蛋白質(zhì)的化學(xué)優(yōu)秀公開課

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SchoolPharmacyofYantaiUniversity第二章蛋白質(zhì)的化學(xué)蛋白質(zhì)(protein):是由許多不同的α-氨基酸按一定的序列通過酰胺鍵(肽鍵)縮合而成的,具有較穩(wěn)定的構(gòu)象和一定生物功能的大分子.

蛋白質(zhì)存在于所有的生物細(xì)胞中,是構(gòu)成生物體最基本的結(jié)構(gòu)物質(zhì)和功能物質(zhì).第一節(jié)蛋白質(zhì)簡(jiǎn)介1*煙臺(tái)大學(xué)藥學(xué)院

SchoolPharmacyofYantaiUniversity1.蛋白質(zhì)的分布:蛋白質(zhì)是細(xì)胞中含量最豐富的高分子有機(jī)化合物.

占人體總干重的45%,細(xì)菌占50-80%,

干酵母47%,高等植物大豆含40%2*煙臺(tái)大學(xué)藥學(xué)院

SchoolPharmacyofYantaiUniversity2.蛋白質(zhì)根據(jù)分子形狀分類

1）球狀蛋白：不對(duì)稱常數(shù)接近1，功能蛋白

2）纖維狀蛋白：不對(duì)稱常數(shù)大于10,結(jié)構(gòu)蛋白3）橢圓形：對(duì)稱常數(shù)介于中間3.蛋白質(zhì)分子的大小蛋白質(zhì)是分子量很大的生物分子,相對(duì)分子質(zhì)量一般大于1×104.最高可達(dá)4×107(煙草花葉病毒)．變化范圍非常大.3*煙臺(tái)大學(xué)藥學(xué)院

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5.蛋白質(zhì)的元素組成

蛋白質(zhì)是一類含氮有機(jī)化合物.某些蛋白質(zhì)還含有微量元素,主要是P、Fe、Cu、Zn、I等.5*煙臺(tái)大學(xué)藥學(xué)院

SchoolPharmacyofYantaiUniversityN的含量平均為16%：凱氏(Kjadehl)定氮法的理論基礎(chǔ)蛋白質(zhì)的含量=蛋白質(zhì)的含氮量×100/16=蛋白質(zhì)的含氮量×6.256*煙臺(tái)大學(xué)藥學(xué)院

SchoolPharmacyofYantaiUniversity第二節(jié)蛋白質(zhì)的分子結(jié)構(gòu)蛋白質(zhì)的分子結(jié)構(gòu)分為一級(jí)結(jié)構(gòu)和空間結(jié)構(gòu)(二、三、四級(jí)結(jié)構(gòu)).一蛋白質(zhì)的一級(jí)結(jié)構(gòu)(primarystructure)指蛋白質(zhì)分子中氨基酸殘基的種類、數(shù)量及排列順序.包含的共價(jià)鍵主要指肽鍵和二硫鍵(disulfidebond).7蛋白質(zhì)一級(jí)結(jié)構(gòu)數(shù)據(jù)數(shù)量眾多，形成各種蛋白質(zhì)一級(jí)結(jié)構(gòu)數(shù)據(jù)庫(kù)：Genbank，EMBL，PIR等蛋白質(zhì)一級(jí)結(jié)構(gòu)是其高級(jí)結(jié)構(gòu)和生物學(xué)功能的基礎(chǔ)，但并不是決定高級(jí)構(gòu)象的唯一因素.*煙臺(tái)大學(xué)藥學(xué)院

SchoolPharmacyofYantaiUniversity9*煙臺(tái)大學(xué)藥學(xué)院

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二、蛋白質(zhì)一級(jí)結(jié)構(gòu)測(cè)定的原理一級(jí)結(jié)構(gòu)測(cè)定目的:知道氨基酸的組成和排列順序10*煙臺(tái)大學(xué)藥學(xué)院

SchoolPharmacyofYantaiUniversity一級(jí)結(jié)構(gòu)確定的原則：將大化小,逐段分析,制成兩套肽片段,找出重疊位點(diǎn),排出肽的前后位置,最后確定蛋白質(zhì)的完整序列.

1.測(cè)定蛋白質(zhì)的一級(jí)結(jié)構(gòu)的要求：

a)樣品必需純(>97%以上)b)知道蛋白質(zhì)的分子量

c)知道蛋白質(zhì)由幾個(gè)亞基組成

d）知道氨基酸組成11*煙臺(tái)大學(xué)藥學(xué)院

SchoolPharmacyofYantaiUniversity③二硫鍵的斷裂:幾條多肽鏈通過二硫鍵交聯(lián)在一起.可在變性條件下,用過量的-巰基乙醇處理,使二硫鍵還原為巰基,然后用烷基化試劑保護(hù)生成的巰基,防止重新被氧化.也可用過甲酸氧化法拆分多肽鏈間的二硫鍵.

④測(cè)定每條多肽鏈的氨基酸組成13*煙臺(tái)大學(xué)藥學(xué)院

SchoolPharmacyofYantaiUniversity2.1N-末端氨基酸的分析(1)二硝基氟苯法(DNFB)分離DNP-氨基酸，用紙層析、HPLC進(jìn)行分析該方法已過時(shí)首先由Sanger應(yīng)用，確定了胰島素的一級(jí)結(jié)構(gòu)14*煙臺(tái)大學(xué)藥學(xué)院

SchoolPharmacyofYantaiUniversity(2)丹磺酰氯法(DNS-Cl):此法優(yōu)點(diǎn),丹磺酰-氨基酸有很強(qiáng)的熒光性質(zhì)，檢測(cè)靈敏度比DNFB高100倍，產(chǎn)物不必提取直接分析15*煙臺(tái)大學(xué)藥學(xué)院

SchoolPharmacyofYantaiUniversity(4)氨肽酶法：一種肽鏈外切酶.根據(jù)不同的反應(yīng)時(shí)間測(cè)出酶水解所釋放出的氨基酸種類和數(shù)量,按反應(yīng)時(shí)間和氨基酸殘基釋放量作動(dòng)力學(xué)曲線,從而知道蛋白質(zhì)的N-末端殘基順序.最常用：亮氨酸氨肽酶，水解以亮氨酸殘基為N-末端的肽鍵速度最大.17*煙臺(tái)大學(xué)藥學(xué)院

SchoolPharmacyofYantaiUniversity2.2C-末端氨基酸的分析羧肽酶法：羧肽酶是一種肽鏈C-端外切酶，目前常用的羧肽酶：A,B,C和Y.羧肽酶A：釋放除Pro，Arg和Lys之外的所有C末端氨基酸，更易于水解具有芳香族側(cè)鏈和大脂肪側(cè)鏈的羧基端氨基酸羧肽酶B：主要水解堿性氨基酸形成的羧基末端。羧肽酶C：水解C端倒數(shù)第二位由Pro形成的的肽鍵羧肽酶Y：它能作用于任何一個(gè)C-末端殘基18*煙臺(tái)大學(xué)藥學(xué)院

SchoolPharmacyofYantaiUniversity(2)肼解法:也稱聯(lián)氨法.多肽與肼在無水條件下加熱,C-端氨基酸即從肽鏈上解離出來,其余的氨基酸則變成肼化物.肼化物能夠與苯甲醛縮合成不溶于水的物質(zhì)而與C-端氨基酸分離.19*煙臺(tái)大學(xué)藥學(xué)院

SchoolPharmacyofYantaiUniversity21*煙臺(tái)大學(xué)藥學(xué)院

SchoolPharmacyofYantaiUniversity利用重疊肽確定肽段在多肽鏈中的次序：利用兩套或多套肽段的氨基酸順序彼此間的交錯(cuò)重疊,拼湊出整條多肽鏈的氨基酸順序.方法1：Thr-Ser-ProCys-Met-Gly-Ile-LeuArg-Asp-LysAla-Gly-Gln-Glu

方法2：Lys-Ala-GlyGln-Glu-CysMet-Gly-Ile-Leu

Thr-Ser-Pro-Arg-Asp

總序列：Thr-Ser-Pro-Arg-Asp-Lys-Ala-Gly-Gln-Glu-Cys-Met-Gly-Ile-Leu22*煙臺(tái)大學(xué)藥學(xué)院

SchoolPharmacyofYantaiUniversity4.二硫鍵位置的確定23*煙臺(tái)大學(xué)藥學(xué)院

SchoolPharmacyofYantaiUniversity二蛋白質(zhì)的構(gòu)象(conformation)

蛋白質(zhì)的一級(jí)結(jié)構(gòu)不具有功能,只有形成正確的結(jié)構(gòu)才具有功能.

二級(jí)結(jié)構(gòu)以上的結(jié)構(gòu)叫高級(jí)結(jié)構(gòu),高級(jí)結(jié)構(gòu)是指各原子或基團(tuán)在空間上的分布,所以又叫空間結(jié)構(gòu),或三維結(jié)構(gòu)可分為:二級(jí)結(jié)構(gòu),三級(jí)結(jié)構(gòu),四級(jí)結(jié)構(gòu)25*煙臺(tái)大學(xué)藥學(xué)院

SchoolPharmacyofYantaiUniversity(一)蛋白質(zhì)的二級(jí)結(jié)構(gòu)(secondarystructure)蛋白質(zhì)的二級(jí)結(jié)構(gòu)是指肽鏈的主鏈在空間的排列,或規(guī)則的幾何走向、旋轉(zhuǎn)及折疊.只涉及肽鏈主鏈的構(gòu)象及鏈內(nèi)或鏈間形成的氫鍵.主要有-螺旋、-折疊、-轉(zhuǎn)角.26*煙臺(tái)大學(xué)藥學(xué)院

SchoolPharmacyofYantaiUniversity影響α-螺旋穩(wěn)定性的因素：在多肽鏈中連續(xù)的出現(xiàn)帶同種電荷的極性氨基酸，阻止氫鍵形成，α-螺旋就不穩(wěn)定Pro的N上缺少H，不能形成氫鍵，它改變多肽鏈的方向并終止螺旋Gly的R基太小，難以形成α-螺旋所需的兩面角，也是螺旋的最大破壞者肽鏈中連續(xù)出現(xiàn)帶龐大側(cè)鏈的氨基酸如Ile，由于空間位阻，也難以形成α-螺旋pH的影響29*煙臺(tái)大學(xué)藥學(xué)院

SchoolPharmacyofYantaiUniversity（4條α-螺旋）原纖維微原纖維巨原纖維紡錘體型皮質(zhì)細(xì)胞角質(zhì)膜皮質(zhì)髓質(zhì)頭發(fā)頭發(fā)結(jié)構(gòu)燙發(fā)的生物化學(xué)過程30*煙臺(tái)大學(xué)藥學(xué)院

SchoolPharmacyofYantaiUniversity2.β-折疊(β-pleatedsheet)-折疊是由兩條或多條幾乎完全伸展的肽鏈平行排列,通過鏈間氫鍵交聯(lián)形成.肽鏈的主鏈呈鋸齒狀折疊構(gòu)象.31*煙臺(tái)大學(xué)藥學(xué)院

SchoolPharmacyofYantaiUniversity-折疊的結(jié)構(gòu)要點(diǎn)：肽鍵平面呈鋸齒狀排列,側(cè)鏈Ｒ基團(tuán)交錯(cuò)分布在片層平面的兩側(cè)由鏈間氫鍵維持穩(wěn)定.其方向與折疊的長(zhǎng)軸接近垂直.有兩種類型:平行式,即所有肽鏈的N-端都在同一邊:反平行式,即相鄰肽鏈的方向相反每一個(gè)氨基酸在主軸上所占的距離,平行的是0.325nm,反平行的是0.35nm.反平行式更穩(wěn)定.32*煙臺(tái)大學(xué)藥學(xué)院

SchoolPharmacyofYantaiUniversity3.-轉(zhuǎn)角(β-turn)也稱-回折或發(fā)夾結(jié)構(gòu)，存在于球狀蛋白中在-轉(zhuǎn)角部分，由四個(gè)氨基酸殘基組成彎曲處的第一個(gè)氨基酸殘基的-C=O和第四個(gè)殘基的–N-H之間形成氫鍵，維持構(gòu)象.經(jīng)常出現(xiàn)在連接反平行β-折疊片的端頭.33*煙臺(tái)大學(xué)藥學(xué)院

SchoolPharmacyofYantaiUniversity4.無規(guī)卷曲(randomcoil)

自由回轉(zhuǎn)

無規(guī)律的松散肽鏈結(jié)構(gòu).常常是酶的活性部位34*煙臺(tái)大學(xué)藥學(xué)院

SchoolPharmacyofYantaiUniversity5.Ω環(huán)新發(fā)現(xiàn)的一種二級(jí)結(jié)構(gòu),形狀象希臘字Ω.這種結(jié)構(gòu)總是出現(xiàn)在蛋白質(zhì)分子的表面,在分子識(shí)別中可能起重要作用.35*煙臺(tái)大學(xué)藥學(xué)院

SchoolPharmacyofYantaiUniversity36*煙臺(tái)大學(xué)藥學(xué)院

SchoolPharmacyofYantaiUniversity(二)超二級(jí)結(jié)構(gòu)指二級(jí)結(jié)構(gòu)的基本結(jié)構(gòu)單位(α-螺旋,β-折疊等)相互聚集,形成有規(guī)律的在空間上能辨認(rèn)的聚集體.是氨基酸側(cè)鏈相互作用的結(jié)果.已知的超二級(jí)結(jié)構(gòu)主要有αα,βαβ,β-曲折和β-折疊筒等.超二級(jí)結(jié)構(gòu)在結(jié)構(gòu)層次上高于二級(jí)結(jié)構(gòu)，但沒有聚集成具有功能的結(jié)構(gòu)域．又稱基序或模塊（motifs）37*煙臺(tái)大學(xué)藥學(xué)院

SchoolPharmacyofYantaiUniversity38*煙臺(tái)大學(xué)藥學(xué)院

SchoolPharmacyofYantaiUniversity(三)結(jié)構(gòu)域(structuraldomain)

多肽鏈在超二級(jí)結(jié)構(gòu)的基礎(chǔ)上進(jìn)一步繞曲折疊成緊密的近似球形的結(jié)構(gòu),具有部分生物功能.

是球狀蛋白質(zhì)的折疊單位.39*煙臺(tái)大學(xué)藥學(xué)院

SchoolPharmacyofYantaiUniversity40*煙臺(tái)大學(xué)藥學(xué)院

SchoolPharmacyofYantaiUniversity結(jié)構(gòu)域一般由100-200個(gè)aa組成,氨基酸可以連續(xù),也可以不連續(xù)．結(jié)構(gòu)域之間常形成裂隙,比較松散,往往是蛋白質(zhì)優(yōu)先被水解的部位.酶的活性中心往往位于兩個(gè)結(jié)構(gòu)域的界面上．可作為結(jié)構(gòu)單位進(jìn)行相對(duì)獨(dú)立的運(yùn)動(dòng),水解后仍能維持穩(wěn)定的結(jié)構(gòu),甚至保留某些生物活性．對(duì)于較小的蛋白質(zhì)分子,結(jié)構(gòu)域與三級(jí)結(jié)構(gòu)等同,即這些蛋白為單結(jié)構(gòu)域.結(jié)構(gòu)域有時(shí)也稱功能域,功能域是指有功能的部分.功能域可以是一個(gè)結(jié)構(gòu)域,也可以是兩個(gè)或兩個(gè)以上的結(jié)構(gòu)域組成.41*煙臺(tái)大學(xué)藥學(xué)院

SchoolPharmacyofYantaiUniversity(四)三級(jí)結(jié)構(gòu)(tertiarystructure)指多肽鏈在二級(jí)結(jié)構(gòu)的基礎(chǔ)上進(jìn)一步盤旋、折疊,從而生成特定的空間結(jié)構(gòu).包括主鏈和側(cè)鏈的所有原子的空間排布．一般非極性側(cè)鏈埋在分子內(nèi)部,形成疏水核，極性側(cè)鏈在分子表面．42*煙臺(tái)大學(xué)藥學(xué)院

SchoolPharmacyofYantaiUniversity43*煙臺(tái)大學(xué)藥學(xué)院

SchoolPharmacyofYantaiUniversity(四)四級(jí)結(jié)構(gòu)(quarternarystructure)

蛋白質(zhì)的四級(jí)結(jié)構(gòu)是指由多條各自具有一、二、三級(jí)結(jié)構(gòu)的肽鏈通過非共價(jià)鍵連接起來的結(jié)構(gòu)形式,內(nèi)容包括各個(gè)亞基在蛋白質(zhì)中的空間排列方式及亞基之間的相互作用關(guān)系.

44*煙臺(tái)大學(xué)藥學(xué)院

SchoolPharmacyofYantaiUniversity45*煙臺(tái)大學(xué)藥學(xué)院

SchoolPharmacyofYantaiUniversity每一個(gè)具有獨(dú)立三級(jí)結(jié)構(gòu)的肽鏈,稱為亞基(Subunit),它一般由一條肽鏈構(gòu)成,無生理活性,只有當(dāng)這些亞基聚合成一個(gè)完整的蛋白質(zhì)分子后,才具有生物活性由2-10個(gè)亞基組成的蛋白稱為寡聚體(oligomer)

更多亞基組成的蛋白稱多聚體(polymer)46*煙臺(tái)大學(xué)藥學(xué)院

SchoolPharmacyofYantaiUniversity(五)維持蛋白質(zhì)構(gòu)象的化學(xué)鍵1氫鍵(hydrogenbond):一個(gè)電負(fù)性大的原子上的氫和另一個(gè)電負(fù)性大的原子相互作用形成的鍵.2疏水鍵(hydrophobicbond):由兩個(gè)非極性基團(tuán)因避開水而聚在一起的作用力.47*煙臺(tái)大學(xué)藥學(xué)院

SchoolPharmacyofYantaiUniversity3鹽鍵(ionicbond):正電荷基團(tuán)和負(fù)電荷基團(tuán)之間的靜電吸引所形成的化學(xué)鍵.4范德華引力(VanderWaals):原子,分子,基團(tuán)間的一種弱作用力.5二硫鍵(disulfidebond)48*煙臺(tái)大學(xué)藥學(xué)院

SchoolPharmacyofYantaiUniversity維系蛋白質(zhì)分子的一級(jí)結(jié)構(gòu)：肽鍵、二硫鍵維系蛋白質(zhì)分子的二級(jí)結(jié)構(gòu)：氫鍵維系蛋白質(zhì)分子的三級(jí)結(jié)構(gòu)：疏水相互作用力、氫鍵、范德華力、鹽鍵維系蛋白質(zhì)分子的四級(jí)結(jié)構(gòu)：范德華力、鹽鍵49(六)研究蛋白質(zhì)構(gòu)象的方法1、X射線晶體衍射：三維結(jié)構(gòu)2、圓二色譜法（circulardichroism，CD）

分析二級(jí)結(jié)構(gòu)3、核磁共振（NMR）：三維結(jié)構(gòu)*煙臺(tái)大學(xué)藥學(xué)院

SchoolPharmacyofYantaiUniversity50研究蛋白質(zhì)和結(jié)構(gòu)功能的關(guān)系有重要意義：分子水平上闡明活性物質(zhì)的作用機(jī)制和一些疾病的發(fā)生原因.通過分子設(shè)計(jì)，可以對(duì)天然蛋白進(jìn)行結(jié)構(gòu)改造，改變生物學(xué)功能.可以設(shè)計(jì)一些天然不存在的活性蛋白.*煙臺(tái)大學(xué)藥學(xué)院

SchoolPharmacyofYantaiUniversity第三節(jié)蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)與功能51*煙臺(tái)大學(xué)藥學(xué)院

SchoolPharmacyofYantaiUniversity一、蛋白質(zhì)一級(jí)結(jié)構(gòu)與功能的關(guān)系一級(jí)結(jié)構(gòu)決定高級(jí)結(jié)構(gòu)進(jìn)而決定功能.1.一級(jí)結(jié)構(gòu)相似的蛋白質(zhì)具有相似的功能

蛋白質(zhì)的同源性，如血紅蛋白胰島素52*煙臺(tái)大學(xué)藥學(xué)院

SchoolPharmacyofYantaiUniversity一級(jí)結(jié)構(gòu)中關(guān)鍵部分相同,功能也相同ACTH：促腎上腺皮質(zhì)激素,垂體前葉分泌53*煙臺(tái)大學(xué)藥學(xué)院

SchoolPharmacyofYantaiUniversity2.一級(jí)結(jié)構(gòu)不同,生物學(xué)功能各異不同蛋白質(zhì)有不同功能的根本原因是一級(jí)結(jié)構(gòu)的不同.54*煙臺(tái)大學(xué)藥學(xué)院

SchoolPharmacyofYantaiUniversity3.一級(jí)結(jié)構(gòu)中關(guān)鍵部分變化,其生物活性也改變55*煙臺(tái)大學(xué)藥學(xué)院

SchoolPharmacyofYantaiUniversity4蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)與生物進(jìn)化

同源蛋白：在不同有機(jī)體中實(shí)現(xiàn)同一功能的蛋白質(zhì).

同源蛋白中的一級(jí)結(jié)構(gòu)中有許多位置的氨基酸對(duì)所有種屬來說都是相同的，稱為不變殘基；其他位置的氨基酸稱可變殘基.

不同種屬的可變殘基有很大變化.可用于判斷生物體間親緣關(guān)系的遠(yuǎn)近.56*煙臺(tái)大學(xué)藥學(xué)院

SchoolPharmacyofYantaiUniversity不同生物和人的細(xì)胞色素C中氨基酸組成的差異

例：細(xì)胞色素C,80個(gè)物種中,有26個(gè)位置上的氨基酸殘基完全不變,是維持其構(gòu)象中發(fā)揮特有功能所必要的部位,屬于不變殘基.生物名稱不同氨基酸數(shù)黑猩猩0恒河猴1豬、牛、羊10馬12雞13海龜15金槍魚21小蠅25小麥35酵母4457*煙臺(tái)大學(xué)藥學(xué)院

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可變殘基可能隨著進(jìn)化而變異，而且不同種屬的細(xì)胞色素C氨基酸差異數(shù)與種屬之間的親緣關(guān)系相關(guān).親緣關(guān)系相近者，氨基酸差異少，反之則多(進(jìn)化樹)58*煙臺(tái)大學(xué)藥學(xué)院

SchoolPharmacyofYantaiUniversity5.一級(jí)結(jié)構(gòu)的變化與疾病的關(guān)系如鐮刀貧血病(sickle-cellanemia),其不正常的血紅蛋白(Hb-S)與正常的血紅蛋白(Hb-A)的差別：僅僅在于β鏈的N-末端第6位殘基發(fā)生變化CTT→CAT59*煙臺(tái)大學(xué)藥學(xué)院

SchoolPharmacyofYantaiUniversity糖尿病是胰島素51個(gè)氨基酸中僅有一氨基酸殘基異常:這類由遺傳突變引起的在分子水平上僅存在微觀差異而導(dǎo)致的疾病稱作分子病60*煙臺(tái)大學(xué)藥學(xué)院

SchoolPharmacyofYantaiUniversity二蛋白質(zhì)的空間構(gòu)象與功能的關(guān)系蛋白質(zhì)分子特定的空間構(gòu)象是其具有生物活性所必需的.1.蛋白質(zhì)前體的活化有些蛋白在體內(nèi)是以無活性的蛋白質(zhì)原形式合成和分泌的,經(jīng)過裂解之后才表現(xiàn)出活性.一些酶原和蛋白質(zhì).61*煙臺(tái)大學(xué)藥學(xué)院

SchoolPharmacyofYantaiUniversity例：胰島素,在剛合成時(shí)為前胰島素原,其的N-末端有一段肽鏈,稱為信號(hào)肽.信號(hào)肽被切去,變成胰島素原.其由84個(gè)aa組成,僅有10%活性,經(jīng)水解成一條21個(gè)aa的A鏈,一條30個(gè)aa的B鏈，才有完整的生物活性.62*煙臺(tái)大學(xué)藥學(xué)院

SchoolPharmacyofYantaiUniversity2.蛋白質(zhì)的變構(gòu)現(xiàn)象變構(gòu)作用(allostericeffect)：又稱別構(gòu)效應(yīng),指含亞基的蛋白質(zhì)分子由于一個(gè)亞基構(gòu)象的改變而引起其余亞基以至整個(gè)分子構(gòu)象、性質(zhì)和功能發(fā)生變化.以血紅蛋白為例：血紅蛋白(Hb),四聚體(α2β2),與氧的親和力很弱,但當(dāng)氧與Hb分子中一個(gè)亞基的血紅素輔基的鐵結(jié)合后.即引起該亞基構(gòu)象的改變,一個(gè)亞基構(gòu)象的改變又會(huì)引起其余亞基的構(gòu)象相繼發(fā)生改變,易于與氧結(jié)合,使Hb與氧結(jié)合的速度大大加快.633.蛋白質(zhì)構(gòu)象改變引起的疾病一級(jí)結(jié)構(gòu)未變，高級(jí)結(jié)構(gòu)改變引起的疾病.錯(cuò)誤折疊引起蛋白相互聚集，形成抗蛋白水解酶的淀粉樣纖維沉淀致病.這類疾病包括：老年癡呆，瘋牛病，人紋狀體脊髓變性病等.*煙臺(tái)大學(xué)藥學(xué)院

SchoolPharmacyofYantaiUniversity64瘋牛病，牛海綿狀腦病(bovinespongiformencephalopathy,BSE)，病牛腦組織呈海綿狀病變，并出現(xiàn)步態(tài)不穩(wěn)、平衡失調(diào)、搔癢、煩燥不安等癥狀，通常在１４至９０天內(nèi)死亡.由阮病毒蛋白（prionprotein.PrP）引起.具有傳染性遺傳性.正常PrPC(α-螺旋)變成致病的PrPSc(β-折疊)，且后者可在體內(nèi)復(fù)制.*煙臺(tái)大學(xué)藥學(xué)院

SchoolPharmacyofYantaiUniversity65*煙臺(tái)大學(xué)藥學(xué)院

SchoolPharmacyofYantaiUniversity三參與體內(nèi)多肽鏈折疊過程的蛋白質(zhì)

(一)分子伴侶（molecularchaperone）細(xì)胞內(nèi)一類保守蛋白質(zhì),能識(shí)別肽鏈的非天然構(gòu)象,通過與疏水肽段結(jié)合和釋放作用（消耗ATP),消除蛋白質(zhì)不正確的疊折,促進(jìn)各功能域和整體蛋白質(zhì)的正確折疊.特點(diǎn):不參與蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)組成,結(jié)構(gòu)多樣,種類多分類:熱休克蛋白和伴侶素66*煙臺(tái)大學(xué)藥學(xué)院

SchoolPharmacyofYantaiUniversity1熱休克蛋白（heatshockprotein,Hsp)

研究較多的為Hsp70家族功能:識(shí)別和結(jié)合新合成的、部分折疊的新生肽鏈或正在穿膜的肽鏈,防止肽鏈錯(cuò)誤聚集,有利于肽鏈的正確折疊.67*煙臺(tái)大學(xué)藥學(xué)院

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2伴侶素(chaperonins)

Ecoli中包括GroEL和GroES家族真核細(xì)胞同源物HSP60和HSP10

作用：為非自發(fā)折疊的蛋白質(zhì)創(chuàng)造折疊的微環(huán)境．作用特點(diǎn):形成桶狀結(jié)構(gòu)68*煙臺(tái)大學(xué)藥學(xué)院

SchoolPharmacyofYantaiUniversity伴侶素GroEL/GroES系統(tǒng)促進(jìn)蛋白質(zhì)折疊過程69*煙臺(tái)大學(xué)藥學(xué)院

SchoolPharmacyofYantaiUniversity(二)折疊酶1.二硫鍵異構(gòu)酶功能:在肽鏈中催化錯(cuò)配二硫鍵斷裂并形成正確二硫鍵連接.

谷胱甘肽:鏈內(nèi)二硫鍵形成起著重要作用

G-SH:還原性谷胱甘肽

G-s-s-G:氧化性谷胱甘肽70*煙臺(tái)大學(xué)藥學(xué)院

SchoolPharmacyofYantaiUniversityCH2-SHCH2-SHG-SHCH2-S-S-GCH2-SHCH2-SCH2-S+G-s-s-G２G-SHG-SH鏈內(nèi)二硫鍵形成機(jī)制71*煙臺(tái)大學(xué)藥學(xué)院

SchoolPharmacyofYantaiUniversity2.肽酰脯氨酸順反異構(gòu)酶多肽鏈中肽酰-脯氨酸間形成的肽鍵有順反兩種異構(gòu)體，空間構(gòu)象明顯差別.肽酰-脯氨酰順反異構(gòu)酶可促進(jìn)上述順反兩種異構(gòu)體之間的轉(zhuǎn)換.72*煙臺(tái)大學(xué)藥學(xué)院

SchoolPharmacyofYantaiUniversity第四節(jié)蛋白質(zhì)的性質(zhì)

蛋白質(zhì)是由氨基酸組成,因此蛋白質(zhì)的性質(zhì)與氨基酸相似,但由于蛋白質(zhì)是由許多氨基酸通過肽鍵形成了大分子化合物,也就出現(xiàn)了一些新的性質(zhì).73*煙臺(tái)大學(xué)藥學(xué)院

SchoolPharmacyofYantaiUniversity一蛋白質(zhì)的變性(denaturation)指蛋白質(zhì)受物理或化學(xué)因素的影響,使蛋白質(zhì)分子原有的特定的空間構(gòu)象發(fā)生改變,從而導(dǎo)致蛋白質(zhì)性質(zhì)的改變以及生物活性的喪失.但一級(jí)結(jié)構(gòu)未遭破壞.1.變性蛋白質(zhì)的特性：變性蛋白質(zhì)主要標(biāo)志是生物學(xué)功能的喪失溶解度降低,易形成沉淀析出,粘度增加而擴(kuò)散系數(shù)減小，結(jié)晶能力喪失,分子形狀改變,肽鏈松散,反應(yīng)基團(tuán)增加,易被酶消化.74*煙臺(tái)大學(xué)藥學(xué)院

SchoolPharmacyofYantaiUniversity2.變性的因素物理因素:加熱、紫外線、X-射線、超聲波等.化學(xué)因素:強(qiáng)酸、強(qiáng)堿、有機(jī)溶劑、蛋白變性劑(尿素、鹽酸胍)、重金屬鹽等.3.蛋白質(zhì)的復(fù)性(renaturation)除去變性因素后,有的變性蛋白質(zhì)又可恢復(fù)其天然構(gòu)象和生物活性,這一現(xiàn)象稱為蛋白質(zhì)的復(fù)性75*煙臺(tái)大學(xué)藥學(xué)院

SchoolPharmacyofYantaiUniversity蛋白質(zhì)的一級(jí)結(jié)構(gòu)決定高級(jí)結(jié)構(gòu)76*煙臺(tái)大學(xué)藥學(xué)院

SchoolPharmacyofYantaiUniversity二蛋白質(zhì)的膠體性質(zhì)蛋白質(zhì)分子顆粒大小1-100nm之間,屬膠體顆粒范圍,在溶液中能形成穩(wěn)定的膠體,具有膠體溶液的典型性質(zhì)如布郎運(yùn)動(dòng)、丁達(dá)爾現(xiàn)象、不能透過半透膜、具有吸附能力等.蛋白質(zhì)的親水膠體溶液相當(dāng)穩(wěn)定：1.表面親水基團(tuán)吸引周圍的水分子,使水分子定向排列在它的周圍,形成“水化層”.2.蛋白質(zhì)在非等電點(diǎn)時(shí)帶有同種電荷,同種電荷相斥,使蛋白質(zhì)分子保持一定的距離而不聚合.

細(xì)胞質(zhì),分離純化+++++++帶正電荷的蛋白質(zhì)77*煙臺(tái)大學(xué)藥學(xué)院

SchoolPharmacyofYantaiUniversity三蛋白質(zhì)的兩性電離與等電點(diǎn)在某一pH值溶液中,蛋白質(zhì)酸性基團(tuán)和堿性基團(tuán)的解離程度相當(dāng),蛋白質(zhì)分子所帶正負(fù)電荷相等,凈電荷為零.此時(shí)溶液的pH值稱為蛋白質(zhì)的等電點(diǎn)(isoelectricpoint,pI).蛋白質(zhì)分離純化78*煙臺(tái)大學(xué)藥學(xué)院

SchoolPharmacyofYantaiUniversity四蛋白質(zhì)的沉淀反應(yīng)(precipitation)當(dāng)破壞了維持蛋白質(zhì)膠體穩(wěn)定的因素甚至蛋白質(zhì)的構(gòu)象時(shí),蛋白質(zhì)就會(huì)從溶液中析出,這種現(xiàn)象稱為蛋白質(zhì)的沉淀.方法:鹽析法(saltingout)

向蛋白質(zhì)溶液中加入大量中性鹽低濃度中性鹽：鹽溶作用高濃度中性鹽：鹽析作用79*煙臺(tái)大學(xué)藥學(xué)院

SchoolPharmacyofYantaiUniversity常用的中性鹽：硫酸銨、硫酸鈉、氯化鈉等作用原理:鹽離子與水親和力極強(qiáng),奪去蛋白質(zhì)的水化層,減少分子間靜電斥力特點(diǎn)：不破壞蛋白質(zhì)的構(gòu)象,蛋白質(zhì)不發(fā)生變性分段鹽析：調(diào)節(jié)鹽濃度,可使混合蛋白質(zhì)溶液中的幾種蛋白質(zhì)分段析出.

如血清球蛋白(50硫酸銨飽和度)

清蛋白(飽和硫酸銨)80*煙臺(tái)大學(xué)藥學(xué)院

SchoolPharmacyofYantaiUniversity(2)有機(jī)溶劑沉淀法原理:使蛋白質(zhì)脫去水化層,又能降低溶液的介電常數(shù)使蛋白質(zhì)表面電荷減少,導(dǎo)致白質(zhì)分子聚集而沉淀.常用有機(jī)溶劑:甲醇、乙醇、丙酮缺點(diǎn)：常會(huì)使蛋白質(zhì)變性注意事項(xiàng):低溫下操作,盡量縮短處理時(shí)間81*煙臺(tái)大學(xué)藥學(xué)院

SchoolPharmacyofYantaiUniversity重金屬鹽沉淀法原理:重金屬離子如Hg2+、Ag+、Pb2+等帶有正電荷,能與蛋白質(zhì)分子中帶負(fù)電基團(tuán)結(jié)合,生成不溶性的重金屬蛋白鹽而沉淀.

若溶液pH大于蛋白質(zhì)的pI,沉淀更易發(fā)生缺點(diǎn)：此法常使蛋白質(zhì)變性失活(4)加熱:變性導(dǎo)致沉淀.等電點(diǎn)時(shí)效果最好82*煙臺(tái)大學(xué)藥學(xué)院

SchoolPharmacyofYantaiUniversity(5)生物堿試劑和某些酸類沉淀法原理:生物堿試劑(如鞣酸、苦味酸、鎢酸等),某些酸類(三氯乙酸、磺酰水楊酸等),與帶正電的蛋白質(zhì)結(jié)合生成不溶性的鹽而沉淀.注意事項(xiàng):反應(yīng)溶液的pH<pI,確保蛋白質(zhì)以陽(yáng)離子形式存在缺點(diǎn)：此法常使蛋白質(zhì)變性失活83*煙臺(tái)大學(xué)藥學(xué)院

SchoolPharmacyofYantaiUniversity五蛋白質(zhì)的顏色反應(yīng)84*煙臺(tái)大學(xué)藥學(xué)院

SchoolPharmacyofYantaiUniversity六蛋白質(zhì)的免疫學(xué)性質(zhì)1.抗原(antigen,Ag):外源和非自身的能被免疫系統(tǒng)識(shí)別并產(chǎn)生免疫應(yīng)答的物質(zhì).免疫原性(Immunogenicity):能刺激生物體產(chǎn)生免疫應(yīng)答并產(chǎn)生抗體或免疫淋巴細(xì)胞的特性.免疫反應(yīng)性(Specificreactivity):能與所產(chǎn)生免疫應(yīng)答產(chǎn)物進(jìn)行結(jié)合并發(fā)生反應(yīng)的能力.半抗原(Hapten):不具免疫原性只具免疫反應(yīng)性的物質(zhì).85*煙臺(tái)大學(xué)藥學(xué)院

SchoolPharmacyofYantaiUniversity抗原決定簇(Determinant):是抗原引起免疫應(yīng)答和與抗體結(jié)合反應(yīng)的基本結(jié)構(gòu)單位.常位于抗原分子的表面,由3-8個(gè)氨基酸構(gòu)成:分為a.構(gòu)象決定簇b.順序決定簇86*煙臺(tái)大學(xué)藥學(xué)院

SchoolPharmacyofYantaiUniversity2.抗體(antibody,Ab):能與抗原特異性結(jié)合,并具免疫功能的球蛋白.免疫球蛋白(immunoglobulinIg)：具有抗體活性及和抗體結(jié)構(gòu)類似的球蛋白家族多克隆抗體(polyclonalantibodies)：針對(duì)各種抗原決定簇的許多不同的抗體.單克隆抗體(monoclonalantibodyMcAb)：針對(duì)單一抗原決定簇87*煙臺(tái)大學(xué)藥學(xué)院

SchoolPharmacyofYantaiUniversity抗原抗體反應(yīng)具有高度特異性3蛋白質(zhì)免疫性的應(yīng)用疾病的免疫預(yù)防,免疫診斷,免疫治療免疫分析:放射免疫分析(RIA)酶聯(lián)免疫分析:(ELISA)免疫分離純化:免疫親和層析88*煙臺(tái)大學(xué)藥學(xué)院

SchoolPharmacyofYantaiUniversity第五節(jié)蛋白質(zhì)研究的技術(shù)原理一蛋白質(zhì)分離與純化技術(shù)原理（一）蛋白質(zhì)的提取1.材料的選擇.含目的蛋白多,來源方便,注意處理過程2.組織細(xì)胞破碎.有機(jī)械方法、超聲法等3.提取分離.合適的溶劑和方法、防止酶解.89*煙臺(tái)大學(xué)藥學(xué)院

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（二）蛋白質(zhì)的分離與純化技術(shù)方法1.根據(jù)溶解度不同的分離純化方法

1)等電點(diǎn)沉淀法

2)鹽析沉淀法

3)低溫有機(jī)溶劑沉淀法

4)溫度對(duì)蛋白質(zhì)溶解度的響2.根據(jù)分子大小不同的分離純化方法

1)透析(dialysis)和超濾法(ultrafiltration)90*煙臺(tái)大學(xué)藥學(xué)院

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透析:將蛋白質(zhì)溶液放在半透膜袋內(nèi),置于適當(dāng)?shù)木彌_液中,小分子雜質(zhì)(如硫酸銨等)可從袋中透出,而蛋白質(zhì)保留于袋中,從而將蛋白質(zhì)純化.91*煙臺(tái)大學(xué)藥學(xué)院

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超濾法：利用壓力或離心力強(qiáng)行使水和小分子雜質(zhì)通過超濾膜(一種半透膜)除去,而蛋白質(zhì)留在膜上.92*煙臺(tái)大學(xué)藥學(xué)院

SchoolPharmacyofYantaiUniversity2分子篩層析(molecular-sievechromatography)

也叫凝膠過濾(gel-filtration)常用的凝膠：葡聚糖凝膠(商品名Sephadex)聚丙烯酰胺凝膠(商品名Bio-Gel)瓊脂糖凝膠(Sepharose)93*煙臺(tái)大學(xué)藥學(xué)院

SchoolPharmacyofYantaiUniversity94所用介質(zhì)為凝膠珠,其內(nèi)部為多孔網(wǎng)狀結(jié)構(gòu).一定型號(hào)的凝膠網(wǎng)孔只允許相應(yīng)大小的分子進(jìn)入凝膠顆粒內(nèi)部,大分子則被排阻在外.洗脫時(shí)大分子隨洗脫液從顆粒間隙流下來,洗脫液體積小;小分子在顆粒網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)中穿來穿去,歷程長(zhǎng),后洗脫下來,洗脫體積大.3密度梯度離心(densitygradientcentrifugation)*煙臺(tái)大學(xué)藥學(xué)院

SchoolPharmacyofYantaiUniversity95*煙臺(tái)大學(xué)藥學(xué)院

SchoolPharmacyofYantaiUniversity(三)根據(jù)電離性質(zhì)不同的分離方法電泳法和離子交換層析1.電泳法:帶電顆粒在電場(chǎng)中向著所帶電荷相反方向移動(dòng)稱為電泳.原理:不同的蛋白質(zhì)因結(jié)構(gòu)、形狀和帶電量的不同而有不同的泳動(dòng)速度,從而可以進(jìn)行分析和分離.分類：根據(jù)支持物的不同，可分為：薄膜電泳，凝膠電泳.

96*煙臺(tái)大學(xué)藥學(xué)院

SchoolPharmacyofYantaiUniversitya)SDS聚丙烯酰胺凝膠電泳法(SDS)SDS:十二烷基硫酸鈉,變性劑普通蛋白質(zhì)電泳的泳動(dòng)速率取決于荷質(zhì)比:凈電荷,大小,形狀用SDS和巰基乙醇(打開二硫鍵)處理蛋白質(zhì)變性并與SDS結(jié)合,形成SDS-蛋白質(zhì)復(fù)合物,使蛋白質(zhì)分子均帶負(fù)電.

0.4g-1.4gSDS/1g此方法只能測(cè)得亞基肽鏈的相對(duì)分子質(zhì)量97*煙臺(tái)大學(xué)藥學(xué)院

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十二烷基硫酸鈉

Sodiumdodecylsulfate

分子式：CH3(CH2)11OSO3Na

分子量：C12H25NaO4S=288.38

性狀：白色或淺黃色結(jié)晶或粉末.

熔點(diǎn)：180℃（分解）.

十二烷基磺酸鈉

Sodiumdodecylsulfonate

分子式：CH3(CH2)11SO3Na

分子量：C12H25NaO3S=272.38

性狀：白色或淺黃色結(jié)晶或粉末.

熔點(diǎn)：300℃.98*煙臺(tái)大學(xué)藥學(xué)院

SchoolPharmacyofYantaiUniversity水平式電泳裝置

垂直式電泳裝置99*煙臺(tái)大學(xué)藥學(xué)院

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b）等電點(diǎn)聚焦電泳（IFE）

：形成pH梯度,不同蛋白質(zhì)聚集到各自等電點(diǎn)位置.100*煙臺(tái)大學(xué)藥學(xué)院

SchoolPharmacyofYantaiUniversityC雙向電泳第一向：等電聚焦電泳第二向：SDS雙向電泳后的凝膠經(jīng)染色后蛋白呈現(xiàn)二維分布圖：水平方向反映出蛋白在pI上的差異，垂直方向反映出它們?cè)诜肿恿可系牟顒e.101*煙臺(tái)大學(xué)藥學(xué)院

SchoolPharmacyofYantaiUniversity2.離子交換層析(Ion-exchangechromatography)常用的陽(yáng)離子交換劑為羧甲基纖維素(CM-C)陰離子交換劑為二乙氨基乙基纖維素(DEAE-C)102*煙臺(tái)大學(xué)藥學(xué)院

SchoolPharmacyofYantaiUniversity2.離子交換層析(Ion-exchangechromatography)常用的陽(yáng)離子交換劑為羧甲基纖維素(CM-C)陰離子交換劑為二乙氨基乙基纖維素(DEAE-C)103*煙臺(tái)大學(xué)藥學(xué)院

SchoolPharmacyofYantaiUniversity(四)根據(jù)配基特異性的分離純化方法親和層析法(affinitychromatography):蛋白質(zhì)和相應(yīng)配基的親和力具有高度特異性和可逆性特點(diǎn).

抗原、ProteinA和抗體，酶與底物等.104*煙臺(tái)大學(xué)藥學(xué)院

SchoolPharmacyofYantaiUniversity二、蛋白質(zhì)的純度的鑒定1.層析法高壓液相層析法(