利用甜菜堿提升賴氨酸發(fā)酵及其代謝通量分析

利用甜菜堿提升賴氨酸發(fā)酵及其代謝通量分析洪銘;李巖;張?zhí)K龍;李雪松;封彬;陳波;王俊杰【摘要】賴氨酸發(fā)酵后期會產(chǎn)生很高的滲透壓.甜菜堿可以有效提高大腸桿菌對滲透壓的耐受性,大腸桿菌菌體自身對滲透壓的耐受機制反而會受其抑制.激活菌體自身的滲透壓耐受機制，可以提高發(fā)酵指標?實驗結(jié)果表明:在菌體生長到OD562為19.5后添加甜菜堿，可以使賴氨酸的發(fā)酵強度從5.6g/(L?h)提升至6.3g/(L?h),轉(zhuǎn)化率從65%提升至68.5%?提高初糖質(zhì)量濃度也能激活菌體滲透壓耐受性，可以進一步提高發(fā)酵強度至6.6g/(L?h).代謝通量分析結(jié)果表明:高轉(zhuǎn)化率工藝條件下6-磷酸果糖的逆向轉(zhuǎn)化進入磷酸戊糖途徑的通量較對照提高43%,而TCA循環(huán)通量較對照降低18.6%.研究結(jié)果表明:除去發(fā)酵初期的甜菜堿并提高初糖質(zhì)量濃度有利于提高賴氨酸發(fā)酵水平,要提高轉(zhuǎn)化率需將更多6-磷酸果糖導入磷酸戊糖途徑并降低TCA循環(huán)通量.期刊名稱】《發(fā)酵科技通訊》年(卷),期】2019(048)003【總頁數(shù)】7頁(P125-131)【關(guān)鍵詞】賴氨酸;大腸桿菌;滲透壓;甜菜堿;代謝通量分析【作者】洪銘;李巖;張?zhí)K龍;李雪松;封彬;陳波;王俊杰【作者單位】廊坊梅花生物技術(shù)開發(fā)有限公司,河北廊坊065001;廊坊梅花生物技術(shù)開發(fā)有限公司,河北廊坊065001;廊坊梅花生物技術(shù)開發(fā)有限公司,河北廊坊065001;廊坊梅花生物技術(shù)開發(fā)有限公司,河北廊坊065001;廊坊梅花生物技術(shù)開發(fā)有限公司,河北廊坊065001;廊坊梅花生物技術(shù)開發(fā)有限公司,河北廊坊065001;廊坊梅花生物技術(shù)開發(fā)有限公司,河北廊坊065001【正文語種】中文【中圖分類】Q819賴氨酸是一種重要的氨基酸，大量用作營養(yǎng)強化劑和飼料添加劑［1］。目前全世界賴氨酸產(chǎn)量約220萬t/年，市場規(guī)模約達到15億美元［2］。鑒于賴氨酸巨大的市場價值，研究人員對賴氨酸的生物合成和發(fā)酵優(yōu)化進行了大量研究［3-7］。大腸桿菌是一種重要的賴氨酸生產(chǎn)菌，它對滲透壓較為敏感［8］。在大腸桿菌發(fā)酵賴氨酸的過程中，滲透壓會超過2000mOsm，為了維持發(fā)酵后期菌體活性，必須通過添加甜菜堿來提高菌體對滲透壓的耐受性［9-12］。然而，在單純依賴甜菜堿的條件下，菌體已經(jīng)無法很好地抵抗外界高滲透壓環(huán)境。要提高菌體對外界高滲透壓的耐受性，必須激發(fā)菌體其他的抗高滲透壓機制。目前關(guān)于賴氨酸發(fā)酵滲透壓調(diào)控方法未見報道。Ishida等［13］發(fā)現(xiàn)將大腸桿菌放在高滲透壓條件下處理30min，可以提高大腸桿菌在高滲透壓條件下的生長速度，說明大腸桿菌在高滲透壓條件下可以自發(fā)產(chǎn)生高滲透壓耐受性；S3vin等［14］發(fā)現(xiàn)在高滲透壓環(huán)境條件下，大腸桿菌會積累輔酶Q8，并證明了輔酶Q8可以提高大腸桿菌對滲透壓的耐受性，其機制在于輔酶Q8的長異戊二烯側(cè)鏈可以提高細胞壁強度。在一定的高滲透壓條件下，細胞會失去水分，同時會積累海藻糖，而在向培養(yǎng)基中添加甜菜堿的條件下，細胞內(nèi)的水分會恢復到正常水平，同時并未出現(xiàn)海藻糖的積累［15］。上述研究表明，大腸桿菌在高滲透壓的條件下會發(fā)生一系列的生理變化，失去水分，菌體會通過吸收外界滲透壓相容物（如甜菜堿）或提高細胞壁強度來提高菌體對環(huán)境高滲透壓的耐受性菌體在吸收甜菜堿后胞內(nèi)水分會恢復到正常水平，此時菌體不需要調(diào)整代謝來適宜外界高滲透壓環(huán)境，因而不會提高輔酶Q8或甜菜堿的合成來對抗外界高滲環(huán)境。可以將菌體對高滲透壓耐受分為兩個主要機制：1)吸收環(huán)境中的滲透壓相容物；2)菌體自身發(fā)生變化(合成滲透壓相容物如海藻糖或提高細胞壁強度如合成輔酶Q8)，提高對外界高滲透壓的耐受性。在機制1)條件下會削弱機制2)的形成，而提高細胞壁強度等措施只有在細胞分裂過程中才會生效，因而最合適的時機是在菌體快速生長階段。筆者通過調(diào)整甜菜堿的添加時機，使菌體在發(fā)酵初期能經(jīng)歷較高滲透壓環(huán)境，自身產(chǎn)生對滲透壓的耐受性，在發(fā)酵后期可以吸收甜菜堿，獲得進一步的滲透壓耐受性。代謝通量分析是解析菌內(nèi)微觀代謝特點的重要方法［16］。通過代謝通量分析可以對底物代謝去向和比例進行定量分析，從而找到新的代謝靶點或者對上游代謝改造的結(jié)果進行確認。相較于酶活或者轉(zhuǎn)錄組學研究，代謝通量分析能更加直觀地反映菌體的真實代謝情況［17］。主要通過發(fā)酵工藝的改進，改變甜菜堿的添加時機，使菌體本身產(chǎn)生滲透壓耐受性，從而與吸收甜菜堿獲得的滲透壓耐受性相疊加，最終提高大腸桿菌對發(fā)酵過程中高滲透壓的耐受性，使發(fā)酵強度和轉(zhuǎn)化率有所提高。在得到高轉(zhuǎn)化率工藝后，對其胞內(nèi)代謝通量進行分析，發(fā)現(xiàn)了高轉(zhuǎn)化率發(fā)酵過程的代謝特點。1材料與方法菌種與培養(yǎng)基賴氨酸發(fā)酵菌種為基因工程改造的大腸桿菌，保存在本實驗室中。種子培養(yǎng)基(g/L):淀粉水解糖30,玉米漿15，酵母粉40,硫酸銨10,磷酸氫二鉀1,硫酸鎂0.5，碳酸鈣10,pH7.0。發(fā)酵培養(yǎng)基(g/L):甜菜堿2，葡萄糖30,糖蜜20,玉米漿20,硫酸銨30,磷酸氫二鉀1,硫酸鎂0.5。滲透壓測定滲透壓采用Osmomatbasic3000(德國gonotec)冰點滲透壓儀進行測定。取2mL樣品轉(zhuǎn)入離心管中，12000r/min離心2min,取上清50pL,轉(zhuǎn)入1.5mLEP管中，放入冰點滲透壓儀中進行測定。賴氨酸測定高效液相色譜儀為Agilent1200HPLC（AgilentTechnologies）;色譜柱為KromasilC18（200x4.6mm,5pm）;流動相為V（乙腈）：V（質(zhì)量分數(shù)為0.5%的醋酸鈉，用冰醋酸調(diào)節(jié)pH至6.8）=42:58;檢測波長為360nm;流速為1mL/min。葡萄糖濃度測定葡萄糖濃度采用生物傳感分析儀（SBA-40C,山東省科學院生物研究所）進行測定。取樣，稀釋10倍后，取25pL稀釋液測定葡萄糖濃度。菌濃測定菌濃采用722E型可見分光光度計（上海光譜儀器有限公司）測定。取1mL樣品，稀釋50倍，在波長562nm條件下測定樣品OD562。游離銨濃度測定游離銨采用凱氏定氮儀進行測定。賴氨酸發(fā)酵方法賴氨酸發(fā)酵用百倫50L發(fā)酵罐進行；接種量為10%（按體積分數(shù)計）；加入氨水，控制發(fā)酵pH為6.8±0.2;流加硫酸銨，控制游離銨質(zhì)量濃度為1±0.1g/L;流加葡萄糖，控制發(fā)酵過程中糖的質(zhì)量濃度為2~4g/L;通過調(diào)整通氣量和攪拌轉(zhuǎn)速使得發(fā)酵過程中溶氧＞30%;發(fā)酵溫度為37°C。代謝通量分析研究所采用的代謝通量分析基于化學計量的方法進行。代謝通量分析過程中所用代謝網(wǎng)絡(luò)如表1所示。該代謝網(wǎng)絡(luò)由糖酵解途徑、磷酸戊糖途徑、TCA循環(huán)、賴氨酸合成反應(yīng)和能量代謝反應(yīng)等23個代謝反應(yīng)組成，其中r1~r19為速率未知的代謝反應(yīng)，r20~r23是經(jīng)過測定的已知代謝速率的反應(yīng)。表1大腸桿菌產(chǎn)賴氨酸代謝反應(yīng)網(wǎng)絡(luò)Table1ReactionnetworkofE.coliproducinglysine編號代謝反應(yīng)r1葡萄糖+ATP—6-磷酸葡萄糖r26-磷酸葡萄糖-6-磷酸果糖r36-磷酸果糖+ATP-2x3-磷酸甘油醛r43-磷酸甘油醛-3-磷酸甘油酸+ATP+NADHr53-磷酸甘油酸-丙酮酸+ATPr66-磷酸葡萄糖-6-磷酸葡萄糖酸+NADPHr76-磷酸葡萄糖酸-5-磷酸核酮糖+CO2+NADPHr83x5-磷酸核酮糖-2x6-磷酸果糖+3-磷酸甘油醛r9丙酮酸-乙酰輔酶A+NADH+CO2r10乙酰輔酶A+草酰乙酸-檸檬酸r11檸檬酸-a-酮戊二酸+NADPH+CO2r12a-酮戊二酸—琥珀酸+NADH+CO2+ATPr13琥珀酸—草酰乙酸+FADH2+NADHr14丙酮酸+ATP+CO2-草酰乙酸r15草酰乙酸+丙酮酸+4xNADPH+ATP-賴氨酸+CO2r16NADH+0.5xO2-2.5xATPr17FADH2+0.5xO2-1.5xATPr18檸檬酸—檸檬酸.extr19ATP-ATP.extr20O2.ext-O2r21CO2-CO2.extr22葡萄糖.ext-葡萄糖r23賴氨酸-賴氨酸.ext基于表1中的代謝網(wǎng)絡(luò)，由19個中間代謝物通過化學計量平衡得到的化學計量矩陣如表2所示，該矩陣每一行代表一個代謝物的平衡式，每一列代表一個代謝反應(yīng)，其中未知反應(yīng)r1~r19構(gòu)成的矩陣記作S，已知反應(yīng)r20~r23構(gòu)成的矩陣記作B，需要求解的代謝反應(yīng)向量記作V,已知反應(yīng)組成的列向量[r20,r21,r22,r23]T記作V0。根據(jù)化學計量守恒有SxV=(-B)xV0,利用矩陣除法可以計算出需求解的代謝反應(yīng)向量V=S\[(-B)xV0]。2結(jié)果與討論提高發(fā)酵液滲透壓對賴氨酸發(fā)酵的影響由于賴氨酸發(fā)酵后期的滲透壓超過2000mOsm，這種高滲透壓環(huán)境可能對菌體生長造成較大影響，這些滲透壓的主要來源是賴氨酸。為了研究高滲透壓對賴氨酸發(fā)酵的影響，在初始培養(yǎng)基中添加300mmol的賴氨酸或氯化鈉，觀察不同類型的高滲透壓來源是否帶來相同的影響，以考察高滲透壓是否是后期發(fā)酵效率下降的主要因素。初始培養(yǎng)基中添加賴氨酸或氯化鈉對發(fā)酵的影響如圖1所示。在賴氨酸發(fā)酵過程中，初始滲透壓為718mOsm，發(fā)酵前期，由于葡萄糖等成分的濃度不斷下降，導致滲透壓不斷下降；發(fā)酵中后期，隨著賴氨酸等的濃度不斷提高，滲透壓會不斷升高，最終到達2350mOsm。在初始培養(yǎng)基中添加300mmol的賴氨酸后，雖然前期發(fā)酵液中賴氨酸質(zhì)量濃度比對照組高(0h，對照賴氨酸6g/L，添加賴氨酸的組賴氨酸61g/L)，但是12h后與對照組的賴氨酸質(zhì)量濃度差越來越小，36h放罐時的賴氨酸質(zhì)量濃度甚至略低于對照組，如圖1(a)所示。培養(yǎng)基中添加賴氨酸后，初始滲透壓比對照高，而到放罐時，其滲透壓比對照略低，如圖1(b)所示，對照組2350mOsm，添加賴氨酸組2312mOsm。實驗結(jié)果說明：通過添加賴氨酸來提高發(fā)酵液中滲透壓強度后，對發(fā)酵前期影響較小，菌體對中等濃度的滲透壓有一定的耐受能力，而到發(fā)酵后期菌體無法耐受太高的滲透壓，導致賴氨酸合成的速度越來越慢，最終在添加賴氨酸的實驗組的賴氨酸濃度較對照偏低。表2大腸桿菌產(chǎn)賴氨酸代謝網(wǎng)絡(luò)中代謝物化學計量平衡矩陣Table2ThestoichiometricmatrixofthemetabolicnetworkofE.coliproducinglysine中間代謝物「1r2r3r4r5r6r7r8r9r10r11r12r13r14r15r16r17r18r19r20r21r22r23葡萄糖-116-磷酸葡萄糖1-1-16-磷酸果糖1-123-磷酸甘油醛2-113-磷酸甘油酸1-16-磷酸葡萄糖酸1-15-磷酸核酮糖1-3乙酰輔酶A1-1檸檬酸1-1-1a-酮戊二酸1琥珀酸1-1草酰乙酸-111-1賴氨酸1-1O2-O.5-O.51CO21111-11-1NADPH111-4FADH21-1ATP-1-1111-1-12.51.5-1丙酮酸1-1-1-1由于賴氨酸本身也有可能抑制賴氨酸的合成，為了驗證上述抑制作用主要是來自滲透壓，筆者在另一個發(fā)酵罐的初始培養(yǎng)基中添加了300mmol氯化鈉。添加氯化鈉后，發(fā)酵過程中滲透壓變化趨勢與添加賴氨酸的實驗組基本相同，見圖1(b);而賴氨酸質(zhì)量濃度在發(fā)酵前期與對照組相當，發(fā)酵后期比對照組低。在賴氨酸發(fā)酵過程中，無論是添加賴氨酸或者氯化鈉，提高發(fā)酵液滲透壓的措施后，發(fā)酵后期的發(fā)酵液的滲透壓都趨近2300mOsm,說明菌體難以在更高的滲透壓條件下繼續(xù)高效合成賴氨酸，無法繼續(xù)提高發(fā)酵液中賴氨酸的質(zhì)量濃度。圖1初始培養(yǎng)基中添加賴氨酸或氯化鈉對發(fā)酵的影響Fig.1EffectofaddinglysineorNaClonlysinefermentation甜菜堿添加時機對賴氨酸發(fā)酵的影響大腸桿菌對滲透壓的耐受性主要來自兩個方面：1）吸收環(huán)境中滲透壓相容物；2）提高自身滲透壓耐受性。若這兩種功能可以同時發(fā)揮作用則可以進一步提高菌體對高滲透壓的耐受性。賴氨酸發(fā)酵前期（即菌體的生長階段）發(fā)酵液中的滲透壓較低，發(fā)酵后期滲透壓則會很高。大腸桿菌在生長階段通過提高細胞壁的強度可以提高對滲透壓的耐受性，而當初始培養(yǎng)基中含有滲透壓相容物后，菌體就不會自發(fā)提高細胞壁強度。要在賴氨酸發(fā)酵過程中進一步提高滲透壓耐受性，應(yīng)該將底料中的甜菜堿除去，保證菌體在生長階段無法吸收甜菜堿，從而自發(fā)提高細胞壁強度；到穩(wěn)定期后再將甜菜堿投入發(fā)酵罐中，這樣大腸桿菌就能擁有兩種提高耐受滲透壓的方式，從而更好地抵抗后期滲透壓的影響。除去底料中的甜菜堿，然后在不同批次的賴氨酸發(fā)酵過程中OD562分別達到9.7，19.5和30.1時將等量的甜菜堿倒入發(fā)酵罐中，觀察不同甜菜堿添加時機對賴氨酸發(fā)酵的影響，對照組的甜菜堿在底料中添加，如圖2所示。在正常發(fā)酵過程中（對照組），菌體OD562在10h前快速生長,10-20h菌體生長速度變慢,20-28h菌體濃度趨于穩(wěn)定,28-36h菌體濃度略有下降。當在菌體OD562分別為9.7,19.5,30.1時，添加甜菜堿，添加甜菜堿前，菌體OD562比對照組略低，添加甜菜堿后，菌體OD562開始快速增長，36h時菌體OD562均比對照組高，在菌體生長到OD562越高的時候添加甜菜堿則下罐OD562越高。上述結(jié)果表明，在菌體生長到一定程度后再添加甜菜堿可以促使菌體形成對滲透壓的耐受性，進而促進菌體的生長，并提高后期菌體OD562。圖2在菌體生長到不同OD562條件下添加甜菜堿對生長的影響Fig.2EffectofaddingbetaineatdifferentOD562oncellgrowth推遲添加甜菜堿，除了能促進菌體生長，還能提高發(fā)酵強度。在不同OD562時添加甜菜堿，能提高下罐賴氨酸的濃度，OD562為9.7，19.5和30.1時添加甜菜堿，下罐賴氨酸質(zhì)量濃度分別為171,177，185g/L，添加甜菜堿的時候OD562越大，下罐賴氨酸質(zhì)量濃度越高，同時菌體耐受的滲透壓也越高，分別為2380，2410，2490mOsm(見表3)。推遲添加甜菜堿使發(fā)酵強度較對照組有了較大提高，如表3所示，OD562為9.7，19.5和30.1時添加甜菜堿，對應(yīng)發(fā)酵強度分別較對照組提高了3.6%，8.9%和12.5%，說明推遲添加甜菜堿可以有效提高菌體活力，從而提高賴氨酸的生產(chǎn)效率。表3在菌體生長到不同OD562時添加甜菜堿后的發(fā)酵結(jié)果Table3FermentationresultsafteraddingbetaineatdifferentOD562項目對照組添加甜菜堿時OD562值9.719.530.1最高OD56238.2±0.839.8±0.740.5±0.941.5±0.836h時OD56234.3±0.735.5±0.837.2±0.838.5±0.9賴氨酸/?L-1)165±4171±3177±4185±4滲透壓/mOsm2350±612380±412410±522490±45轉(zhuǎn)化率/%65±0.467.4±0.368.5±0.568±0.4產(chǎn)率/?L-1?h-1)5.6±0.25.8±0.16.1±0.26.3±0.2在不同OD562時添加甜菜堿不僅能夠提高菌體生長速度和發(fā)酵強度，還能提高發(fā)酵轉(zhuǎn)化率，如表3所示。在OD562為9.7,19.5,30.1時添加甜菜堿，轉(zhuǎn)化率分別較對照組提升了2.4%,3.5%,3%;在OD562為19.5時添加甜菜堿時的轉(zhuǎn)化率最高；繼續(xù)提高OD562至30.1后，轉(zhuǎn)化率反而開始降低，這可能是因為當繼續(xù)提高添加甜菜堿時的OD562值后菌體最終生長的OD562過高，反而需要消耗更多能量用于菌體生長和維持，如圖2。因此，從轉(zhuǎn)化率的角度看，最佳甜菜堿添加時機是OD562為19.5時。提高發(fā)酵初期滲透壓對賴氨酸發(fā)酵的影響在2.2中，通過除去底料里的甜菜堿并在OD562生長到一定階段后再將等量甜菜堿投入發(fā)酵罐中，成功提高了發(fā)酵強度和轉(zhuǎn)化率，實驗結(jié)果與預期基本相符，在一定程度上證明了在菌體生長初期除去甜菜堿可以使得菌體獲得對滲透壓的耐受性。既然在沒有甜菜堿的條件下，菌體在生長過程中可以獲得滲透壓耐受性，那么提高初期發(fā)酵液的滲透壓強度可能使得菌體對滲透壓的耐受性進一步強化。在2.3中，移除發(fā)酵底料中的甜菜堿，然后在OD562生長到20左右，將甜菜堿倒入發(fā)酵液中，接著提高發(fā)酵0h時葡萄糖質(zhì)量濃度(見圖3(a))，提高發(fā)酵初期的滲透壓強度(見圖3(b))，觀察提高發(fā)酵初期滲透壓強度對賴氨酸發(fā)酵的影響。除去底料中甜菜堿后(OD562到20左右將甜菜堿倒入發(fā)酵罐)，將初糖質(zhì)量濃度從30g/L提高到40g/L，8h之前OD562會略微降低，發(fā)酵12h后，OD562比對照組高，下罐時OD562也高于對照組，見圖3(c);同時，36h時發(fā)酵液中的賴氨酸質(zhì)量濃度從177g/L提高到185g/L，見圖3(d)，發(fā)酵強度從6.1g/L/h提高到6.6g/(L?h),見表4。然而，提高初糖質(zhì)量濃度后，轉(zhuǎn)化率從68.5%下降到67.5%，這可能是提高了菌體OD562后增加了能量消耗造成的。圖3提高初糖濃度對賴氨酸發(fā)酵的影響Fig.3Effectofincreaseinitialglucoseconcentrationonlysinefermentation目前，國內(nèi)已報道的大腸桿菌發(fā)酵產(chǎn)賴氨酸的最高轉(zhuǎn)化率為70%，最高賴氨酸質(zhì)量濃度為194.4g/L[18]。由于菌株存在差異，本實驗中采用的菌株培養(yǎng)36h即可下罐，雖然最終賴氨酸質(zhì)量濃度比國內(nèi)最高水平(194.4g/L,48h)略低，但是發(fā)酵效率卻高得多。表4提高初糖質(zhì)量濃度對賴氨酸發(fā)酵的影響Table4Effectofinitialglucoseconcentrationonlysinefermentation項目初糖30g/L初糖40g/L最高OD56240.5±0.941.1±0.836h時OD56237.2±0.838.5±0.7賴氨酸/?L-1）177±4185±3滲透壓/m0sm2410±522490±60轉(zhuǎn)化率/%68.5±0.567.5±0.4產(chǎn)率/?L-1?h-1）6.1±0.26.6±0.2賴氨酸高轉(zhuǎn)化率條件下代謝通量分析賴氨酸屬于大宗氨基酸，全世界年產(chǎn)量高達220萬t。隨著市場的飽和，對大部分生產(chǎn)廠家而言轉(zhuǎn)化率是影響生產(chǎn)成本的最關(guān)鍵的因素，為了分析在高轉(zhuǎn)化率的賴氨酸發(fā)酵過程中大腸桿菌的代謝特點，筆者計算了高轉(zhuǎn)化率工藝條件下大腸桿菌的胞內(nèi)代謝通量，并與對照組進行比較。當OD562達到19.5時向培養(yǎng)基中加入甜菜堿可以將轉(zhuǎn)化率由對照組的65%提升至68.5%（為筆者本次研究中的最高轉(zhuǎn)化率），實驗組與對照組胞內(nèi)代謝通量分析結(jié)果見圖4，圖中代謝反應(yīng)旁的數(shù)字為相對代謝通量，其中葡萄糖吸收速率設(shè)定為100，其他速率根據(jù)與葡萄糖吸收速率的關(guān)系歸一化得到。雖然無法利用代謝通量分析發(fā)現(xiàn)甜菜堿在賴氨酸發(fā)酵過程中的作用，但是通過高/低轉(zhuǎn)化率發(fā)酵條件下代謝通量的比較仍然可以分析賴氨酸發(fā)酵過程中微觀代謝的特點，從而找到影響轉(zhuǎn)化率的關(guān)鍵因素，為高轉(zhuǎn)化率菌株的代謝改造指明方向。圖4高/低轉(zhuǎn)化率條件下大腸桿菌相對代謝通量分布Fig.4RelativemetabolicfluxdistributionofE.coliunderhigh/lowyield賴氨酸發(fā)酵過程中反應(yīng)r2（6-磷酸葡萄糖-6-磷酸果糖）的代謝通量數(shù)值為負數(shù)，說明該反應(yīng)的代謝方向與定義方向相反，即由磷酸戊糖途徑產(chǎn)生的6-磷酸果糖會逆流生成6-磷酸葡萄糖，并再次進入磷酸戊糖途徑。由于賴氨酸合成過程中需要消耗4個NADPH，而磷酸戊糖途徑是NADPH的主要來源，r2代謝流方向與正常糖酵解途徑方向相反是賴氨酸發(fā)酵過程中的一個重要特征。果糖吸收后會生成1,6-二磷酸果糖，無法通過該反應(yīng)進入磷酸戊糖途徑，因此確保葡萄糖原料在發(fā)酵前不轉(zhuǎn)化成果糖是保證賴氨酸高轉(zhuǎn)化率的條件之一?？梢钥闯觯咿D(zhuǎn)化率條件下，r2的代謝通量較對照組提高了43%，因此通過提高反應(yīng)r2來提高磷酸戊糖途徑的通量比例是高轉(zhuǎn)化率的關(guān)鍵之一。賴氨酸發(fā)酵過程中另一個特點是TCA循環(huán)通量較低，見圖4。賴氨酸發(fā)酵過程中，由于大量丙酮酸被用作賴氨酸合成的前體，只能產(chǎn)生較少的乙酰輔酶A進入TCA循環(huán)，最終限制了TCA循環(huán)的通量。而高轉(zhuǎn)化率條件下TCA循環(huán)較對照組降低了18.6%(見圖4,r11:檸檬酸-a-酮戊二酸)。上述現(xiàn)象說明要保證賴氨酸發(fā)酵的高轉(zhuǎn)化率必須降低TCA循環(huán)的通量，同時還要保證TCA循環(huán)有一定的活性以確保菌體的正常生長。如果能夠設(shè)計出一種在生長結(jié)束后大大降低TCA循環(huán)通量的生物組件，必然能夠極大提高賴氨酸發(fā)酵的轉(zhuǎn)化率。3結(jié)論主要研究了賴氨酸發(fā)酵過程中滲透壓對賴氨酸生產(chǎn)的影響，并通過調(diào)整菌體對滲透壓的耐受性來提高發(fā)酵強度(從5.6g/(L?h)提升至6.6g/(L?h))和轉(zhuǎn)化率(從65%提升至68.5%)。首先，在發(fā)酵0h時添加賴氨酸或者氯化鈉的實驗結(jié)果表明高滲透壓會在一定程度上抑制賴氨酸的合成。然后，在不同OD562條件下添加甜菜堿的實驗表明改變甜菜堿的添加時機可以改善菌體對滲透壓的耐受性，當OD562為19.5時添加甜菜堿可以較對照組提高1.5%的轉(zhuǎn)化率。為了進一步提高發(fā)酵指標，通過提高發(fā)酵0h時糖的質(zhì)量濃度來提高初始滲透壓。結(jié)果表明：提高發(fā)酵初期滲透壓有利于提高菌體對后期高滲透壓的耐受性，有利于提升發(fā)酵強度(從6.1g/(L?h)提高至6.6g/(L?h)),然而，由于菌體質(zhì)量濃度的提高，最終轉(zhuǎn)化率略有下降。最后，為探索高轉(zhuǎn)化率條件下大腸桿菌的代謝特點，對高轉(zhuǎn)化率發(fā)酵條件下菌體胞內(nèi)代謝進行了代謝通量分析，發(fā)現(xiàn)6-磷酸果糖的逆向轉(zhuǎn)化和低的TCA循環(huán)通量是賴氨酸高轉(zhuǎn)化率的關(guān)鍵因素。參考文獻：相關(guān)文獻】王洪，喻書文,張福安?結(jié)晶葡萄糖母液對賴氨酸發(fā)酵過程的影響[J].發(fā)酵科技通訊,2018,47(3):184-188.SANCHEZS,RODRGUEZ-SANOJAR,RAMOSA.etal.Ourmicrobesnotonlyproduceantibiotics,theyalsooverproduceaminoacids[J].Thejournalofantibiotics,2018,71(1):26-36.LOTHARE,MICHAELB.Agiantmarketandapowerfulmetabolism:L-lysineprovidedbyCorynebacteriumglutamicum[J].Appliedmicrobiologyandbiotechnology,2015,99(8):3387-3394.HENDRIKR,REINHARDK,SUSANNEM.Impactofosmoticstressonvolumeregulation,cytoplasmicsolutecompositionandlysineproductioninCorynebacteriumglutamicumMH20-22B[J].Journalofbiotechnology,2003,104(1):87-97.XUJZ,XIAXH,ZHANGJL,etal.Anoverlookedeffectofglycinebetaineonfermentation:preventscaramelizationandincreasestheL-lysineproduction[J].Journalofmicrobiologyandbiotechnology,2014,24(10):1368-1376.⑹陳寧，范曉光?氨基酸生產(chǎn)菌株的研究熱點及發(fā)展動向[J].發(fā)酵科技通訊,2016,45⑴:1-6.王健，路鵬，張昕?氨基酸及衍生物生產(chǎn):生物制造重要組成部分[J].發(fā)酵科技通訊,2016,45⑴:7-11.AKIRAI,RIET,CHIEK,etal.Improvedproductionofl-lysinebydisruptionofstationaryphase-specificrmfgeneinEscherichiacoli[J].Journalofbiotechnology,2005,117(1):111-118.CSONKAL.Physiologicalandgeneticresponsesofbacteriatoosmoticstress[J].Microbiologicalreviews,1989,53(1):121-147.KEMPFB,BREMERE.Uptakeandsynthesisofcompatiblesolutesasmicrobialstressresponsestohigh-osmolalityenvironments[J].Archivesofmicrobiology,1998,170(5):319-330.UNDERWOODS,BUSZKOM,SHANMUGAMK,etal.LackofprotectiveosmolyteslimitsfinalcelldensityandvolumetricproductivityofethanologenicEscherichiacoliKO11duringxylosefermentation[J].Appliedandenvironmentalmicrobiology,2004,70(5):2734-2740.ZHOUS,GRABART,SHANMUGAMK,etal.Betainetripledth