液相色譜應(yīng)化

液相色譜應(yīng)化第1頁，共84頁，2023年，2月20日，星期一§4.1

HPLC

概述一HPLC的優(yōu)點高效：n=3*104片/米高壓:150～350×105Pa

高速:小于1h

應(yīng)用范圍廣（可分析80%有機化合物）

二HPLC的缺點設(shè)備、柱填充劑和流動相比氣相色譜貴，普及應(yīng)用受到限制；定性分析時需要與質(zhì)譜、核磁共振譜及紅外光譜等技術(shù)聯(lián)用第2頁，共84頁，2023年，2月20日，星期一類型功能柱內(nèi)徑粒度柱效能否在線周期輸液方式LC分離1－3cm>100μm低否長常壓HPLC分離分析2－6mm<10μm高能短高壓主要區(qū)別：固定相差別，輸液設(shè)備和檢測手段三HPLC與經(jīng)典LC比較第3頁，共84頁，2023年，2月20日，星期一四HPLC與GC比較相同：兼具分離和分析功能，均可以在線檢測

差別：分析對象，流動相和操作條件的差別1．分析對象

GC：能氣化、熱穩(wěn)定性好、且沸點較低的樣品；占有機物的20%

HPLC：不受樣品揮發(fā)性和熱穩(wěn)定性的限制，分子量大、難氣化、熱穩(wěn)定性差及離子型樣品均可檢測；占有機物的80%第4頁，共84頁，2023年，2月20日，星期一2．流動相差別GC:流動相為惰性氣體，組分與流動相無作用力HPLC:流動相為非惰性液體，流動相與組分間有作用力流動相種類較多，選擇余地廣流動相極性和pH值的選擇也對分離起到重要作用選用不同比例的兩種或兩種以上液體作為流動相可以增大分離選擇性3．操作條件差別

GC：加溫操作

HPLC：室溫；高壓（液體粘度大，峰展寬小）第5頁，共84頁，2023年，2月20日，星期一高效液相色譜儀：高壓輸液系統(tǒng)進樣系統(tǒng)分離系統(tǒng)檢測系統(tǒng)記錄系統(tǒng)§4.2

HPLC儀器工作過程圖第6頁，共84頁，2023年，2月20日，星期一HPLC儀器簡化圖第7頁，共84頁，2023年，2月20日，星期一HPLC儀器實物圖第8頁，共84頁，2023年，2月20日，星期一1高壓輸液系統(tǒng)

（1）溶劑貯存器溶劑貯存器一般由玻璃、不銹鋼或氟塑料制成，容量為1到2L。用來貯存足夠數(shù)量，符合要求的流動相（2）高壓泵

1）對泵的要求：輸出壓力高、流量范圍大、流量恒定、無脈動，流量精度和重復(fù)性為0.5%左右。此外，還應(yīng)耐腐蝕，密封性好

第9頁，共84頁，2023年，2月20日，星期一

2）恒流泵優(yōu)點:流量不受流動相粘度和色譜體系中其余部分阻力變化的影響、易于調(diào)節(jié)控制，死體積小，便于清洗和更換流動相，很適于梯度洗脫缺點:輸出有脈沖波動

類型：機械注射式和機械往復(fù)式，為減小脈動，常用雙泵體系并加脈沖阻尼器單活塞往復(fù)泵雙活塞往復(fù)泵第10頁，共84頁，2023年，2月20日，星期一

3）恒壓泵

優(yōu)點：能供給壓力恒定、無脈動的輸出，并能提供大的輸出流量缺點：液缸體積大，更換流動相不方便，不適用于頻繁更換流動相的選擇合適溶劑的實驗，也不便于梯度洗脫

驅(qū)動氣體進口恢復(fù)氣體進口第11頁，共84頁，2023年，2月20日，星期一（3）在線脫氣裝置在線脫氣裝置用于脫去流動相中的溶解氣體，流動相先經(jīng)過脫氣裝置再輸送到色譜柱，脫氣不好時有氣泡，導(dǎo)致流動相流速不穩(wěn)定，造成基線漂移，噪音增加,也可采用超聲脫氣和真空脫氣第12頁，共84頁，2023年，2月20日，星期一

（4）梯度淋洗在分離過程中使兩種或兩種以上不同極性的溶劑按一定程序連續(xù)改變它們之間的比例，從而使流動相的強度、極性、pH值或離子強度相應(yīng)地變化，達到提高分離效果、縮短分析時間的目的

ABABCC第13頁，共84頁，2023年，2月20日，星期一

梯度洗脫裝置有兩類：A低壓梯度:又稱外梯度，先混合后加壓B高壓梯度:又稱內(nèi)梯度，先加壓后混合第14頁，共84頁，2023年，2月20日，星期一2．進樣裝置

1）隔膜注射進樣：使用微量注射器進樣，裝置簡單、死體積?。坏M樣量小且重現(xiàn)性差

2）高壓定量進樣閥：目前最常用的為六通閥。由于進樣量可由樣品管控制，因此進樣準(zhǔn)確，重復(fù)性好第15頁，共84頁，2023年，2月20日，星期一

3．色譜柱

（1）概述：色譜柱一般用內(nèi)部拋光的不銹鋼（玻璃，鋁，銅）制成，目前常用的標(biāo)準(zhǔn)柱型是內(nèi)徑為4.6或3.9mm，長度為15－30cm的直形不銹鋼柱，填料顆粒度為5－10μm，內(nèi)部充滿微粒固定相，柱溫一般為室溫或接近室溫第16頁，共84頁，2023年，2月20日，星期一（2）柱的填充1）干法：填料粒度大于20μm，在硬臺面上鋪上軟墊，將空柱管上端打開垂直放在軟墊上，用漏斗每次灌入50-100mg填料，然后垂直臺面墩10-20次2）濕法：填料粒度小于20μm(顆粒局部電荷，有很高的表面能傾向聚集)，先將填料調(diào)成勻漿，然后在高壓泵作用下，快速將其壓入裝有洗脫液的色譜柱內(nèi)，經(jīng)沖洗后，即可備用第17頁，共84頁，2023年，2月20日，星期一第18頁，共84頁，2023年，2月20日，星期一柱型內(nèi)徑柱長填料粒度GC填充柱2~6mm2~4m柱內(nèi)徑的1/20-1/25(100μm)GC毛細管柱0.1~0.5mm幾十米~幾百米無填料HPLC色譜柱2~6mm10~50cm5~10μm（3）GC,HPLC色譜柱的比較第19頁，共84頁，2023年，2月20日，星期一4．檢測器（1）對檢測器的要求：靈敏度高，重復(fù)性好、線性范圍寬、死體積小以及對溫度和流量的變化不敏感等（2）檢測器的類型：一類是溶質(zhì)性檢測器，它僅對被分離組分的物理或物理化學(xué)特性有響應(yīng)，屬于此類檢測器的有紫外、熒光、電化學(xué)檢測器等；另一類是總體檢測器，它對試樣和洗脫液總的物理和化學(xué)性質(zhì)響應(yīng)，屬于此類檢測器有示差折光檢測器等第20頁，共84頁，2023年，2月20日，星期一

1）紫外光度檢測器

原理：待測組分對特定波長的紫外光的選擇性吸收，組分濃度與吸光度的關(guān)系遵守比爾定律

第21頁，共84頁，2023年，2月20日，星期一固定波長的紫外可見光檢測器：通常用汞燈的254nm或280nm譜線可調(diào)波長的紫外可見光檢測器：裝有流通池的紫外可見分光光度計，不僅可以選擇適當(dāng)?shù)臋z測波長，還可以記錄組分的紫外吸收光譜，即當(dāng)組分通過流通池時，短時間中斷液流快速掃描（停流掃描），可以得到組分的紫外光譜圖，為定性分析提供信息，或據(jù)此選擇最佳檢測波長第22頁，共84頁，2023年，2月20日，星期一

紫外光度檢測器特點靈敏度高；應(yīng)用范圍廣；流通池可做的很?。?mm×10mm，容積8μL）；對流動相的流速和溫度變化不敏感；波長可選，易于操作；可用于梯度洗脫；溶劑必須能讓所選擇的光透過，即所選波長不能小于溶劑的最低使用波長第23頁，共84頁，2023年，2月20日，星期一

紫外光電二極管陣列檢測器原理采用光電二極管陣列作檢測元件，陣列由200～1000個光電二極管組成，每一個二極管測量一段波長的光譜。具有組分特征吸收的全部波長經(jīng)光柵分光后同時被檢測

由于采用電子學(xué)方法和計算機技術(shù)可以對二極管陣列快速掃描采集數(shù)據(jù)，掃描速率非常快，低于10-2s，遠大于色譜峰流出速率，因此勿需停流掃描即可獲得動態(tài)光譜吸收圖第24頁，共84頁，2023年，2月20日，星期一第25頁，共84頁，2023年，2月20日，星期一紫外光電二極管陣列檢測器第26頁，共84頁，2023年，2月20日，星期一紫外光電二極管陣列檢測器特點同時獲得信號強度值是保留時間和波長的函數(shù)，即獲得三維色譜圖，同時獲得多種信息，使得每個組分在整個波長范圍內(nèi)的光譜信息大大增加，可迅速獲得最佳選擇性和靈敏度的波長第27頁，共84頁，2023年，2月20日，星期一2）熒光檢測器原理：光照射樣品，組分受到激發(fā)躍遷至激發(fā)態(tài)，返回基態(tài)的過程中發(fā)射的譜線，譜線強度與組分含量成正比

第28頁，共84頁，2023年，2月20日，星期一熒光檢測器的特點優(yōu)點：靈敏度高（比紫外檢測器的靈敏度高2個數(shù)量級）、選擇性好（不同物質(zhì)所產(chǎn)生熒光波長不同）、樣品用量少缺點：應(yīng)用范圍小，只能用于在紫外光下能產(chǎn)生熒光的物質(zhì)或能制成熒光衍生物的物質(zhì)，對于不發(fā)熒光的物質(zhì)不能檢測，而且線性范圍較小，通常僅約為1000應(yīng)用：熒光檢測器常用于酶、甾族化合物、維生素、氨基酸以及某些藥物的分析第29頁，共84頁，2023年，2月20日，星期一3）示差折光檢測器原理：利用兩束相同角度的光照射流動相和樣品+流動相，二者對光的折射率不同，折射率之差即表示試樣在流動相中的濃度第30頁，共84頁，2023年，2月20日，星期一優(yōu)點：由于每種物質(zhì)幾乎都有各自不同的折射率，因此都可以用示差折光檢測器來檢測，示差折光檢測器是一種通用型檢測器，對所用物質(zhì)都有響應(yīng)，如同氣相色譜儀的熱導(dǎo)檢測器缺點:(1)靈敏度較低;(2)對溫度和流量變化敏感，必須精確控制溫度和流量;(3)不能用于梯度洗脫。一般用于無紫外吸收的物質(zhì)

第31頁，共84頁，2023年，2月20日，星期一4）電導(dǎo)檢測器

原理：是基于待測物在一些介質(zhì)中電離后所產(chǎn)生的電導(dǎo)變化來測量電離物質(zhì)的含量。電導(dǎo)檢測器的主要部件是電導(dǎo)池

特點：電導(dǎo)檢測器對分子不響應(yīng)，對離子則是通用型的，它對溫度和流量敏感，因此必須嚴(yán)格控制溫度和流量，并且不適用于梯度洗脫第32頁，共84頁，2023年，2月20日，星期一原理：從色譜柱中流出的流動相進入霧化室,在霧化氣體作用下,樣品組分生成氣溶膠，之后溶劑逐漸蒸發(fā)，形成只含溶質(zhì)的微小顆粒，微小顆粒在強光照射下產(chǎn)生光散射,散射光與組分含量成正比5.

蒸發(fā)光散射檢測器第33頁，共84頁，2023年，2月20日，星期一

蒸發(fā)光散射檢測器是質(zhì)量型、通用檢測器，特別適合無紫外吸收的樣品，主要應(yīng)用于糖類、高級脂肪酸、磷脂、維生素、甾類等化合物使用此檢測器條件是組分必須能霧化并且能形成小顆粒,流動相不能含有不揮發(fā)的鹽類第34頁，共84頁，2023年，2月20日，星期一

HPLC一般都帶有數(shù)據(jù)處理系統(tǒng)或色譜工作站，除記錄色譜圖外，還能自動記錄峰的保留時間,自動對峰面積積分5

數(shù)據(jù)記錄和結(jié)果處理系統(tǒng)第35頁，共84頁，2023年，2月20日，星期一

一對流動相的要求（1）純度要高：一般用色譜純試劑，還要進一步純化；使用前要過濾除去微粒以免堵塞；脫氣，以免在柱中或檢測器中產(chǎn)生氣泡而影響分離和檢測§4.3HPLC流動相和固定相

第36頁，共84頁，2023年，2月20日，星期一

（2）與固定相不互溶、不反應(yīng)：即不能使用能引起柱效損失或保留特性變化的溶劑，如吸附色譜法的流動相不能含水，硅膠色譜柱不能用堿性溶劑，液液色譜法中流動相應(yīng)該與固定相互不相溶以免引起固定相流失等（3）溶劑對于試樣要有適宜的溶解度：以免試樣在柱中沉淀而造成堵塞，更換流動相時必須保證互溶第37頁，共84頁，2023年，2月20日，星期一（4）粘度適中：若使用高粘度溶劑，勢必增高壓力，不利于分離，常用的低粘度溶劑有丙酮、乙醇、乙腈等；但粘度過于低的溶劑也不宜采用，例戊烷、乙醚等，它們易在色譜柱或檢測器內(nèi)形成氣泡，影響分離第38頁，共84頁，2023年，2月20日，星期一（5）溶劑要與檢測器匹配

紫外光度檢測器：應(yīng)注意選用檢測器波長比溶劑的紫外截止波長要長

溶劑的紫外截止波長：當(dāng)小于截止波長的輻射通過溶劑時,溶劑對此輻射產(chǎn)生強烈吸收，此時溶劑被看作是光學(xué)不透明的

示差折光檢測器：要求選擇與組分折光率有較大差別的溶劑作流動相，以達最高靈敏度第39頁，共84頁，2023年，2月20日，星期一第40頁，共84頁，2023年，2月20日，星期一二固定相

1.按承受壓力分

剛性固體：SiO2為基質(zhì)，耐壓為7.0×108~1.0×109Pa?？芍瞥芍睆健⑿螤詈涂紫渡疃炔煌念w粒；主要用于吸附、分配和鍵合色譜

硬膠：以聚合物為基質(zhì)(常用苯乙烯與二乙烯苯交聯(lián)而成)，耐壓上限為3.5×108Pa,主要用于離子交換和尺寸排阻色譜第41頁，共84頁，2023年，2月20日，星期一2.按孔隙深度分表面多孔型：以實心玻璃珠為基體，在基體表面覆蓋一層多孔活性材料(如硅膠、氧化鋁、離子交換劑、分子篩、聚酰胺等)。表面多孔型固定相的顆粒大(易裝柱)、多孔層厚度小且孔淺(滲透性好，出峰快)；但交換容量小；適于常規(guī)分離分析全多孔型：全部由硅膠或氧化鋁微粒聚集而成，因顆粒極細，因而孔徑小、傳質(zhì)快、柱效高；特別適于復(fù)雜混合物的分離第42頁，共84頁，2023年，2月20日，星期一第43頁，共84頁，2023年，2月20日，星期一§4.4HPLC主要類型及分離原理

吸附色譜

1原理各組分與流動相分子爭奪吸附劑表面活性中心，利用吸附劑對不同組分的吸附能力差異實現(xiàn)分離第44頁，共84頁，2023年，2月20日，星期一2固定相一般為吸附活性強弱不等的吸附劑：極性吸附劑包括硅膠、氧化鋁、氧化鎂、硅酸鎂、分子篩及聚酰胺等，非極性吸附劑最常見的是活性炭

極性吸附劑可進一步分為酸性吸附劑和堿性吸附劑。酸性吸附劑包括硅膠和硅酸鎂等，適于分離堿，如脂肪胺和芳香胺；堿性吸附劑有氧化鋁、氧化鎂和聚酰胺等，適于分離酸性溶質(zhì)，如酚、羧酸和吡咯衍生物等

第45頁，共84頁，2023年，2月20日，星期一

3流動相在吸附色譜中，選擇流動相主要考慮溶劑的極性，選擇原則是：極性大的試樣需要用極性強的洗脫劑，極性弱的試樣宜用極性較弱的洗脫劑

洗脫劑的極性強弱可用溶劑強度參數(shù)（ε0）來衡量。ε0越大，表示洗脫劑的極性越強。表20-4列出一些常用溶劑在氧化鋁吸附劑中的ε0值。在硅膠吸附劑中ε0值的順序相同，數(shù)值可換算（ε0硅膠=0·77×ε0氧化鋁）

第46頁，共84頁，2023年，2月20日，星期一第47頁，共84頁，2023年，2月20日，星期一4應(yīng)用幾何異構(gòu)體:當(dāng)組分分子結(jié)構(gòu)與吸附劑表面活性中心的剛性幾何結(jié)構(gòu)相適應(yīng)時易于吸附，從而使吸附色譜成為分離異構(gòu)體的有效手段，如農(nóng)藥異構(gòu)體分離

按族分離化合物:不同的官能團具有不同的吸附能，如石油中烷、烯、芳烴的分離對于同系物沒有選擇性，不能用該法分離分子量不同的同系物

第48頁，共84頁，2023年，2月20日，星期一二分配色譜

1原理

根據(jù)各待測物在互不相溶的兩溶液中的溶解度不同，因而具有不同的分配系數(shù)第49頁，共84頁，2023年，2月20日，星期一2流動相

HPLC分析中，為防止固定相的流失，流動相與固定液應(yīng)盡量不互溶，或者說二者的極性相差越大越好因此，根據(jù)流動相與固定相極性的差別程度，可將液液色譜分為正相分配色譜（流動相極性小于固定相極性，極性小的先流出，適于極性組分分離）和反相分配色譜（流動相極性大于固定相極性，極性大的先流出，適于非極性組分分離）第50頁，共84頁，2023年，2月20日，星期一正相色譜法和反相色譜法的區(qū)別如下：

正相色譜中隨流動相極性增強，保留值減小反相色譜中隨流動相極性增強，保留值增大第51頁，共84頁，2023年，2月20日，星期一關(guān)于溶劑的極性，可以用Snyder提出的溶劑極性參數(shù)P’來表示，P’越大，則溶劑的極性越大，P’值可以從手冊上查到，常用溶劑的P’值見下表：溶劑P’溶劑P’正戊烷0.0四氫呋喃4.0正己烷0.1氯仿4.11-氯丁烷1.0乙醇4.3四氯化碳1.6乙酸乙酯4.4甲苯2.4甲乙酮4.7苯2.7丙酮5.1異丙醚2.4甲醇5.1乙醚2.8乙腈5.8二氯甲烷3.1乙酸6.0異丙醇3.9甲酰胺9.6正丙醇4.0水10.2第52頁，共84頁，2023年，2月20日，星期一

如果單一溶劑不能符合要求，可采用混合溶劑作為流動相，以改善分離效果?；旌先軇┑臉O性參數(shù)可以用下式計算：

其中為純?nèi)軇┑臉O性參數(shù)，為溶劑A,B…所占的體積分數(shù)顯然，改變?nèi)軇┑捏w積比可以改變混合溶劑的極性參數(shù)，通常溶劑極性參數(shù)應(yīng)調(diào)節(jié)到使被分離組分的容量因子k在2～5的最佳范圍

第53頁，共84頁，2023年，2月20日，星期一溶劑極性參數(shù)與組分的容量因子之間的關(guān)系為：

對于正相色譜：

對于反相色譜：

其中：k1為混合溶劑極性為P1’時組分的容量因子

k2為混合溶劑極性為P2’時組分的容量因子第54頁，共84頁，2023年，2月20日，星期一例:在一反相色譜柱上,當(dāng)流動相是30%甲醇和70%水時，某組分保留時間25.6min，死時間0.35min。如何調(diào)節(jié)溶劑配比使組分容量因子為5解:開始時可以算出要使k2=5，則根據(jù)即調(diào)整溶劑比例為75%甲醇和25%水時k可以為5第55頁，共84頁，2023年，2月20日，星期一

如果試樣組分的極性范圍較大，可采用梯度洗脫，梯度洗脫時，正相色譜法通常逐漸增大流動相中極性溶劑的比例，而反相色譜法與之相反，逐漸增大極性相對較低的甲醇或乙腈的比例第56頁，共84頁，2023年，2月20日，星期一如何選擇合適的流動相？例如：在正相液－液色譜法中，可先選中等極性的溶劑為流動相，若組分的保留時間太短，表示溶劑的極性太大；改用極性較弱的溶劑，若組分保留時間太長，則溶劑極性太小，然后再在上述兩種溶劑極性之間選擇，如此多次實驗，最后選定最適宜的溶劑第57頁，共84頁，2023年，2月20日，星期一3固定相液液色譜的固定相由載體和固定液組成（1）常用的載體有下列幾類：

1）表面多孔型載體（薄殼型微珠載體），由直徑為3040m的實心玻璃球和厚度約為12m的多孔性外層所組成

2）全多孔型載體，由硅膠、硅藻土等材料制成，直徑3050m的多孔型顆粒

3）全多孔型微粒載體，由nm級的硅膠微粒堆積而成，又稱堆積硅珠，這種載體粒度為510m。由于顆粒小，所以柱效高，是目前使用最廣泛的一種載體

第58頁，共84頁，2023年，2月20日，星期一（2）固定液類型由于液相色譜中，流動相參與選擇作用，流動相極性的微小變化，都會使組分的保留值出現(xiàn)較大的差異；且HPLC固定液易流失，因此常用的只有幾種，按極性由高到低為：,’-氧二丙腈(ODPN)、聚乙二醇(PEM)、十八烷(C18)、角鯊?fù)?SQ)（3）固定液涂漬方法根據(jù)固定液涂漬方法的不同，可將固定相分為機械涂漬型和化學(xué)鍵合型，后者應(yīng)用更為廣泛第59頁，共84頁，2023年，2月20日，星期一

1）機械涂漬固定相：將固定液通過機械混合的方法涂漬到表面多孔型(0.5-1.5%涂布量)或全多孔型載體(5-10%涂布量)上形成的液液色譜固定相為減少固定液的流失，通常在柱前加一根很短的前置柱，該柱涂有與分析柱相同但有更高含量的固定液，使流動相進入分析柱之前，預(yù)先被固定液飽和第60頁，共84頁，2023年，2月20日，星期一機械涂漬的問題：

1選用與固定液不互溶的溶劑作流動相，但在色譜過程中固定液仍會有微量溶解

2流動相經(jīng)過色譜柱的機械沖擊，固定相會不斷流失

3將流動相預(yù)先用固定相液體飽和或在色譜柱前加一個前置柱，但仍難以完全避免固定液的流失該種固定相最大的不足是固定液易流失、分離穩(wěn)定性及重現(xiàn)性差，不適合梯度淋洗第61頁，共84頁，2023年，2月20日，星期一

2）化學(xué)鍵合固定相化學(xué)鍵合固定相是通過化學(xué)反應(yīng)將有機分子鍵合在載體表面所形成的柱填充劑

特點：

傳質(zhì)快，表面無深凹陷，比一般液體固定相傳質(zhì)快；壽命長，化學(xué)鍵合，無固定液流失，耐流動相沖擊，耐水、耐光、耐有機溶劑；選擇性好，可鍵合不同官能團，提高選擇性,有利于梯度洗脫第62頁，共84頁，2023年，2月20日，星期一鍵合相類型第63頁，共84頁，2023年，2月20日，星期一t/min硅膠-烷基鍵合相中烷基鏈長對反相色譜分離的影響1-尿嘧啶；2-苯酚；3-乙酰苯；4-硝基苯；5-苯甲酸甲酯；6-甲苯反相鍵合色譜中，鍵合相碳鏈越長極性越小，分離效果越好C1C8C18第64頁，共84頁，2023年，2月20日，星期一4應(yīng)用

液液色譜是基于化合物中取代基的數(shù)目或性質(zhì)不同，或化合物的相對分子量不同達到分離的。能分析各種不同性質(zhì)的樣品，無論是極性的和非極性的，水溶性和油溶性的，離子型的和非離子型的化合物第65頁，共84頁，2023年，2月20日，星期一

三離子交換色譜

1原理

利用離子交換樹脂上可電離的離子與試樣中待分離的離子進行可逆交換，根據(jù)這些離子對交換劑具有不同的親和力進行分離第66頁，共84頁，2023年，2月20日，星期一2．固定相

（1）薄膜型離子交換樹脂：在載體表面涂漬約1％的離子交換樹脂（2）離子交換鍵合固定相：用化學(xué)反應(yīng)將離子交換基團鍵合在惰性載體表面其中強酸性和強堿性交換樹脂比較穩(wěn)定，pH適用范圍寬，因此應(yīng)用較多第67頁，共84頁，2023年，2月20日，星期一

3流動相離子交換色譜流動相為鹽類緩沖溶液，通過改變pH、緩沖劑類型和離子強度等條件來控制分配比k，改變交換劑的選擇性，進而影響樣品待測物的分離

pH值：影響酸或堿的離解平衡，控制組分離子形式所占的分數(shù)。當(dāng)組分以分子形式存在時，則不被保留；離子分數(shù)越高，保留值越大。常用的有檸檬酸鹽、磷酸鹽、甲酸鹽、乙酸鹽和氨水等第68頁，共84頁，2023年，2月20日，星期一離子強度I：組分保留值受流動相中鹽類總濃度控制。增加外加陰陽離子將降低樣品離子的競爭吸附能力，使組分保留值減小。不同種類的鹽對交換劑的親和能力不同，從而可影響柱的選擇性陰離子的滯留次序:陽離子的滯留次序:第69頁，共84頁，2023年，2月20日，星期一4應(yīng)用

適用無機離子混合物的分離，亦可用于有機物的分離，例如氨基酸、核酸、蛋白質(zhì)等生物大分子。因此，應(yīng)用范圍較廣

離子交換色譜的局限：某些無機離子無紫外吸收，不能采用紫外檢測器進行分析第70頁，共84頁，2023年，2月20日，星期一四離子色譜1原理：與離子交換色譜原理一樣，只是采用電導(dǎo)檢測器檢測，但由于流動相都是強電解質(zhì)，其電導(dǎo)率比待測離子約高2個數(shù)量級，這種強背景電導(dǎo)會完全掩蓋待測離子信號

1975年Small提出，在離子交換柱之后，再串結(jié)一根抑制柱。該柱裝填與分離柱電荷完全相反的離子交換樹脂。通過分離柱后的樣品再經(jīng)過抑制柱，使具有高背景電導(dǎo)的流動相轉(zhuǎn)變?yōu)榈捅尘半妼?dǎo)的流動相，從而可用電導(dǎo)檢測器檢測各種離子的含量第71頁，共84頁，2023年，2月20日，星期一例如：分析陽離子時，以無機酸為流動相，抑制柱為高容量的強堿性陰離子交換樹脂，則發(fā)生下列反應(yīng)：R+—OH+HCl(流動相)——R+—Cl-+H2OR+—OH+MCl(待測物)——R+—Cl-+M+OH-由反應(yīng)可見：經(jīng)抑制柱后，一方面將大量酸轉(zhuǎn)變?yōu)殡妼?dǎo)很小的水，消除了流動相本底電導(dǎo)的影響。同時，又將樣品陽離子M+轉(zhuǎn)變成相應(yīng)的堿，由于OH-離子的淌度為Cl-離子的2.6倍，提高了所測陽離子電導(dǎo)的檢測靈敏度。對于陰離子樣品也有相似的作用機理第72頁，共84頁，2023年，2月20日，星期一

該法的不足之處：抑制柱要定期再生、譜峰在經(jīng)過抑制柱后會展寬，降低分離度因此有人提出了使用電導(dǎo)率很低的溶液(如苯甲酸鹽稀溶液)作流動相稱為非抑制型離子色譜或單柱離子色譜第73頁，共84頁，2023年，2月20日，星期一2離子色譜的固定相：離子交換樹脂3離子色譜的流動相：鹽類緩沖溶液4離子色譜的應(yīng)用：離子或可離解的化合物，不僅可應(yīng)用于無機離子的分離，也可用于有機離子和糖類、氨基酸等生物大離子第74頁，共84頁，2023年，2月20日，星期一五離子對色譜原理:將一種（或數(shù)種）與溶質(zhì)離子電荷相反的離子（稱對離子或反離子）加到流動相或固定相中，使其與溶質(zhì)離子結(jié)合形成疏水性離子對，從而控制溶質(zhì)離子保留行為的一種色譜法固定相：加入對離子的分配或吸附色譜固定相流動相：加入對離子的分配或吸附色譜流動相第75頁，共84頁，2023年，2月20日，星期一陽離子/有機堿分析:烷基磺酸鈉，如己烷磺酸鈉作為對離子陰離子/有機酸分析:季胺鹽，如氫氧化四丁基銨或氫氧化十六烷基三甲銨作為對離子反相離子對色譜：通常采用非極性的固定相如十八烷基鍵合相，用含有對離子的甲醇－水（或乙腈－水）作為流動相

應(yīng)用：強極性的有機酸和有機堿第76頁，共84頁，2023年，2月20日，星期一

六尺寸排阻色譜法

1原理：利用被測組分分子大小不同、在固定相上選擇性滲透（有機相），過濾（水相）實現(xiàn)分離第77頁，共84頁，2023年，2月20日，星期一2排阻色譜固定相：凝膠（1）軟質(zhì)凝膠，如葡聚糖凝膠、瓊脂糖凝膠，適用于水作流動相，機械強度較小，只能在常壓下使用（2）半硬質(zhì)凝膠，如交聯(lián)聚苯乙烯,是應(yīng)用最多的有機凝膠，比軟質(zhì)凝膠稍耐壓，是親油性的，宜用有機溶劑作流動相，能耐較高壓力，流速不宜大（3）硬質(zhì)凝膠，如多孔硅膠、多孔玻璃，其特點是化學(xué)穩(wěn)定性、熱穩(wěn)定性、機械強度都較好，可在柱中直接更換溶劑，在較高壓力和較高流速下操作，缺點是有吸附活性，需要進行特殊處理第78頁，共84頁，2023年，2月20日，星期一3排阻色譜流動相

必須能溶解樣品，并必須與凝膠本身非常相似，這樣才能潤濕凝膠。當(dāng)采用軟性凝膠時，溶劑也必須能溶脹凝膠，常用的流動相有四氫呋喃、甲苯、氯仿、二甲基酸胺和水等4排阻色譜的應(yīng)用分子量大于2000（到8×105）的化合物；合適的條件下，也可以分離分子量小于100的化合物第79頁，共84頁，2023年，2月20日，星期一5尺寸排阻色譜的特點：（1）保留時間是分子尺寸的函數(shù)，有可能提供分子結(jié)構(gòu)的某些信息（2）保