無菌檢查法培訓

無菌檢查法培訓第1頁/共36頁無

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法無菌檢查法培訓

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法一、檢測標準《中華人民共和國藥典》2010年版附錄無菌檢查法（2010年7月1日起執(zhí)行）第3頁/共36頁無

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法二、檢測環(huán)境無菌檢查應在環(huán)境潔凈度10000級下的局部潔凈度100級的單向流空氣區(qū)域內或隔離系統中進行。潔凈度標準：《醫(yī)藥工業(yè)潔凈室（區(qū)）懸浮粒子、浮游菌和沉降菌的測試方法》的現行國家標準進行潔凈度驗證。第4頁/共36頁無

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法無菌檢驗過程中應同時檢查超凈工作臺單向流空氣中的菌落數：

每次操作時在層流空氣所及臺面的左中右置3個營養(yǎng)瓊脂平板，暴露30min，于30～35℃培養(yǎng)48小時，菌落數平均應不超過1CFU/平板。第5頁/共36頁無

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法三、名詞解釋1、好氧微生物：在代謝中，有氧條件下才能生存的微生物。2、厭氧微生物：在代謝中，沒有氧條件下才能生存的微生物。3、兼性微生物：能夠在有氧和無氧條件下代謝的微生物。4、培養(yǎng)條件：用于促進微生物發(fā)育、生長和繁殖的生長培養(yǎng)基和培養(yǎng)方式的組合。5、假陰性：實際陽性的無菌實驗結果被變成了陰性。6、假陽性：實際陰性的無菌實驗結果被變成了陽性。7、促生長實驗：用于證明生長培養(yǎng)基能夠支持微生物生長的技術條件。第6頁/共36頁無

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法四、樣品量檢驗數量：是指一次試驗所用供試品最小包裝容器的數量。檢驗量：指一次試驗所用的供試品總量。除另有規(guī)定外，出廠產品按表1規(guī)定；上市產品監(jiān)督檢驗按表2、表3規(guī)定。表1、表2、表3中最少檢驗數量不包括陽性對照試驗的供試品用量。（一般情況下，供試品無菌檢查若采用薄膜過濾法，應增加1/2的最小檢驗數量作陽性對照用；若采用直接接種法，應增加供試品1支（或瓶）作陽性對照用。）

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法表1批出廠產品最少檢驗數量第8頁/共36頁無

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法表2.液體制劑最少檢驗量及上市抽驗樣品的最少檢驗數量

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法表3.固體制劑最少檢驗量及上市抽檢樣品的最少檢驗數第10頁/共36頁無

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法五、實驗材料的準備1、培養(yǎng)基及稀釋液（1)硫乙醇酸鹽流體培養(yǎng)基（2）改良馬丁培養(yǎng)基（3）pH7.0氯化鈉-蛋白胨緩沖液第11頁/共36頁無

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法2、培養(yǎng)基的制備及培養(yǎng)條件直接購買配制好的干粉培養(yǎng)基，按培養(yǎng)基包裝上的說明，取規(guī)定量的干粉培養(yǎng)基及蒸餾水進行配制之后，按說明上的溫度、時間要求進行培養(yǎng)基滅菌。注：對硫乙醇酸鹽流體培養(yǎng)基，配好后，須煮沸，再滅菌。培養(yǎng)基氧化層的高度不得超過培養(yǎng)基深度的1/5。硫乙醇酸鹽流體培養(yǎng)基，置30～35℃培養(yǎng)。改良馬丁培養(yǎng)基，置23～28℃培養(yǎng)。第12頁/共36頁無

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法3、其他實驗材料剪刀、鑷子濾器、微孔濾膜量筒培養(yǎng)器第13頁/共36頁無

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法以上材料可以采用干熱滅菌（只限于剪刀、鑷子，滅菌時將剪刀和鑷子裝入專用滅菌器具內）或濕熱滅菌。干熱滅菌為160℃2小時，或置壓力蒸汽滅菌器內121℃蒸汽滅菌30分鐘后使用。第14頁/共36頁無

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法4、培養(yǎng)基的適用性檢查無菌檢查用的硫乙醇酸鹽流體培養(yǎng)基及改良馬丁培養(yǎng)基等應符合培養(yǎng)基的無菌性檢查及靈敏度檢查的要求。本檢查可在供試品的無菌檢查前或與供試品的無菌檢查同時進行。無菌性檢查：每批培養(yǎng)基隨機取不少于5支（瓶），培養(yǎng)14天，應無菌生長。第15頁/共36頁無

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法靈敏度檢查

菌種：培養(yǎng)基靈敏度檢查所用的菌株傳代次數不得超過5代（從菌種保存中心獲得的冷凍干燥菌種為第0代），試驗用菌種應采用適宜的菌種保存技術進行保存，以保證試驗菌株的生物學特性。

金黃色葡萄球菌(Staphylococcusaureus)〔CMCC(B)26003〕

銅綠假單胞菌(Pseudomonasaeruginosa)〔CMCC(B)10104〕

枯草芽孢桿菌（Bacillussubtilis）〔CMCC（B）63501〕生孢梭菌(Clostridiumsporogenes)〔CMCC(B)64941〕

白色念珠菌(Candidaalbicans)〔CMCC(F)98001〕黑曲霉(Aspergillusniger)〔CMCC(F)98003〕

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法菌液制備

接種金黃色葡萄球菌、銅綠假單胞菌、枯草芽孢桿菌的新鮮培養(yǎng)物至營養(yǎng)肉湯培養(yǎng)基中或營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基；接種生孢梭菌的新鮮培養(yǎng)物至硫乙醇酸鹽流體培養(yǎng)基中，30℃～35℃培養(yǎng)18小時～24小時；接種白色念珠菌的新鮮培養(yǎng)物至改良馬丁培養(yǎng)基中或改良馬丁瓊脂培養(yǎng)基上，23～28℃培養(yǎng)24～48小時。上述培養(yǎng)物用0.9%無菌氯化鈉溶液制成每1ml含菌數小于100cfu（菌落形成單位）的菌懸液。接種黑曲霉的新鮮培養(yǎng)物至改良馬丁瓊脂斜面培養(yǎng)基上，23～28℃培養(yǎng)5～7天，加入3～5ml含0.05％（v/v）聚山梨酯80的0.9%無菌氯化鈉溶液，將孢子洗脫。然后，用適宜的方法吸出孢子懸液至無菌試管內，用含0.05％（v/v）聚山梨酯80的0.9%無菌氯化鈉溶液制成每1ml含孢子數小于100cfu的孢子懸液。第17頁/共36頁無

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法菌懸液在室溫下放置應在2小時內使用，若保存在2～8℃可在24小時內使用。黑曲霉孢子懸液可保存在2～8℃，在驗證過的貯存期內使用。培養(yǎng)基接種

取每管裝量為12ml的硫乙醇酸鹽流體培養(yǎng)基9支，分別接種小于100cfu的金黃色葡萄球菌、銅綠假單胞菌、枯草芽孢桿菌、生孢梭菌各2支，另1支不接種作為空白對照，培養(yǎng)3天；取每管裝量為9ml的改良馬丁培養(yǎng)基5支,分別接種小于100cfu的白色念珠菌、黑曲霉各2支，另1支不接種作為空白對照，培養(yǎng)5天。逐日觀察結果。結果判定空白對照管應無菌生長，若加菌的培養(yǎng)基管均生長良好，判該培養(yǎng)基的靈敏度檢查符合規(guī)定。第18頁/共36頁無

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法六、實驗設備過濾裝置（無油真空泵、濾杯、濾頭、濾瓶、微孔濾膜、夾子）電子天平壓力蒸汽滅菌器電熱鼓風干燥箱恒溫培養(yǎng)箱集菌儀第19頁/共36頁無

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法5、供試品的準備

操作前，用適宜的消毒液對供試品容器表面進行徹底消毒，如果供試品容器內有一定的真空度，可用適宜的無菌器材（如帶有除菌過濾器的針頭）向容器內導入無菌空氣，再按無菌操作起開容器取出內容物。第20頁/共36頁無

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法七、供試液的制備（薄膜過濾法）用？mlpH7.0氯化鈉-蛋白胨緩沖液浸提供試品，混勻、立即過濾。？：使供試品完全浸泡所需的pH7.0氯化鈉-蛋白胨緩沖液的用量第21頁/共36頁無

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法八、檢查法——薄膜過濾法

將供試液混勻，過濾。如供試品具有抑菌作用或含防腐劑，須用適量的沖洗液沖洗濾膜，沖洗次數不得少于三次。優(yōu)先采用封閉式薄膜過濾器（集菌器），也可使用開放式薄膜過濾器。濾膜孔經不大于0.45μｍ。濾器和濾膜使用前應采用適宜的方法滅菌，或直接采用無菌集菌器。第22頁/共36頁無

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法如采用封閉式薄膜過濾器，取一副三聯式集菌器，將供試液通過集菌儀過濾，使通過每只培養(yǎng)管的量基本均勻。然后通過集菌儀一只加120ml改良馬丁培養(yǎng)基，另兩只分別加入120ml硫乙醇酸鹽培養(yǎng)基（其中一只做陽性對照，內加金黃色葡萄球菌液1ml）。另取一副二聯集菌器，用同批的沖洗液或浸提介質120ml通過集菌儀過濾（每只約50ml），同法一只加硫乙醇酸鹽培養(yǎng)基120ml，另一只加改良馬丁培養(yǎng)基120ml分別作陰性對照。第23頁/共36頁封閉式薄膜過濾器

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法如用一般薄膜過濾器，將供試液過濾后取出濾膜，將其剪成3等份，分別置于含50ml硫乙醇酸鹽流體培養(yǎng)基及改良馬丁培養(yǎng)基的容器中，其中兩份作檢驗，一份作陽性對照。第25頁/共36頁無

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法八、檢查法——直接接種法

每個供試品按規(guī)定量分別接種至各含硫乙醇酸鹽流體培養(yǎng)基和改良馬丁培養(yǎng)基的容器中。每個容器中培養(yǎng)基的用量應符合接種的供試品體積不得大于培養(yǎng)基體積的10%，或培養(yǎng)基的裝量足以浸沒供試品。同時，硫乙醇酸鹽流體培養(yǎng)基每管裝量不少于15ml及改良馬丁培養(yǎng)基每管裝量不少于10ml。第26頁/共36頁無

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法九、對照實驗陽性對照應根據供試品特性選擇對照菌：無抑菌無抑菌作用及抗革蘭陽性菌為主的供試品，以金黃色葡萄球菌為對照菌；抗革蘭陰性菌為主的供試品以大腸埃希菌為對照菌；抗厭氧菌的供試品，以生孢梭菌為對照菌；抗真菌的供試品，以白色念珠菌為對照菌。陽性對照試驗的菌液制備同方法驗證試驗，加菌量小于100cfu，供試品用量同供試品無菌檢查每份培養(yǎng)基接種的樣品量。陽性對照管培養(yǎng)48～72小時應生長良好。第27頁/共36頁無

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法陽性對照：一般情況下，供試品無菌檢查若采用薄膜過濾法，應增加1/2的最小檢驗數量作為陽性對照用；若采用直接直接接種法，應增加供試品無菌檢查時每個培養(yǎng)基容器接種的樣品量作為陽性對照用。陰性對照：供試品無菌檢查時，應取相應溶劑和稀釋液、沖洗液同法操作，作為陰性對照。陰性對照不得有菌生長。第28頁/共36頁無

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法十、培養(yǎng)及觀察

上述含培養(yǎng)基的容器按規(guī)定的溫度培養(yǎng)14天。

硫乙醇酸鹽流體培養(yǎng)基，置30～35℃培養(yǎng)。

改良馬丁培養(yǎng)基，置23～28℃培養(yǎng)。培養(yǎng)期間應逐日觀察并記錄是否有菌生長。如在加入供試品后、或在培養(yǎng)過程中，培養(yǎng)基出現渾濁，培養(yǎng)14天后，不能從外觀上判斷有無微生物生長，可取該培養(yǎng)液適量轉種至同種新鮮培養(yǎng)基中，細菌培養(yǎng)2天、真菌培養(yǎng)3天，觀察接種的同種新鮮培養(yǎng)基是否再出現渾濁；或取培養(yǎng)液涂片，染色，鏡檢，判斷是否有菌。第29頁/共36頁無

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法十一、結果報告陽性對照管應生長良好，陰性對照管不得有菌生長。否則，試驗無效。若供試品管均澄清，或雖顯渾濁但經確證無菌生長，判供試品符合規(guī)定；若供試品管中任何一管顯渾濁并確證有菌生長，判供試品不符合規(guī)定，除非能充分證明試驗結果無效，即生長的微生物非供試品所含。當符合下列至少一個條件時方可判試驗結果無效：

⑴無菌檢查試驗所用的設備及環(huán)境的微生物監(jiān)控結果不符合無菌檢查法的要求。

⑵回顧無菌試驗過程，發(fā)現有可能引起微生物污染的因素。

⑶供試品管中生長的微生物經鑒定后，確證是因無菌試驗中所使用的物品和（或）無菌操作技術不當引起的。

試驗若經確認無效，應重試。重試時，重新取同量供試品，依法檢查，若無菌生長，判供試品符合規(guī)定；若有菌生長，判供試品不符合規(guī)定。第30頁/共36頁無

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法十二、假陰性、假陽性結果最小化假陽性的預防措施1、實驗在一個有環(huán)境控制、有氣流控制的專門的房間中進行；2、在整個實驗中使用無菌技術；3、進入實驗區(qū)域的實驗器具、培養(yǎng)基應避免污染。樣品的外包裝在進入實驗區(qū)域前應消毒；4、實驗臺表面消毒；5、最小化操作手續(xù)；6、控制和評估培養(yǎng)箱的環(huán)境；7、最小化浮塵；8、滅菌所有的設備、材料和用品。第31頁/共36頁無

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法影響假陰性發(fā)生的因素1、培養(yǎng)條件不能支持微生物的生長（促生長試驗）；2、在無菌實驗中，產品中釋放出了殺菌或微生物電解的物質（消除抑制物質）3、從滅菌處理到培養(yǎng)有一定的時間間隔（確定滅菌后產品的儲存條件及儲存時間）第32頁/共36頁無

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法十三、實驗過程中所用的記錄1、培養(yǎng)基配制記錄2、無菌檢驗原始記錄3、滅菌設備、培養(yǎng)設備使用記錄4、菌種使用記錄5、培養(yǎng)基、陽性菌銷毀記錄6、培養(yǎng)基靈