動物細胞工程制藥

動物細胞工程制藥張忠山生命科學(xué)學(xué)院動物細胞工程制藥一、概述二、動物細胞的形態(tài)和生理特點三、生產(chǎn)用動物細胞的要求和獲得四、動物細胞的培養(yǎng)條件和培養(yǎng)基五、動物細胞培養(yǎng)的方法和操作方式六、動物細胞生物反應(yīng)器及其檢測控制系統(tǒng)七、動物細胞制藥的前景和展望動物細胞工程制藥第一節(jié)概述（1）發(fā)現(xiàn)細胞和細胞學(xué)說創(chuàng)立。1665年英國物理學(xué)家Hooke通過自制的顯微鏡觀察切成薄片的軟木時看到死細胞的細胞壁。（2）組織培養(yǎng)或細胞培養(yǎng)。1885年德國生理鹽水培養(yǎng)雞胚組織，至1907年，細胞體外培養(yǎng)宣布進入一個新時代。動物細胞工程制藥（3）細胞工程學(xué)時代。對細胞進行人工改造及培養(yǎng)以使其為人類服務(wù)的時代，包括真核細胞的基因重組、導(dǎo)入、擴增和表達的理論和技術(shù)，細胞融合的理論和技術(shù)，細胞器特別是細胞核移植的理論和技術(shù)，染色體改造的理論和技術(shù)，轉(zhuǎn)基因動、植物的理論和技術(shù)，細胞大量培養(yǎng)的理論和技術(shù)，以及產(chǎn)物分離純化的理論和技術(shù)。（4）細胞工程制藥成為現(xiàn)代制藥技術(shù)中常用的手段。動物細胞工程制藥應(yīng)用領(lǐng)域生產(chǎn)藥品：作為宿主細胞表達生產(chǎn)原核細胞所不能生產(chǎn)的藥用蛋白?；A(chǔ)研究的細胞材料：細胞模型種子細胞：為組織修復(fù)與器官再生提供種子細胞。動物細胞工程制藥第二節(jié)動物細胞的

形態(tài)和特點一、動物細胞的形態(tài)二、動物細胞的生理特點動物細胞工程制藥

一、動物細胞的形態(tài)細胞的分化（或特化）形態(tài)分化在離體培養(yǎng)同樣也存在。離體培養(yǎng)的細胞分為兩類：貼壁依賴型（anchorage-dependent）和非貼壁依賴型（anchorage-independent），前者可簡稱為貼壁細胞，后者可簡稱為懸浮細胞。動物細胞工程制藥動物細胞結(jié)構(gòu)圖動物細胞工程制藥1、貼壁細胞

特點：支持物兩種形態(tài)，即成纖維樣細胞型或上皮樣細胞型。前者主要來源于中胚層組織的細胞，生長時呈放射狀、旋渦狀或火焰狀走行；后者主要來源于外胚層和內(nèi)胚層組織的細胞，生長時彼此緊密連接成單層細胞片。動物細胞工程制藥動物細胞工程制藥動物細胞工程制藥2、懸浮細胞這類細胞的生長不依賴支持物表面，可在培養(yǎng)液中呈懸浮狀態(tài)生長，如血液的淋巴細胞和用以生產(chǎn)干擾素的Namalwa細胞等，細胞呈圓形。

動物細胞工程制藥3、兼性貼壁細胞

兼具上述兩種生長方式的細胞，稱為兼性貼壁細胞，如CHO細胞、小鼠L929細胞。當它們貼附在支持物表面上生長時呈上皮或成纖維細胞的形態(tài)，而當懸浮于培養(yǎng)基中生長時則呈圓形，但有時它們可相互支持貼附在一起生長。動物細胞工程制藥

二、動物細胞的生理特點1、細胞的分裂周期長一般為12~48h，細胞分裂周期=間期（G1期+S期+G2期）+分裂期（M期）

G1期：凡細胞無增殖活動時皆滯留在G1期

S

期：DNA的合成，一般為6~8小時動物細胞工程制藥G2期：DNA量加倍，RNA合成和染色體螺旋化，持續(xù)時間短，一般為2~5h。M期：一般持續(xù)時間很短，僅0.5~1h。相當于有絲分裂的中后期和末期，主要是染色體的變化、分裂，并形成子細胞。細胞分裂代數(shù)與培養(yǎng)中的代數(shù)及相互關(guān)系。動物細胞工程制藥動物細胞工程制藥2、細胞生長需貼附于基質(zhì)，并有接觸抑制現(xiàn)象大多數(shù)正常二倍體（dipoid）細胞的生長都需要一定的基質(zhì)（如玻璃，塑料等）上貼附，伸展后才能生長增殖，其機制可能與電荷、鈣鎂離子的作用以及許多貼附因子有關(guān)。動物細胞工程制藥當細胞在基質(zhì)上分裂增殖，逐漸匯合成片時，細胞與其周圍細胞相互接觸時，細胞才停止增殖。保持一定的營養(yǎng)，細胞仍可存活一段時間，但細胞密度不再增加，該現(xiàn)象就稱為接觸抑制或密度依賴抑制現(xiàn)象。一旦細胞轉(zhuǎn)化為異倍體后，該現(xiàn)象消失，細胞可多層生長，細胞密度可大大增加。動物細胞工程制藥動物細胞工程制藥動物細胞工程制藥3、正常二倍體細胞的生長壽命是有限的當細胞培養(yǎng)開始，稱之為原代培養(yǎng)，經(jīng)過傳代后，即成為有限細胞系，即有限的生長傳代時間，取決于細胞來源的種族和年齡，人胚成纖維細胞約可培養(yǎng)50代，雞胚的30代，小鼠的8代。但是若向培養(yǎng)基中加入表皮生長因子，可使上皮細胞的壽命從原來的50代增加至150代。當細胞突變?yōu)楫惐扼w后，該細胞可轉(zhuǎn)變成無限細胞系，或稱連續(xù)細胞系。動物細胞工程制藥動物細胞工程制藥動物細胞培養(yǎng)一代生長過程動物細胞工程制藥

4、動物細胞對周圍環(huán)境比較敏感無細胞壁保護，因而外界的物理化學(xué)因素很容易產(chǎn)生影響。

5、動物細胞培養(yǎng)基的要求高與細菌和植物細胞不同，其需要12種必需氨基酸、8種以上的維生素、多種無機鹽和微量元素、作為主要碳原的葡萄糖以及多種細胞生長因子和貼附因子，而且不同種類要求又有變化。動物細胞工程制藥6、動物細胞蛋白合成途徑和修飾功能與細菌不同場所：游離的核糖體以及粗面內(nèi)質(zhì)網(wǎng)上的核糖體，前者合成的蛋白質(zhì)都用于細胞質(zhì)基質(zhì)內(nèi)，后者上合成的蛋白質(zhì)是分泌性的和膜中的整合蛋白，多數(shù)為糖蛋白。蛋白質(zhì)上的糖鏈有的在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)上加接，有的在高爾基體中加接。其中內(nèi)質(zhì)網(wǎng)中加接的是N-鏈寡糖，在高爾基體內(nèi)加接的是O-鏈寡糖。動物細胞工程制藥動物細胞生產(chǎn)藥物的優(yōu)缺點缺點：培養(yǎng)條件高、成本貴、產(chǎn)量低。優(yōu)點：分泌胞外、純化方便、翻譯后修飾糖基化，與天然產(chǎn)品一致。動物細胞工程制藥第三節(jié)生產(chǎn)用動物細胞的要求和獲得一、生產(chǎn)用動物細胞的要求二、生產(chǎn)動物細胞的獲得三、常用生產(chǎn)用動物細胞的特性四、基因工程細胞的構(gòu)建和篩選五、細胞庫的篩選動物細胞工程制藥傳代細胞的要求正常原代細胞二倍體細胞無限制癌細胞生產(chǎn)藥物需謹慎！動物細胞工程制藥

一、生產(chǎn)用動物細胞的要求（1）原代正常組織分離的細胞（2）二倍體細胞，即使是傳代細胞（3）傳代細胞用于生產(chǎn)（4）按照FDA對細胞株的要求，控制最終產(chǎn)品中DNA殘留量。動物細胞工程制藥1、原代細胞：是直接取自動物組織、器官，經(jīng)過粉碎、消化而獲得的細胞懸液。一般1g組織約有109個細胞。雞胚細胞、原代兔腎或鼠腎細胞、淋巴細胞費錢費勞力動物細胞工程制藥2、二倍體細胞系：原代細胞經(jīng)過傳代、篩選、克隆，從而從多種細胞成分的組織中挑選并純化出某種具有一定特征的細胞株。WI-38、MRC-5、2BS等動物細胞工程制藥3、轉(zhuǎn)化細胞系：失去了正常細胞的特點，可以無限增殖。自發(fā)轉(zhuǎn)化、人為轉(zhuǎn)化Namalwa、CHO、BHK-21、Vero等。各單位細胞庫保存動物細胞工程制藥4、融合細胞系動物細胞融合技術(shù)----也稱動物體細胞雜交技術(shù)，是指二個或者二個以上的動物細胞在外力作用下，合并為一個多核細胞的過程。動物細胞工程制藥促融因素（1）病毒誘導(dǎo)融合（2）PEG誘導(dǎo)融合（3）電場誘導(dǎo)融合（4）其它誘導(dǎo)融合動物細胞工程制藥（1）病毒誘導(dǎo)融合仙臺病毒、流感病毒、新城疫雞瘟病毒、皰疹病毒等當二種不同的動物細胞混合物中存在大量病毒時，病毒或其組分會在細胞間起粘連作用而使細胞聚集成團，細胞膜上的蛋白質(zhì)和脂質(zhì)雙分子層產(chǎn)生重排、進而結(jié)合成一個整體。隨機的，無法人為控制，同時融合率較低。動物細胞工程制藥（2）PEG誘導(dǎo)融合當二種不同的動物細胞混合物中存在PEG時，就會產(chǎn)生細胞聚集作用。在除去PEG的過程中，即產(chǎn)生細胞融合現(xiàn)象。所用的PEG分子量在1000-6000之間，一般濃度為40-50%，在37℃下作用2-3分鐘，其促融效果最佳。PEG促融合的作用機理不清，其促融作用也具有隨機性，無法人為控制。動物細胞工程制藥（3）電場誘導(dǎo)融合將二種細胞混合物經(jīng)過10-100V/cm的低強度非均勻交變電場作用時，細胞之間就會發(fā)生緊密接觸，形成穩(wěn)定的串珠狀偶極子排列。在此基礎(chǔ)上再對細胞實施瞬間高強度電脈沖就會發(fā)生膜擊穿，不同細胞間通過膜脂質(zhì)分子重排就能實現(xiàn)融合，形成一個雙核或者多核的細胞。一般來說，擊穿電壓為0.5-10KV/cm，作用時間為30-50微秒。電場誘導(dǎo)融合不損傷細胞，具有可人為操作的控制的特性，融合率較高。動物細胞工程制藥三、常用生產(chǎn)用動物細胞的特性（1）WI-38：1961年來源于女性高加索人正常胚肺組織的二倍體細胞系，核型2n=46。該細胞是成纖維細胞，能產(chǎn)生膠原，培養(yǎng)基用BME（Eagle’sbasalmedium）加小牛血清，pH控制在7.2，同工酶為G6PDB型。細胞的倍增時間為24h，有限壽命為50代，上世紀60年代被廣泛用于制備疫苗。動物細胞工程制藥（2）MRC-5：特性和用途與WI-38相似，1966年來源于14周正常男性，對多種人的病毒敏感，用于疫苗的生產(chǎn)。動物細胞工程制藥（3）CHO-K1：1957年從中國地鼠卵巢中分離的一株上皮樣細胞。在培養(yǎng)時需加入脯氨酸。核型為2n=20~22。目前廣泛用于構(gòu)建工程細胞的是一株缺乏二氫葉酸還原酶的營養(yǎng)缺陷突變株CHO-dhfr-，它常用的培養(yǎng)基為DMEM培養(yǎng)基，加0.1mol/L次黃嘌呤和0.01mmol/L胸苷，以及10%小牛血清。動物細胞工程制藥（4）BHK-21：1961年從5只無性別的生長1天的地鼠幼鼠的腎臟中分離的?，F(xiàn)在廣泛采用的是1963年用單細胞分離的方法經(jīng)13次的克隆的細胞。成纖維細胞，2n=44。通常用的培養(yǎng)基為DMEM培養(yǎng)基，添加7%胎牛血清。過去多用于增殖病毒，包括多瘤病毒、口蹄疫病毒和狂犬病疫苗，現(xiàn)在已被用于構(gòu)建工程細胞。動物細胞工程制藥（5）Vero：1962年來源于正常的成年非洲綠猴腎。是貼壁依賴的成纖維細胞，2n=60，高倍體率為1.7%，可持續(xù)地進行培養(yǎng)。通常用的培養(yǎng)基為199培養(yǎng)基，添加5%胎牛血清。該細胞可支持多種病毒的增殖，包括脊髓灰質(zhì)炎、狂犬病病毒，已被批準用于人體。動物細胞工程制藥（6）Namalwa：1972年來源于肯尼亞患有Burkitt淋巴瘤的病人體中，后在瑞典構(gòu)建的一株人的類淋巴母細胞，高細胞有2.8%的高倍體率，多數(shù)細胞有12~14條標記染色體，單條X染色體，無Y染色體。通常用的培養(yǎng)基為RPMI1640，添加7%胎牛血清。用于大規(guī)模生產(chǎn)-干擾素。動物細胞工程制藥（7）SP2/0-Ag14：該細胞是1978年中通過融合的方法，從有抗羊紅細胞活性的BALB/c小鼠的脾細胞和骨髓瘤細胞系P3X63Ag8融合的雜交瘤SP2/HL-Ag亞克隆中分離得到。它不分泌任何免疫球蛋白抗體鏈，能耐受8-氮鳥嘌呤（8-azaguanine）20g/ml，但在含HAT選擇培養(yǎng)基中不能存活。通常用的培養(yǎng)基為DMEM培養(yǎng)基，添加10%胎牛血清。動物細胞工程制藥（8）Sf-9：1983年從親代IPLB-SF21AE中克隆形成。親代細胞則在1977年從秋粘蟲（Spodopterafrugiperda)的蛹卵組織中分離獲得。它對苜宿尺蠖核型多角體病毒（AutographacaliforniaMNPV）和其他桿狀病毒（Baculovirus）高度敏感。通常用的培養(yǎng)基為Grace培養(yǎng)基，添加3.3g/L水解乳蛋白和3.3g/L酵母浸液，以及10%胎牛血清。目前已經(jīng)被廣泛用于高效表達外來蛋白制品。動物細胞工程制藥四、基因工程細胞的構(gòu)建和篩選原代細胞、二倍體細胞系和轉(zhuǎn)化細胞系三者在生產(chǎn)中都有使用，但在生產(chǎn)中采用更多的、更有前景的是融合細胞及采用基因工程手段構(gòu)建的各種工程細胞。當前被用以構(gòu)建工程細胞的動物細胞有CHO-dhfr-、BHK-21、Namalwa、Vero、SP2/0和Sf-9等細胞。那么如何獲得動物工程細胞呢？動物細胞工程制藥

1、真核細胞基因表達

載體的構(gòu)建目前一般使用的載體有兩類：一是病毒載體，如牛痘病毒、腺病毒和逆轉(zhuǎn)錄病毒和桿狀病毒等。牛痘病毒已被廣泛地用來構(gòu)建成多價疫苗，腺病毒和逆轉(zhuǎn)錄病毒載體正被試用用于基因治療中，而桿狀病毒載體-昆蟲細胞系統(tǒng)已被成功地用于300多種外源基因的高效表達。動物細胞工程制藥用桿狀病毒做載體有許多優(yōu)點：（1）該病毒基因組是雙鏈DNA，容易進行重組。（2）插入7~8kb的DNA不影響正常病毒粒子的形成。（3）多角體蛋白和病毒粒子的形成無直接關(guān)系，因此用外源基因更換多角體蛋白基因，仍能形成有感染力的病毒粒子。動物細胞工程制藥（4）多角體蛋白基因有非常強的啟動子，產(chǎn)生的蛋白質(zhì)可占全部蛋白質(zhì)的20~30%。（5）用光學(xué)顯微鏡可看到多角體，容易以此為標記物來挑選陽性克隆。（6）如果用家蠶桿狀病毒，還可在蠶體直接表達外源基因。動物細胞工程制藥另一類是質(zhì)粒載體，而且常常是穿梭質(zhì)粒載體，即在細菌和哺乳動物細胞兩者體內(nèi)都能擴增。構(gòu)建此類載體一般含有如下基本成分：（1）允許載體在細菌體內(nèi)擴增的質(zhì)粒序列。多數(shù)含有質(zhì)粒pBR322或其衍生載體pAT153的序列，包括能使質(zhì)粒在細菌體內(nèi)復(fù)制的起始位點和抗生素標記基因。動物細胞工程制藥（2）含有能使基因轉(zhuǎn)錄表達的調(diào)控元件，在5’端轉(zhuǎn)錄起動需要有啟動子，包括帽狀位點（RNA轉(zhuǎn)錄起始點）上游約30堿基處的TATA框和上游70~90堿基處的CAAT框序列和增強子。當前構(gòu)建載體的許多啟動子序列都來自病毒。也有其它來源的啟動子。此外，在基因3’端應(yīng)有終止序列、RNA3’端的切割序列和polyA序列等。近來有人在載體里加入顯性活動調(diào)控區(qū)（DCR）序列，以此來克服因載體整合在宿主基因組位點而產(chǎn)生的表達水平降低。動物細胞工程制藥（3）能用以篩選出外源基因已整合的選擇標記。一般有兩類標記：一類僅適合用于密切相關(guān)的突變細胞株，如采用標記基因hgprt、tk和aprt等基因，它們僅適用于hgprt-、tk--和aprt--等基因缺失的細胞株。另一類是顯性作用基因，如neo基因，它能使氨基糖苷抗生素—新霉素磷酸化而失活，從而使原來對新霉素敏感的哺乳動物細胞一旦獲得含該基因的載體后，就能在含該抗生素的培養(yǎng)基中存活。動物細胞工程制藥（4）有時還帶有選擇性增加拷貝數(shù)的擴增系統(tǒng)。最常用的是編碼二氫葉酸還原酶的基因。該酶的擴增可防止氨甲喋呤（MTX）對細胞的毒害作用。利用該原理，在構(gòu)建載體時可有意識地將它與目的基因重組在一起，當在培養(yǎng)基內(nèi)增加MTX濃度時，就會促使dhfr基因的擴增，同時也會使其毗鄰的目的基因隨之擴增，從而大大提高表達量。類似的擴增系統(tǒng)還有谷氨酰胺合成酶和腺苷脫氫酶等系統(tǒng)。動物細胞工程制藥2、基因載體的導(dǎo)入和高效表達

工程細胞株的篩選（1）DNA導(dǎo)入動物細胞方法：

融合法、化學(xué)法、物理法、病毒法（2）篩選：

篩選系統(tǒng)、克隆純化動物細胞工程制藥

五、細胞庫的建立除原代細胞外，其它的細胞株、細胞系都需要建細胞庫加以保存。按照我國和美國FDA的規(guī)定，用于生產(chǎn)的工程細胞必須建立兩個細胞庫：原始細胞庫（mastercellbank，MCB）和生產(chǎn)用細胞庫（manugacture’sworkingcellbank，MWCB）或稱工作細胞庫（workingcellbank，WCB）。動物細胞工程制藥儲存于MCB的細胞應(yīng)該是單一來源的均質(zhì)的細胞，對于二倍體細胞應(yīng)該是群體倍增水平盡可能低的細胞。儲存時應(yīng)具有該細胞詳細檔案，包括：（1）該細胞系的歷史：（2）該細胞的特性：（3）對各種有害因子的檢查結(jié)果：動物細胞工程制藥儲存于MWCB的細胞應(yīng)該是從MCB來的，或從單一安瓿來，或從多個安瓿在融化即刻混合在一起的，然后經(jīng)培養(yǎng)擴增到一定數(shù)量后，再分裝儲存形成的細胞庫。同樣該細胞庫也必須建立檔案，而且需要進行無菌性和無細胞交叉污染的檢查。生產(chǎn)時需確定其最高使用的傳代數(shù)。動物細胞工程制藥第四節(jié)動物細胞的培養(yǎng)條件

和培養(yǎng)基為了使細胞培養(yǎng)在體外培養(yǎng)成功，需要一些基本條件：（1）絕對無菌操作；（2）足夠的營養(yǎng)供應(yīng)，排除有害物質(zhì)包括極其微量的離子摻入；（3）適量氧氣供應(yīng)；動物細胞工程制藥（4）隨時清除細胞代謝中產(chǎn)生的有害產(chǎn)物；（5）有良好的適于生存外界環(huán)境，包括pH、滲透壓和離子濃度等；（6）及時分種，保持合適的細胞密度。動物細胞工程制藥

一、動物細胞的培養(yǎng)條件1、器材的清洗和消毒器材的清洗：一般來說，需經(jīng)浸泡、刷洗、泡酸和沖洗四個步驟，用過的器材最好盡快地浸泡在3%的磷酸三鈉溶液內(nèi)過夜，以除去蛋白質(zhì)和殘余細胞等污垢。動物細胞工程制藥器材的消毒滅菌：主要通過物理方法和化學(xué)方法來達到嚴格無菌的操作過程。書中表3-4是細胞培養(yǎng)中常用的消毒劑、濃度和使用場合的列表。盡量避免使用抗生素，但在工業(yè)生產(chǎn)中還是經(jīng)常使用的。常用抗生素及其濃度見表3-5。動物細胞工程制藥2、水質(zhì)蒸餾、離子交換、電滲析、反滲透、中空纖維過濾等單獨使用或配合使用，制備純水，一般要求金屬離子含量很低，電阻值在18M以上。動物細胞制藥用水，要求去熱源。動物細胞工程制藥3、pHpH的高低對細胞各種酶的活性、細胞壁的通透性以及許多蛋白的功能都有重要的影響。動物細胞培養(yǎng)的最適pH為7.2~7.4，低于6.8或高于7.6時會對細胞產(chǎn)生不利影響，嚴重時會引起細胞退變甚至死亡。動物細胞工程制藥4、滲透壓在細胞培養(yǎng)的所有操作中，為了使與細胞接觸的所有液體都保持有較合適的滲透壓和pH，一般都需要使用平衡鹽溶液（balancedsaltsolution,BSS），它由無機鹽和葡萄糖組成。表3-6列出了幾種常用平衡鹽溶液（BSS）組成。動物細胞工程制藥5、溫度

哺乳動物：（37±0.5）℃昆蟲：27℃6、空氣動物細胞工程制藥二、動物細胞培養(yǎng)基的

種類和組成細胞種系不同對培養(yǎng)基的要求亦有差異，主要有三類：天然培養(yǎng)基、合成培養(yǎng)基和無血清培養(yǎng)基。

1、天然培養(yǎng)基：在細胞培養(yǎng)的早期階段使用的培養(yǎng)基，主要為來自天然的材料如血漿凝塊、血清、淋巴液、胚胎浸液以及羊水、腹水等。動物細胞工程制藥優(yōu)點：營養(yǎng)價值高缺點：成分復(fù)雜、來源有限、成本較高血清（serum）：纖維蛋白已被除去(如通過血凝或去纖維蛋白法)的血漿。動物細胞工程制藥2、合成培養(yǎng)基：優(yōu)點是成分明確，組分穩(wěn)定，可大量生產(chǎn)供應(yīng)。動物細胞培養(yǎng)中常用的有BME、MEM、DMEM、HAMF12、RPMI1640以及ISOCOV、199和McCoy等。缺點：無法替代一些未知成分。解決途徑合成培養(yǎng)基中添加小牛血清，彼此互補動物細胞工程制藥上述合成培養(yǎng)基中主要有：氨基酸：12種必需+谷氨酰胺維生素：脂溶性和水溶性糖類：葡萄糖、谷氨酰胺無機鹽：保持滲透壓其它一些特定成分如核酸的前體腺苷、鳥苷等。動物細胞工程制藥為了給細胞培養(yǎng)以更大的方便，以便于其增殖或貼附生長，長向培養(yǎng)基中加入一定量的動物血清，常用的是添加5%~10%的小牛血清，雜交瘤細胞的培養(yǎng)中，血清可能要求的更高，常用10~20%的胎牛血清。動物細胞工程制藥血清的作用機制可能為：（1）提供有利于細胞生長增殖所需要的各種生長因子和激素；（2）提供有利于細胞貼壁所需要的貼附因子和伸展因子；（3）提供可識別金屬、激素、維生素和脂類的結(jié)合蛋白；（4）提供細胞生長所必須的脂肪酸和微量元素。動物細胞工程制藥3、無血清培養(yǎng)基無血清培養(yǎng)基的優(yōu)點如下：①提高了細胞培養(yǎng)的可重復(fù)性，避免，避免了由于血清批之間差異的影響；②減少了由血清帶來的病毒、真菌和支原體等微生物污染的危險；③供應(yīng)充足、穩(wěn)定；動物細胞工程制藥④細胞產(chǎn)品容易純化；⑤避免了血清中某些因素對有些細胞的毒性；⑥減少了血清中蛋白對某些生物測定的干擾，便于實驗結(jié)果的分析。動物細胞工程制藥目前已經(jīng)有市售無血清培養(yǎng)基（書中表5-8所示）。無血清培養(yǎng)基中都是在合成培養(yǎng)基內(nèi)加入不同種類的添加劑所構(gòu)成，大致有以下幾類：動物細胞工程制藥（1）激素和生長因子：使用最多的是胰島素，促進糖原和脂肪酸的合成，對細胞生長有刺激作用。

（2）結(jié)合蛋白：最經(jīng)常被補充的是鐵傳遞蛋白和白蛋白。為了便于純化，有時可用硫酸亞鐵、檸檬酸鐵、葡萄糖酸鐵代替鐵傳遞蛋白。

動物細胞工程制藥（3）貼附和伸展因子：目前多數(shù)無血清培養(yǎng)基只適用于懸浮細胞，真正能用以培養(yǎng)貼壁細胞的很少，也很貴，原因在于它們均缺少必需的貼附和伸展因子，除這些因子外，有的還添加維生素A酸和重組的小肽，它可與細胞的受體結(jié)合。

（4）其它有利于細胞生長的因子和元素：它們包括有消除氧自由基損害的谷胱甘肽，某些微量元素，如硒等。動物細胞工程制藥三、動物細胞培養(yǎng)所需儀器設(shè)備實驗室要求（A）和緩沖間相連，緩沖間內(nèi)備消毒服裝和鞋，口罩等，入內(nèi)換上。（B）室內(nèi)空氣不流通，有適當?shù)墓饩€，清潔，干燥。（C）側(cè)部可設(shè)傳遞窗，用于物品傳遞。（D）有消毒用紫外線燈動物細胞工程制藥動物細胞工程制藥（1）培養(yǎng)器具培養(yǎng)瓶培養(yǎng)板培養(yǎng)皿動物細胞工程制藥（2）超凈工作臺超凈工作臺的工作原理是利用鼓風(fēng)機驅(qū)動空氣遁過高效濾器除去空氣中的塵埃顆粒，使空氣得到凈化。100級超凈工作臺指標：（≥0.5цm≤3.5粒/L）動物細胞工程制藥

（3）CO2培養(yǎng)箱CO2培養(yǎng)箱設(shè)定的條件為37℃，5％CO2

。二氧化碳的作用：維持PH值。動物細胞工程制藥（4）倒置顯微鏡動物細胞工程制藥

（5）純化水裝置動物細胞工程制藥四、進行動物細胞培養(yǎng)的材料1、胚胎組織------如10—20日齡的雞胚、實驗動物胚胎、人工流產(chǎn)的胎兒。胚胎組織的細胞由于互相之間粘連作用較弱、易于消化和分散、并且其細胞生命力強，易于培養(yǎng)和增殖。動物細胞工程制藥2、成體組織------如肝臟、脾臟、心臟、腎臟、白血球等等，由于其細胞之間具有較強的粘合作用，培養(yǎng)難度較大。動物細胞工程制藥3、腫瘤組織-----細胞增殖能力強，可在體外長期培養(yǎng)和繁殖，并且可以采用微生物培養(yǎng)方法進行懸浮培養(yǎng)。動物細胞工程制藥第五節(jié)動物細胞培養(yǎng)的基本方法動物細胞培養(yǎng)的概念:

從動物機體中取出相關(guān)細胞,將它分散成單個細胞,放在適宜的培養(yǎng)基中，讓這些細胞生長和增殖．動物細胞工程制藥動物細胞工程制藥

細胞系的分離與培養(yǎng)胰蛋白酶：細胞間質(zhì)較少的軟組織，胚胎、肝、腎及傳代細胞膠原酶：纖維、上皮、癌組織鏈霉蛋白酶、粘蛋白酶、蝸牛酶動物組織或器官洗滌粉碎酶解消化離心或過濾接種培養(yǎng)培養(yǎng)液稀釋細胞洗滌動物細胞工程制藥細胞計數(shù)1、自動細胞計數(shù)器計數(shù)2、血球計數(shù)板計數(shù)3、結(jié)晶紫染色細胞核計數(shù)4、MTT染色計數(shù)動物細胞工程制藥

ADAM-MC全自動細胞計數(shù)儀

動物細胞工程制藥動物細胞工程制藥細胞傳代1、懸浮細胞傳代2、貼壁細胞傳代：消化液消化動物細胞工程制藥細胞凍存與復(fù)蘇1、凍存溫度：液氮（-196℃）速度：1℃/min2、復(fù)蘇動物細胞工程制藥屠呦呦與拉斯克獎2011年9月24日，拉斯克基金會將臨床醫(yī)學(xué)研究獎授予81歲的中國中醫(yī)研究院研究員屠呦呦，以表彰其在治療瘧疾的青蒿素研究中的貢獻。這是“拉斯克獎”設(shè)立65年來首次頒予中國科學(xué)家，也是中國生物醫(yī)學(xué)界迄今獲得的世界級最高大獎。動物細胞工程制藥動物細胞工程制藥動物細胞工程制藥研究背景瘧疾（Malaria）經(jīng)按蚊叮咬而感染瘧原蟲所引起的蟲媒傳染病。19世紀，從金雞納樹皮中分離出抗瘧成分奎寧。隨后，科學(xué)家人工合成了奎寧，又找到了奎寧替代物—氯喹。氯喹藥物一度是抗擊瘧疾的特效藥。二戰(zhàn)后，瘧原蟲產(chǎn)生了抗藥性