脂肪酸生物標(biāo)記特征指數(shù)B的分析，提出了微生物群落分布的特征指標(biāo)，生物標(biāo)記特征指數(shù)越高，表明微生物群落中的細(xì)菌和真菌含量越高，有利于基質(zhì)墊層分解糞便排泄物，可作為基質(zhì)墊層微生物群落變化優(yōu)劣的特征性指標(biāo)；糞便排泄物的微生物分解過程包含著耗氧和厭氧發(fā)酵過程，通過基質(zhì)墊層耗氧細(xì)菌和厭氧細(xì)菌脂肪酸生物標(biāo)記發(fā)酵指數(shù)F的分析，揭示了基質(zhì)墊層發(fā)酵特性，發(fā)酵指數(shù)F越高，表明耗氧細(xì)菌起的作用越大，厭氧細(xì)菌越小，反之，發(fā)酵指數(shù)F越小，厭氧細(xì)菌起的作用越大，耗氧細(xì)菌起的作用越小，生物標(biāo)記的發(fā)酵指數(shù)可以作為研究糞便排泄物的微生物分解過程的指數(shù)。微生物脂肪酸生物標(biāo)記，指示著微生物群落，不同的微生物種類可以有不同的生物標(biāo)記，相同的微生物種類的不同種下分類階元也有不同的生物標(biāo)記，同一個(gè)生物標(biāo)記，可以存在不同的微生物中，一組微生物脂肪酸生物標(biāo)記，相當(dāng)于微生物群落的指紋圖譜而相互區(qū)別[28,29]。本研究提供了零排放豬舍基質(zhì)墊層微生物群落的分析手段，關(guān)于零排放豬舍基質(zhì)墊層生物標(biāo)記多樣性、生物標(biāo)記特征指數(shù)B、生物標(biāo)記發(fā)酵指數(shù)F的變化規(guī)律，有待于進(jìn)一步研究。不同微生物的脂肪酸在組成和含量上有較大差異，它和微生物的遺傳變異、耐藥性等有極為密切的關(guān)系。大多數(shù)革蘭氏陽性菌（G+）中支鏈C15:0脂肪酸豐度很高[30]，而在大多數(shù)革蘭氏陰性菌（G一）菌中C16:0豐度較高。一些細(xì)菌如考克斯氏體屬、土拉弗朗西絲菌屬、假單孢菌屬和結(jié)核分枝桿菌屬細(xì)菌有其特殊的脂類，可經(jīng)磷脂脂肪酸分析實(shí)現(xiàn)鑒定。短鏈脂肪酸已經(jīng)用于陸源厭氧細(xì)菌的鑒定[31]。Dubey等成功的測(cè)定了分枝桿菌屬4株菌的脂肪酸，確定其主要由16種脂肪酸組成，并分析了它們之間的差異[32]。根據(jù)微生物細(xì)胞脂肪酸的組成，一般可通過單次實(shí)驗(yàn)比較準(zhǔn)確的將微生物鑒定到種，但是脂肪酸是一種可隨著培養(yǎng)條件變化而發(fā)生改變的細(xì)胞組分，并且氣相色譜、質(zhì)譜等是高精密度的分析儀器，因此，分析過程的條件選擇和質(zhì)量控制則顯得非常重要，必須對(duì)培養(yǎng)基成分、微生物培養(yǎng)條件、微生物純化、菌齡、色譜條件等實(shí)驗(yàn)條件進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)化，否則會(huì)嚴(yán)重影響方法的準(zhǔn)確度和重復(fù)性[33]。目前已有一種商業(yè)化的微生物FAME氣相色譜分析系統(tǒng)，即SherlockMIS微生物鑒定系統(tǒng)(美國MIDI公司開發(fā))，SherlockMIS微生物鑒定系統(tǒng)從微生物的培養(yǎng)、菌落的收集、微生物細(xì)胞皂化釋放脂肪酸、脂肪酸甲基化、脂肪酸甲酯的萃取和洗滌，到最后的鑒定、結(jié)果的判斷都有一套完整的標(biāo)準(zhǔn)化程序，可以避免上述不利條件的影響。SherlockMIS微生物鑒定系統(tǒng)具有分析周期短、操作簡(jiǎn)單、準(zhǔn)確度高等優(yōu)點(diǎn)，目前國內(nèi)外已有將SherlockMIS應(yīng)用于微生物鑒定和脂肪酸生物標(biāo)記研究的文獻(xiàn)報(bào)道[31，32]。4結(jié)論(1)用微生物群落脂肪酸生物標(biāo)記總量，分析零排放豬舍基質(zhì)墊層微生物群落的數(shù)量變化，思路可行，方法簡(jiǎn)便，可靠性高。(2)基質(zhì)墊層微生物群落脂肪酸生物標(biāo)記檢測(cè)出37個(gè)生物標(biāo)記，構(gòu)成微生物群落的指紋圖譜，不同的生物標(biāo)記多樣性指數(shù)在基質(zhì)墊層不同層次分布的多樣性指數(shù)不同，可作為衡量特定微生物生物標(biāo)記功能的一個(gè)指標(biāo)。(3)通過基質(zhì)墊層微生物脂肪酸生物標(biāo)記特征指數(shù)B的分析，提出了微生物群落分布的特征指標(biāo)，生物標(biāo)記特征指數(shù)B越高，表明微生物群落中的細(xì)菌和真菌含量越高，有利于基質(zhì)墊層分解糞便排泄物，可作為基質(zhì)墊層微生物群落變化優(yōu)劣的特征性指標(biāo)，(4)通過基質(zhì)墊層耗氧細(xì)菌和厭氧細(xì)菌脂肪酸生物標(biāo)記發(fā)酵指數(shù)F的分析，揭示了基質(zhì)墊層發(fā)酵特性，發(fā)酵指數(shù)F越高，表明耗氧細(xì)菌起的作用越大，厭氧細(xì)菌越小，反之，發(fā)酵指數(shù)F越小，厭氧細(xì)菌起的作用越大，耗氧細(xì)菌起的作用越小，生物標(biāo)記的發(fā)酵指數(shù)可以作為研究糞便排泄物的微生物分解過程的指數(shù)。References:[1]ZhangHX,WangXY,QiH,etal.Developmentinresearchmethodsofmicrobialecology,ActaEcologicaSinica,2003,23(5):988~995.[1]張洪勛，王曉誼，齊鴻雁，等.微物物生態(tài)學(xué)研究方法進(jìn)展[J].生態(tài)學(xué)報(bào)，2003，23（5）：988-995.[2]TunlidA,WhiteDC.Biochemicalanalysisofbiomass,communitystructure,nutritionalstatus,andmetabolicactivityofmicrobialcommunityinsoil.In:StotzkyG,BollagJMeds.Soilbiochemistry.NewYork:Dekker,1991..229~-262.[3]WhiteDC,DavisWM,NickelsJS,etal.Deteminationofthesedimentarymicrobialbiomassbyextractiblelipidphosphate[J].Oecologia,1979,40:51-~62[4]MedeirosPM,FemandesMF,DickRP,etal.Seasonalvariationsinsugarcontentsandmicrobialcommunityinaryegrasssoil[J].Chemosphere,2006,65(5):832-~839.[5]HacklE,PfefferM,DonatC,etal.Compositionofthemicrobialcommunitiesinthemineralsoilunderdifferenttypesofnaturalforest[J].SoilBiology＆Biochemistry,2005,37(4):661-~671.[6]PuglisiE,NicelliM,CapriE,etal.Asoilalterationindexbasedonphospholipidsfattyacid[J].Chemosphere,2005,6(11):1548-~1557.[7]SyaktiAD,MazzellaN,NeriniD,etal.Phospholipidfattyacidofamarinesedimentarymicrobialcommunityinalaboratorymicrocosm:responsetopetroleumhydrocarboncontamination[J].OrganicGeochemistry,2006,37(11):1617-~1628.[8]VanderGheynstJS,LeiF.Microbialcommunitystructuredynamicsduringaeratedandmixedcomposting[J].TransactionsoftheASAE,2003,46(2):577~-584.[9]VestalJR,WhiteDC.Lipidanalysisinmicrobialecoloy:Quantitativeapproachestothestudyofmicrobialcommunities.Bioscience,1989,39:535-~541.[10]LiuBR,JiaGM,ChenJ,etal.Areviewofmethodsforstudingmicrobialdiversityinsoils.Pedosphere,2006,16(1):18-~24.[11]JenniferM,Fraterrigo,TeriC,etal.Microbialcommunityvariationanditsrelationshipwithnitrogenmineralizationinhistoricallyalteredforests.Ecology,2006,87(3):570-~579.[12]StegerK,JarvisA,Sm?rsS,etal.Comparisonofsignaturelipidmethodstodeterminemicrobialcommunitystructureincompost.JournalofMicrobiologicalMethods,2003,55(2):371-~82.[13]MasoodA,StarkKD,SalemNJr,etal.Asimplifiedandefficientmethodfortheanalysisoffattyacidmethylesterssuitableforlargeclinicalstudies.JLipidRes,2005,46(10):2299-~305.[14]WebsterG.,WattLC,RinnaJ,etal.Acomparisonofstable-isotopeprobingofDNAandphospholipidfattyacidstostudyprokaryoticfunctionaldiversityinsulfate-reducingmarinesedimentenrichmentslurries.EnvironmentalMicrobiology,2006,8(9):1575-~89.[15]NeufeldJD,DumontM,VohraJ,etal.Methodologicalconsiderationsfortheuseofstableisotopeprobinginmicrobialecology.MicrobialEcology,2007,53(3):435-~42.[16]WindingA,Hund-RinkeK,RutgersM.Theuseofmicroorganismsinecologicalsoilclassificationandassessmentconcepts.EcotoxicologyandEnvironmentalSafety,2005,62(2):230-~48.[17]PonderFJr,TadrosM.Phospholipidfattyacidsinforestsoilfouryearsafterorganicmatterremovalandsoilcompaction.AppliedsoilEcology,20022002,19:173-182.[18]ZellesL.Faattyacidpatternsofphospholipidsandlipopolysaccharidesinthecharacterizationofmicrobialcommunitiesinsoil:Areview.BiologyFertilityofSoils,1999,29:111-~129.[19]Tornema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