(16)-24常用分子生物學技術(shù)原理及應(yīng)用

第二十四章常用分子生物學技術(shù)的原理及應(yīng)用ThePopularTechnologyinMolecularBiology:PrincipleandApplication分子雜交與印跡技術(shù)

MolecularHybridization&BlottingTechnology第一節(jié)DNA變性的本質(zhì)是雙鏈間氫鍵的斷裂例：變性引起紫外吸收值的改變DNA的紫外吸收光譜增色效應(yīng)：DNA變性時其溶液A260增高的現(xiàn)象。熱變性解鏈曲線：如果在連續(xù)加熱DNA的過程中以溫度對A260（absorbance，A，A260代表溶液在260nm處的吸光率）值作圖，所得的曲線稱為解鏈曲線。

Tm：(meltingtemperature)

變性是在一個相當窄的溫度范圍內(nèi)完成,在這一范圍內(nèi)，紫外光吸收值達到最大值的50%時的溫度稱為DNA的解鏈溫度，又稱融解溫度。其大小與G+C含量成正比。

DNA的復性

復性(renaturation):在適當條件下，變性DNA的兩條互補鏈可恢復天然的雙螺旋構(gòu)象。退火(annealing):

熱變性的DNA經(jīng)緩慢冷卻后即可復性復性條件：Tm－50C

熱變性的DNA迅速冷卻至4度以下幾乎不能發(fā)生復性（一）核酸分子雜交

(nucleicacidhybridization)在DNA復性過程中，把不同DNA單鏈分子放在同一溶液中，或把DNA與RNA放在一起，只要在DNA或RNA的單鏈分子之間有一定的堿基配對關(guān)系，就可以在不同的分子之間形成雜化雙(heteroduplex)

。一、分子雜交與印跡技術(shù)的原理DNA-DNA雜交雙鏈分子變性

復性不同來源的DNA分子核酸分子雜交(hybridization)

復性RNADNA1.原理變性與復性2.常見條件：加熱

S形曲線解鏈溫度（Tm）

A260增高的原因3.分子雜交的目的

核酸分子雜交的應(yīng)用研究DNA分子中某一種基因的位置鑒定兩種核酸分子間的序列相似性檢測某些專一序列在待檢樣品中存在與否是基因芯片技術(shù)的基礎(chǔ)（二）探針技術(shù)

探針(probe)一小段用同位素、生物素或熒光染料標標記其末端或全鏈的已知序列的多聚核苷酸，與固定在NC膜上的核苷酸結(jié)合，判斷是否有同源的核酸分子存在。

探針標記方法:放射性：32P、35S和3H

非放射性：生物素、地高辛素、熒光素

(FITC、羅丹明)二、印跡技術(shù)（印跡雜交）

將在凝膠中分離的生物大分子轉(zhuǎn)移（印跡）或直接放在固定化介質(zhì)上并加以檢測分析的技術(shù)。應(yīng)用于DNA、RNA、蛋白質(zhì)檢測電轉(zhuǎn)移印跡技術(shù)、真空吸引轉(zhuǎn)移印跡※印跡技術(shù)的分類及應(yīng)用（一）DNA印跡技術(shù)(Southernblotting)

用于基因組DNA、重組質(zhì)粒和噬菌體的分析。（二）RNA印跡技術(shù)(Northernblotting)

用于RNA的定性定量分析。

其他斑點印跡(dotblotting)原位雜交(insituhybridization)DNA點陣(DNAarray)

DNA芯片技術(shù)(DNAchip)（三）蛋白質(zhì)的印跡分析(Westernblotting)

用于蛋白質(zhì)定性、定量及相互作用的研究。

（一）DNA印跡技術(shù)

(Southernblotting)

用于基因組DNA、重組質(zhì)粒和噬菌體的分析。從組織或細胞中提取基因組DNA→限制性內(nèi)切酶消化→瓊脂糖凝膠電泳將DNA按大小分離→含有DNA區(qū)帶的凝膠在變性溶液中變性→DNA變性后從凝膠轉(zhuǎn)移到固相支持物上→特異性探針與固著于膜上的DNA雜交→雜交結(jié)果反映待測核酸樣品的有關(guān)基因信息。Southern印跡法DNA分子限制片段限制性酶切割瓊脂糖電泳轉(zhuǎn)移至硝酸纖維素膜上與放射性標記DNA探針雜交放射自顯影帶有DNA片段的凝膠凝膠濾膜用緩沖液轉(zhuǎn)移DNA吸附有DNA片段的膜（二）RNA印跡技術(shù)

(Northernblotting)

基本過程與Southernblotting相似。用于RNA的定性定量分析。（三）蛋白質(zhì)的印跡分析(Westernblotting)

用于蛋白質(zhì)定性定量及相互作用研究。常用抗體來檢測蛋白質(zhì)，也被稱為免疫印跡技術(shù)?？侩娹D(zhuǎn)移將蛋白質(zhì)從凝膠轉(zhuǎn)移到膜上。實驗操作

1細胞裂解物的準備；

2細胞裂解物的蛋白定量；

3細胞裂解物的SDS；

4蛋白質(zhì)的轉(zhuǎn)移；

6目的蛋白質(zhì)的檢測。蛋白質(zhì)免疫印跡法蛋白質(zhì)免疫印跡法免疫印跡只能檢測目的蛋白的相對含量測定相對含量時，需要內(nèi)參照選擇合適的反應(yīng)條件：SDS膠濃度；轉(zhuǎn)移膜的選擇；轉(zhuǎn)移時間的選擇注意電極的正負極抗體反應(yīng)時，注意驅(qū)除反應(yīng)袋內(nèi)氣泡操作要輕柔。蛋白質(zhì)免疫印跡法三種印跡技術(shù)的比較放射自顯影照片DNA點陣聚合酶鏈反應(yīng)

PolymeraseChainReaction

第二節(jié)回顧體內(nèi)DNA復制的條件？模板引物原料：dNTPDNA聚合酶PCR概述概念：在模板、引物、4種dNTP和耐熱DNA聚合酶存在的條件下，特異性地擴增位于兩段已知序列之間的DNA區(qū)段的酶促合成反應(yīng)。

PCR類似于DNA在細胞內(nèi)的復制過程，可以將微量目的基因擴增一百萬倍以上。PolymeraseChainReaction

（PCR）微量目的DNA片段擴增到100萬倍以上。

1985年，美國PECetus公司的KaryMullis（凱利.穆利斯）建立了PCR技術(shù)，使人們能夠通過試管內(nèi)的數(shù)小時反應(yīng)將特定的DNA片段擴增數(shù)百萬倍，KaryMullis因此獲1993年度諾貝爾化學獎。

聚合酶鏈反應(yīng)

(PolymeraseChainReaction，PCR)

PCR的發(fā)展1983.04萌發(fā)PCR構(gòu)思1983.08首次做有關(guān)PCR原理報告1984.11獲得與預期DNA相符的擴增量1985.03.28申請了有關(guān)PCR的第一個專利1987.06有關(guān)PCR的主要專利被批準1988第一個試劑盒和自動PCR儀相繼上市意義：20世紀最偉大的發(fā)明之一，具有劃時代意義，DNA合成擺脫了活體生物的依賴性，成為常規(guī)技術(shù)。

PCR的顯著特征應(yīng)用領(lǐng)域極其廣泛

實驗研究：克隆基因、DNA序列分析、獲得定點突變的DNA片段、測定染色體上兩個位點之間的重復值以繪制基因圖等。

臨床應(yīng)用：病毒性病原體的檢測、遺傳性疾病的產(chǎn)前診斷等?；窘M分耐熱DNA聚合酶Buffer-Mg2+dNTPs模板特異性引物※一、PCR反應(yīng)體系TaqDNA聚合酶：

水生棲熱菌(thermusaquaticus,Taq)

的DNA聚合酶

作用：

①5′3′

DNA聚合酶活性；②無3′5′外切酶活性，35輪0.25%錯配，與原始模板有差別

耐熱DNA聚合酶最適溫度：

72℃，選擇72℃延伸半衰期：92.5℃130min95℃40min97.5℃5～6min

延伸溫度（72℃）≤95℃使其在整個擴增循環(huán)中保持足夠活性pfuDNA聚合酶作用：5′3′DNA聚合酶活性

3′→5′外切酶活性優(yōu)點：耐熱、精確度pfu>Taq不足：但pfu擴增效率通常比Taq酶略差文獻報道：Taq+pfu

會起到較好效果

現(xiàn)階段的耐熱DNA聚合酶Taq酶快速擴增Taq熱啟動Taq高保真DNA聚合酶Real-TimeTaq超長鏈Taq引物特點引物(primer)與模板特異結(jié)合。5′3′3′5′（2）引物(primer)長度在15-30bpATCG5′－TAGTTATTGCTCAGCGGTGGCAGCAGCCAACTCAGCTTCCTTTCGGGCTTTGTTAGCAGCCGGATCTCAGTGGTGGTGGTGGTGGTGCTCGAGTGCGGCCGCAAGCTTGTCGACGGAGCTCGAATTCGGATCCGAAGGCCATAATCACTTTCTTAGCGAATGGGGGGAGCTCTGTAGTAAGCAGGAACAGTTGCAGGGAAGAACAATAGGGAAAATAATTCCAGATGCACCCAAAATCAATCT－3′引物特點XXXXXX(1/4)1(1/4)2(1/4)3nX…………….………(1/4)n引物長度大于15時，引物出現(xiàn)的幾率小于(1/4)15

可以保證模板與引物結(jié)合的特異性難點引物本身不要出現(xiàn)內(nèi)部互補序列，形成loop環(huán)，內(nèi)部二級結(jié)構(gòu)。如：5

′GGGTCGATTCCTACCCATGC3′(3)避免引物(primer)內(nèi)部互補序列CCTACCCATGCAGCTGGG5′3′引物特點

避免兩引物間的互補，特別是3'端互補，以免形成二聚體。(4)避免兩引物(primer)間互補如：5′TACCCATGCATGGAGTC3′

3′GGGTCTATCAGTAAGC5′引物特點引物濃度一般0.1～1μmol/L

濃度過高會使引物聚合或使非特異擴增。(5)引物(primer)濃度：可在引物的5′端引入限制性酶切位點、ATG起始位點等。(6)可在5′端修飾引物特點http//www.BCMSearchL軟件

Primerpremier5.0軟件

dnadmo25可以設(shè)計引物的網(wǎng)頁和網(wǎng)站http://www.ebi.ac.uk/cgi-bin/進展特異性引物進展引物特點小結(jié)引物與模板要特異結(jié)合；(2)引物長度在15-30bp；(3)避免引物內(nèi)部互補序列；(4)避免兩引物間互補；(5)引物濃度：μmol/L；(6)可在5′端修飾。

引物設(shè)計有五點，個數(shù)二十為最好；5′不嚴3′嚴，umol/L要記牢；引物之間無交叉，自身互補不能要；網(wǎng)上查詢特異性，PCR一定能做好！巧記口訣引物特點模板1.RNA2.DNAmRNA→逆轉(zhuǎn)錄→cDNA質(zhì)粒噬菌體染色體DNA模板的組成模板1.變性難度2.模板用量克隆DNA:ng級染色質(zhì)DNA:ug級克隆DNA

<染色體DNA注意事項防止交叉污染dNTP底物四種脫氧核苷酸：基本原料終濃度：50umol/L注意：不穩(wěn)定，保存時間長會失效緩沖液1、組成：Tris-HCl、KCl、MgCl2、明膠、甲酰胺。２、關(guān)鍵為Mg2+

：影響酶活性與精確度以及產(chǎn)物的特異性。出現(xiàn)非特異性條帶，改變鎂離子濃度Mg2+

TaqDNA聚合酶作用時需要Mg2+

不同的酶需不同Mg2+外界影響：

EDTA鰲合Mg2+∴選較低濃度TE(10mMTris,1mMEDTA)；

DNA模板、引物和dNTP的磷酸基團均可與Mg2+

結(jié)合，降低Mg2+有效濃度。∴如果擴增產(chǎn)物或效率不理想，要注意調(diào)整合適的Mg2+濃度

（1）變性溫度：94-95℃

GC比例高、長度很長，T↑

（2）退火：溫度越高，擴增特異性越好取決于Tm值：Tm↑退火T↑；Tm↓退火T↓若Tm較高，可使退火和延伸在同一溫度（3）延伸：

500nt1min500nt－－3min一般：40－60sec6.溫度二、PCR技術(shù)的工作原理變性95?C延伸72?C退火Tm-5?C※

二、PCR技術(shù)的工作原理1、變性：將反應(yīng)體系加熱至95℃

，使模板DNA完全變性成為單鏈；2、退火：將溫度下降至適宜溫度（一般較Tm低5℃），使引物與模板DNA結(jié)合；3、延伸：將溫度升至72℃

，DNA聚合酶以

dNTP為底物催化DNA的合成反應(yīng)。上述三個步驟為一個循環(huán)，經(jīng)25~30次循環(huán)后，可將模板DNA擴增達百萬倍。模板DNAPCR的基本原理PCR反應(yīng)條件PCR過程PCR的特點95℃50℃引物1引物2DNA引物PCR的基本原理PCR反應(yīng)條件PCR過程PCR的特點50℃引物1引物2DNA引物72℃Taq酶Taq酶PCR的基本原理PCR反應(yīng)條件PCR過程PCR的特點第1輪結(jié)束95℃第2輪開始PCR的基本原理PCR反應(yīng)條件PCR過程PCR的特點95℃50℃72℃TaqTaqTaqTaqPCR的基本原理PCR反應(yīng)條件PCR過程PCR的特點72℃第2輪結(jié)束5Primer15Primer2Cycle2Cycle155

55

5

5TemplateDNA55

555

5

55基本工作原理Cycle355

555

5

555

5

55

555

525～30次循環(huán)后，模板DNA的含量可以擴大100萬倍以上。PCRCycle反應(yīng)步驟變性（Denaturation）

:

雙鏈DNA在95oC解鏈。退火（Annealing）

:引物與DNA相結(jié)合。65-40oC延伸（Extension）

:新雙鏈DNA在72oC合成。循環(huán)1次2個循環(huán)2次4個循環(huán)3次8個基因擴增過程理論上原始1個=20循環(huán)1次2個=21循環(huán)2次4個=22循環(huán)3次8個=23……………循環(huán)N次2n實際上：25～30次循環(huán)后，模板DNA的含量可以擴大100萬倍以上。y=2xPCR的特點靈敏度高

擴增量達230個拷貝（109拷貝）簡便、快速一次性加好反應(yīng)液，2～4小時完成擴增擴增產(chǎn)物一般用電泳分析對標本的純度要求低血液、體腔液、洗嗽液、毛發(fā)、細胞、活組織等組織的粗提DNA特異性強小結(jié)1.PCR反應(yīng)基本原理變性退火延伸

95oC65-40oC72oC2.PCR體系基本組成成分模板、引物、dNTP、緩沖液Mg2+、耐熱DNA聚合酶3.PCR循環(huán)次數(shù)25～30次（一）目的基因的克隆（二）基因的體外突變（三）DNA和RNA的微量分析（四）DNA序列測定（五）基因突變分析三、PCR技術(shù)的主要用途四、幾種重要的PCR衍生技術(shù)（一）反轉(zhuǎn)錄PCR技術(shù)（二）原位PCR技術(shù)（三）實時PCR技術(shù)

利用實時熒光定量PCR的原理，對DNA靶分子的起始拷貝數(shù)進行定量的核酸檢測系統(tǒng)。該方法精確、靈敏、污染途徑小。是國際公認的核酸分子定量的標準方法。它是在PCR體系中加入熒光基團，利用熒光信號積累實時檢測整個PCR過程，最后通過標準曲線對未知模板進行定量分析的方法。它已逐漸代替了Northerblot以及semiRT-PCR技術(shù)。Real-timePCR實時PCR技術(shù)原理第三節(jié)

核酸序列分析

NucleicAcidSequenceAnalysis核酸序列分析的基本原理化學裂解法(Maxam-Gillbert法)DNA鏈的末端合成終止法(sanger法)DNA測序的基本戰(zhàn)略

設(shè)法產(chǎn)生帶標記的不同長度的成套DNA片段，各帶有標記的片段起點相同、終點不同，使待測的DNA鏈中的相應(yīng)每個核苷酸處都有斷裂或終止。通過PAGE電泳，能夠?qū)⑾嗖钜粋€核苷酸的DNA片段分開，放射自顯影后，根據(jù)長短排列，根據(jù)特定末端堿基的DNA片段就可讀出待測DNA的堿基序列。

酶法化學法測序技術(shù)進展酶法序列分析的原理

酶反應(yīng)電泳方向模板CCGGTAGCAACT3′5′GG5′3′引物dATPdCTPdGTPdTTP+ddATPdATPdCTPdGTPdTTP+ddTTPdATPdCTPdGTPdTTP+ddGTPdATPdCTPdGTPdTTP+ddCTPGGCCAGGCCATCGTTGAGGCGGCCGGCCATCGGCCATCGTTGGGCCATCGGGCCATGGCCATCGTGGCCATCGTTACGTAGTTGCTACC3′5′TCAACGATGG5′3′讀出模板互補序列讀出模板序列GGCCATCGTTGAGGCCATCGTGGCCATCGTTGGGCCATCGTTGGCCATCGGGCCATCGGCCAGGCCATGGCCGGCDNA的Sanger測序法

(酶法)

讀出模板互補序列dNTP

凝膠電泳

較大片段

較小片段ddGTPddATPddCTPddTTP

反應(yīng)混合物Klenow酶

未知序列的單鏈DNA

讀出待測序列CTGACTTCGACAAAGAA5′3′

放射性標記的引物TGTTACTGddGddGddGddGGACTGAAGCTGTT3′5′CTGACTTCGACAA5′3′DNA的測序儀示意圖computeranalysis凝膠中DNA移動方向樣品槽激光器輸入光學系統(tǒng)成象透鏡聚焦透鏡高靈敏度相機旋光鏡/棱鏡組件DNA的化學測序示意圖

反應(yīng)試劑G反應(yīng)：硫酸二甲酯G+A反應(yīng)：甲酸T+C反應(yīng)：肼C反應(yīng)：NaCl+肼一、化學裂解法(Maxam-Gillbert法)基本原理基于某些化學試劑可以使DNA鏈在1個或2個堿基處發(fā)生專一性斷裂的特性，精確地控制反應(yīng)強度，使一個斷裂點僅存在于少數(shù)分子中，不同分子在不同位點斷裂，從而獲得一系列大小不同的DNA片段，將這些片段經(jīng)電泳分離。分析前，用同位素標記DNA的5′末端，經(jīng)放射自顯影即可在X膠片上讀出DNA鏈的序列。二、DNA鏈末端合成終止法三、DNA自動測序采用熒光替代放射性核素標記是實現(xiàn)DNA序列分析自動化的基礎(chǔ)。用不同熒光分子標記四種雙脫氧核苷酸，然后進行Sanger測序反應(yīng)，反應(yīng)產(chǎn)物經(jīng)電泳（平板電泳或毛細管電泳）分離后，通過四種激光激發(fā)不同大小DNA片段上的熒光分子使之發(fā)射出四種不同波長熒光，檢測器采集熒光信號，并依此確定DNA堿基的排列順序。DNA自動測序結(jié)果舉例基因文庫

GeneLibrary第四節(jié)基因組DNA文庫

(genomicDNAlibrary)cDNA文庫

(cDNAlibrary)基因文庫

(genelibrary)是指一個包含了某一生物體全部DNA序列的克隆群體?；蚪MDNA文庫第一輪篩選第二輪篩選第三輪篩選基因組文庫篩選結(jié)果舉例cDNA文庫是包含某一組織細胞在一定條件下所表達的全部mRNA經(jīng)逆轉(zhuǎn)錄而合成的cDNA序列的克隆群體，它以cDNA片段的形式貯存著該組織細胞的基因表達信息。二、cDNA文庫

第五節(jié)

生物芯片技術(shù)BiologicalChipTechnology是指將許多特定的DNA片段或cDNA片段作為探針，有規(guī)律地緊密排列固定于單位面積的支持物上，然后與待測的熒光標記樣品進行雜交，雜交后用激光共聚焦熒光檢測系統(tǒng)等對芯片進行掃描，通過計算機系統(tǒng)對每一探針位點的熒光信號做出檢測、比較和分析，從而迅速得出定性和定量的結(jié)果。一、基因芯片(genechip)目錄基因芯片技術(shù)原理是將高度密集排列的蛋白分子作為探針點陣固定在固相支持物上，當與待測蛋白樣品反應(yīng)時，可捕獲樣品中的靶蛋白，再經(jīng)檢測系統(tǒng)對靶蛋白進行定性和定量分析的一種技術(shù)。二、蛋白質(zhì)芯片第六節(jié)生物大分子相互作用研究技術(shù)

TheMethodofProtein-proteinandProtein-DNAInteractionStudy一、蛋白質(zhì)相互作用研究技術(shù)酵母雙雜交各種親和分析（標簽蛋白沉淀、免疫共沉淀等）熒光共振能量轉(zhuǎn)換效應(yīng)分析噬菌體顯示系統(tǒng)篩選常用蛋白質(zhì)相互作用的研究技術(shù)標簽融合蛋白結(jié)合實驗是一個基于親和色譜原理的、分析蛋白質(zhì)體外直接相互作用的方法。（一）標簽蛋白沉淀標簽融合蛋白結(jié)合實驗主要用于證明兩種蛋白分子是否存在直接物理結(jié)合、分析兩種分子結(jié)合的具體結(jié)構(gòu)部位及篩選細胞內(nèi)與融合蛋白相結(jié)合的未知分子。標簽融合蛋白沉淀實驗流程示意圖（二）酵母雙雜交技術(shù)的基本原理和用途酵母雙雜交系統(tǒng)的應(yīng)用證明兩種已知基因序列的蛋白質(zhì)可以相互作用的生物信息學推測。分析已知存在相互作用的兩種蛋白質(zhì)分子的的相互作用功能結(jié)構(gòu)域或關(guān)鍵的氨基酸殘基。將擬研究的蛋白質(zhì)的編碼基因與BD基因融合成為“誘餌”表達質(zhì)粒，可以篩選AD基因融合的“獵物”基因表達文庫，篩選未知的相互作用蛋白質(zhì)。電泳遷移率變動測定(electrophoreticmobilityshiftassay，EMSA)或稱凝膠遷移變動實驗(gelshiftassay)最初用于研究DNA結(jié)合蛋白與相應(yīng)DNA序列間的相互作用，可用于定性和定量分析，已經(jīng)成為轉(zhuǎn)錄因子研究的經(jīng)典方法。目前這一技術(shù)也被用于研究RNA結(jié)合蛋白和特定RNA序列間的相互作用。二、DNA-蛋白質(zhì)相互作用分子分析技術(shù)（一）電泳遷移率變動測定放射自顯影未結(jié)合探針結(jié)合有蛋白的探針標記探針1X1X1X1X核蛋白提取物1X10X10X未標記探針10X凝膠遷移實驗結(jié)果示意圖染色質(zhì)免疫沉淀技術(shù)(chromatinimmunoprecipitationassay,ChIP)是目前可以研究體內(nèi)DNA與蛋白質(zhì)相互作用的主要方法。（二）染色質(zhì)免疫沉淀法染色質(zhì)免疫沉淀實驗流程及結(jié)果示意圖遺傳修飾動物模型的建立及應(yīng)用TheEstablishmentandApplicationofHeredity-ModifiedAnimalModel第七節(jié)轉(zhuǎn)基因技術(shù)采用基因轉(zhuǎn)移技術(shù)使目的基因整合入受精卵細胞或胚胎干細胞，然后將細胞導入動物子宮，使之發(fā)育成個體。

轉(zhuǎn)基因——被導入的目的基因轉(zhuǎn)基因動物(transgenicanimal)——目的基因的受體動物一、轉(zhuǎn)基因技術(shù)核轉(zhuǎn)移技術(shù)

即動物整體克隆技術(shù)，將動物的一個體細胞核全部導入另一個體的去胞核的的激活的卵細胞內(nèi)，使之發(fā)育成個體，即克隆(clone)。二、核轉(zhuǎn)移技術(shù)基因剔除技術(shù)(geneknockout)也稱基因靶向(genetargeting)滅活，有目的去除動物體內(nèi)某種基因的技術(shù)。三、基因剔除技術(shù)將滅活的基因放入胚胎干細胞(embryonicstemcell，ES)中，使這一滅活基因通過同源重組取代原有的目的基因，篩選到基因已定點滅活的細胞后，通過顯微注射將細胞注入小鼠囊胚中。細胞在小鼠囊胚中參與胚胎的發(fā)育，最終形成嵌合體小鼠。操作方式建立動物模型①單基因決定疾病模型基因剔除獲得性突變(gain-of-functionmutation)②多基因決定疾病模型四、基因轉(zhuǎn)移和基因剔除在醫(yī)學發(fā)展中的作用疾病相關(guān)基因的

克隆與鑒定

CloningandIdentificationofDiseaseRelativeGenes第八節(jié)克隆疾病相關(guān)基因的策略（一）功能性克隆(functionalcloning)（二）定位克隆(positionalcloning)（三）非定位候選基因克隆策略(position-independentcandidategeneapproaches)（四）定位候選基因克隆策略(positionalcandidategeneapproaches)定義

從對一種致病基因的功能的了解出發(fā)，克隆該致病基因。（一）功能性克隆應(yīng)用

生化機制已明確、基因表達產(chǎn)物較易得到部分純化的遺傳性疾病?？寺》绞?/p>

①利用特異性抗體篩選表達型cDNA文庫；

②根據(jù)已知的部分氨基酸序列合成寡核苷酸作探針，篩選cDNA文庫。功能互補試驗(functionalcomplementationassay)利用酵母系統(tǒng)從功能學角度鑒定致病基因。

（二）定位克隆定義從一種致病基因的染色體定位出發(fā)逐步縮小范圍，最后克隆該基因。系統(tǒng)的定位克隆工作①

遺傳學分析(確定致病基因染色體定位)交換分析、連鎖不平衡分析②分子生物學分析染色體異常(缺失、易位等)分析、基因文庫的篩選與基因克隆（三）非定位候選基因克隆策略

由于基因組作圖的完成和分子病理學的發(fā)展，人們可以不依靠染色體定位，直接根據(jù)病理學變化和對各種基因產(chǎn)物功能的了解，預測出候選致病基因。（四）定位候選基因克隆策