ChIP實(shí)驗(yàn)精講(做科研的必看)

Chip實(shí)驗(yàn)精講（做科研的必看）口染色質(zhì)免疫共沉淀（Chip）□概述ChIP：chromatinimmunoprecipitationassay,染色質(zhì)免疫沉淀技術(shù)?！跹芯康鞍踪|(zhì)與DNA在染色質(zhì)環(huán)境下的相互作用是闡明真核生物基因表達(dá)機(jī)制的基本途徑。^玨是目前唯一研究體內(nèi)DNA與蛋白質(zhì)相互作用的方法口□原理在活細(xì)胞狀態(tài)下固定“蛋白質(zhì)-DNA”復(fù)合物，并將其隨機(jī)切斷為一定長(zhǎng)度范圍內(nèi)的染色質(zhì)小片段，然后通過(guò)免疫學(xué)方法沉淀此復(fù)合體，特異性地富集目的蛋白結(jié)合的DNA片段，通過(guò)對(duì)目的片斷的純化與檢測(cè)，從而獲得蛋白質(zhì)與DNA相互作用的信息。ChIP應(yīng)用口1、檢測(cè)體內(nèi)反式因子與DNA的動(dòng)態(tài)作用，研究組蛋白的各種共價(jià)修飾與基因表達(dá)的關(guān)系； 2、CHIP與基因芯片相結(jié)合建立的CHIP-on-ChIP方法已廣泛用于特定反式因子靶基因的高通量篩選；3、CHIP與體內(nèi)足跡法相結(jié)合，用于尋找反式因子的體內(nèi)結(jié)合位點(diǎn)； 4、RNA-CHIP用于研究RNA在基因表達(dá)調(diào)控中的作用?！踉囼?yàn)流程一、交聯(lián)染色質(zhì)免疫沉淀技術(shù)細(xì)胞甲醛交聯(lián)和收集注意事項(xiàng)：①需要優(yōu)化甲醛使蛋白質(zhì)和DNA交聯(lián)的時(shí)間?！酡诮宦?lián)的時(shí)間很關(guān)鍵。交聯(lián)的時(shí)間一般為2-30分鐘?！酡劢宦?lián)過(guò)度會(huì)降低抗原的可結(jié)合性和超聲的效率，也會(huì)被遮蓋抗原的表位?！酡芨拾彼峥梢种萍兹┑淖饔?，終止交聯(lián)反應(yīng)?！跞?直徑10cm培養(yǎng)皿的細(xì)胞。加入甲醛至終濃度為0.75%（V/V）,使蛋白和DNA交聯(lián)。室溫下，輕搖10分鐘。加入甘氨酸至終濃度為125mM,室溫下放置5分鐘，以終止交聯(lián)?！跷ヅ囵B(yǎng)基，用冰冷PBS洗細(xì)胞2次?！跏褂眉?xì)胞刮刀，加入5ml冰冷PBS,刮下細(xì)胞，收集至一個(gè)50ml離心管中。:□再用3ml冰冷PBS洗培養(yǎng)皿2次，至50ml離心管中。□□4℃，10008，離心5分鐘收集細(xì)胞。□□吸棄上清，用SDSLysisBuffer重懸沉淀（每1X107個(gè)細(xì)胞加800口1）?？凇鮏DSLysisBuffer配方：50mMHEPES-KOHpH7.5140mMNaCl1mMEDTApH81%TritonX-1000.1%SodiumDeoxycholate0.1%SDSProteaseInhibitors（每次新鮮加入）□注意事項(xiàng)：使用懸浮細(xì)胞實(shí)驗(yàn)時(shí)，加入0.75%（v/v）的甲醛和甘氨酸后，5分鐘，1000g□離心沉淀細(xì)胞。冰冷PBS洗3次，用SDSLysisBuffer重懸細(xì)胞（每1X107細(xì)胞加800口1）?？诮M織免疫沉淀樣品的制備注意事項(xiàng)：①每個(gè)IP反應(yīng)建議使用肝組織301^,可按實(shí)際情況調(diào)整?！酡诿糠N組織的用量依據(jù)組織蛋白豐度、抗體親和力和交聯(lián)效率而定。□③每個(gè)IP反應(yīng)最適染色質(zhì)的量為5-15ug。 ④每次交聯(lián)免疫沉淀反應(yīng)之前，需根據(jù)不同組織類型確定具體的染色質(zhì)需要量。⑤所有溶液中均應(yīng)添加蛋白酶抑制劑proteininhibiter（cocktail）。2.1.交聯(lián)反應(yīng)注意事項(xiàng)：①冰凍組織應(yīng)置于冰上融化。②冰凍組織融化時(shí)溫度不能過(guò)高，以免蛋白酶活化使組織降解。③操作過(guò)程中要一直在冰上進(jìn)行，盡量縮短操作時(shí)間防止蛋白降解?！鯇⒈鶅龌蛐迈r組織切成小塊(1-3mm3)。取一個(gè)空的15ml離心管，稱重，放入組織后再次稱重，計(jì)算組織重量。每克組織加10mlPBS。加入終溶度1.5%(v/v)的甲醛，室溫旋轉(zhuǎn)15分鐘?！跫尤敫拾彼嶂两K濃度0.125M，終止交聯(lián)反應(yīng)，室溫旋轉(zhuǎn)5分鐘?！酢?°C，720江山，離心5min?！鯒壣锨澹眉尤?0ml預(yù)冷的PBS洗滌。4°C，720rpm，離心5min，棄上清?！踝⒁馐马?xiàng)：①所得組織可用液氮速凍，保存于-80°C。 ②避免反復(fù)凍融。③使用時(shí)可用預(yù)冷PBS重懸組織，每克組織加10ml，置冰上解凍?！踅到饨M織剪掉1ml槍頭的末端，使吸頭口增大。用1mlPBS重懸50—100mg組織。□將溶液加入錐形研磨管中，研磨2分鐘。用1ml注射器連接18號(hào)鈍圓針頭，插入研磨管中收集細(xì)胞。將細(xì)胞加入一個(gè)錐形管中，冰上放置。顯微鏡下觀察細(xì)胞懸液，以確定得到的是單細(xì)胞懸液。1000rpm,4°^離心10分鐘收集細(xì)胞?！鯒壣锨?，用SDSLysisbuffer重懸沉淀(每1x107個(gè)細(xì)胞加入800口1)?？诔曁幚?。3.超聲3.1超聲處理裂解液，將DNA打斷成500-1000bp范圍內(nèi)的片段。□注意事項(xiàng)：①使用組織進(jìn)行實(shí)驗(yàn)時(shí)，要得到單細(xì)胞懸液，需從超聲處理開(kāi)始。②細(xì)胞系不同，需要超聲的時(shí)間也不同，需要分別優(yōu)化得到最佳條件?！酡廴〔糠謽颖臼褂?.5%(質(zhì)量百分比)的瓊脂糖凝膠電泳，分析超聲結(jié)果。□33.2超聲處理后，4°C,10,000g，離心10min,以除去細(xì)胞碎片。轉(zhuǎn)移上清至新管中。3.3超聲后的樣本各取50口1,測(cè)量DNA濃度，用為PCR對(duì)照。□注意事項(xiàng)：①超聲后溶液可在液氮中速凍，可于-80°C保存2個(gè)月。 ②避免反復(fù)凍融,以免樣品降解。③超聲時(shí)間過(guò)長(zhǎng)會(huì)使核小體與DNA的交聯(lián)斷裂，一般超聲時(shí)間為15min。4.純化DNA4.1試劑盒純化DNA口①加入2口1RNA酶A（0.5mg/ml）。②65°C,4—5小時(shí)（或過(guò)夜），解交聯(lián)。③按照DNA純化試劑盒說(shuō)明書(shū)純化DNA。 ④樣本可于-20°C保存?！酢踝⒁馐马?xiàng)：使用DNA純化試劑盒純化DNA時(shí),應(yīng)加入RNA酶A處理樣品,以免RNA濃度過(guò)高減少DNA的最終純化量?！?.2酚:氯仿抽提純化DNA ①加入5口1蛋白酶K（20mg/m1）。②65°C,4-5小時(shí)（或過(guò)夜），解交聯(lián)。 ③等體積酚:氯仿抽提DNA樣品3次。④取水相加入10口1糖原（5mg/m1）,2倍體積無(wú)水乙醇沉淀，70%乙醇洗滌沉淀2次，室溫干燥10min。□⑤加入100口1水溶解沉淀。 ⑥樣本可于-20°C保存?！踝⒁馐马?xiàng)：使用蛋白酶K消化樣品，可以水解蛋白質(zhì)，使蛋白質(zhì)與DNA解交聯(lián)，以促進(jìn)DNA的純化?！?.3DNA濃度測(cè)定①取5口1純化DNA,稀釋200倍，測(cè)定OD260?！酡贒NA濃度（口g/m1）=OD260x10,000,計(jì)算DNA濃度。5.免疫沉淀口使用超聲處理所得溶液進(jìn)行免疫沉淀反應(yīng)。建議：①沉淀反應(yīng)DNA含量約為25Pg?？冖诿總€(gè)樣本用RIPA緩沖液稀釋10倍?！酡墼O(shè)一個(gè)抗體對(duì)照和一個(gè)僅加磁珠（不加抗體）的對(duì)照?！鮎IPAbuffer配方：50mMTris-HClpH8150mMNaCl2mMEDTApH81%NP-40口0.5%SodiumDeoxycholate0.1%SDSProteaseInhibitors（每次新鮮加入）樣本中均加入一抗（對(duì)照樣品不加）。注意事項(xiàng)：①先進(jìn)行預(yù)實(shí)驗(yàn)得到最佳的抗體加入量。②每25口gDNA一般加入1-10Pg抗體。□樣品中加入20口l的proteinA/G磁珠，免疫沉淀（IP）,4°C,緩慢旋轉(zhuǎn)過(guò)夜。2000g離心^^收集磁珠，棄上清?！跤?ml低鹽washbuffer洗滌磁珠3次。2000g離心1分鐘。低鹽Washbuffer配方：0.1%SDS口1%TritonX-1002mMEDTApH8150mMNaCl20mMTris-HClpH8用高鹽washbuffer洗1次。2000g離心1分鐘?！醺啕}washbuffer配方：0.1%SDS口1%TritonX-1002mMEDTApH8500mMNaClmMTris-HClpH8注意事項(xiàng)：①如果背景過(guò)高，則應(yīng)增加洗滌次數(shù)。□②超聲處理后的染色質(zhì)先與proteinA/G磁珠共孵育1小時(shí)，將消除與磁珠的非特異行結(jié)合，降低背景。6.免疫復(fù)合物洗滌和解交聯(lián)6.1回收DNA：向proteinA/G磁珠中加入120PlExtractionbuffer,30°C,旋轉(zhuǎn)15分鐘。Extractionbuffer配方：1%SDS口100mMNaHCO32000g離心1分鐘。將上清轉(zhuǎn)移至新管中。樣本可于-20°C保存。.純化DNA可用DNA純化試劑盒或酚:氯仿抽提進(jìn)行（參照上面步