淡紫擬青霉菌株防治燈盞花根結(jié)線蟲病的效果,植物保護論文

淡紫擬青霉菌株防治燈盞花根結(jié)線蟲病的效果,植物保護論文根結(jié)線蟲是一類危害大、分布廣且難以防治的重要病原線蟲，生產(chǎn)上防治該病害主要以化學(xué)殺線蟲劑為主，由于化學(xué)殺線蟲劑對環(huán)境污染嚴重，使用經(jīng)過中對人、畜也不安全，因而很多化學(xué)殺線蟲劑已被禁用。淡紫擬青霉[Paecilomyceslilacinus〔Thom.〕Samson]是土壤及多種植物根系的習居菌，Samson1974年在秘魯首先從根結(jié)線蟲卵囊上分離到該菌，Jatala博士1979年初次發(fā)現(xiàn)該菌對南方根結(jié)線蟲卵寄生率高達60%-70%.Cayrol等1989年報道了淡紫擬青霉的培養(yǎng)濾液含有殺線蟲物質(zhì),被各國學(xué)者廣泛應(yīng)用于根結(jié)線蟲生防并成為商品。近年來，國內(nèi)研究者也對該菌作了大量的生防研究,亦證實該菌對根結(jié)線蟲有較高的寄生率，能有效控制土壤中根結(jié)線蟲的數(shù)量，明顯減少危害，其代謝產(chǎn)物對多種作物具有生理活性。為了開發(fā)利用生防菌物資源，作者近年來挑選出寄生根結(jié)線蟲的淡紫擬青霉高效菌株YC0447菌株，通過室內(nèi)測定及盆栽試驗對淡紫擬青霉YC0447菌株防治燈盞花根結(jié)線蟲病的效果進行了初步研究，為進一步田間試驗提供根據(jù)。1、材料與方式方法1.1淡紫擬青霉對燈盞花根結(jié)線蟲卵的寄生率測定淡紫擬青霉YC0447菌株從煙草爪哇根結(jié)線蟲〔Meloidogynejavanica〕卵中分離得到。將生長10d的PDA平板上的淡紫擬青霉YC0447菌株孢子用滅菌水洗下，配成2.5106個/mL孢子懸浮液。根結(jié)線蟲采自云南個舊燈盞花植株。將根結(jié)線蟲在番茄上繁衍，待其產(chǎn)卵后，隨機取嫩根上早期發(fā)育的卵囊，用1%次氯酸鈉外表消毒后，用滅菌水洗3次，備用。參照Nitao等的方式方法將根結(jié)線蟲卵配制成密度為2500個/mL的卵懸浮液，汲取100L根結(jié)線蟲卵懸浮液和10L孢子懸浮液，于2%水瓊脂平板上混勻，而后輕輕涂布，以滅菌水為對照，重復(fù)3次，置于25℃下培養(yǎng)12d,天天鏡檢寄生率情況。1.2淡紫擬青霉發(fā)酵液對燈盞花根結(jié)線蟲2齡幼蟲的致死作用〔1〕發(fā)酵液的制備將50mL微量培養(yǎng)基+1%雞蛋黃的液體培養(yǎng)基裝入500mL三角瓶中，滅菌、冷卻后，接種4塊3mm3mm的淡紫擬青霉菌塊，在28℃黑暗條件下180r/min振蕩培養(yǎng)5d.用無菌濾紙過濾，濾液經(jīng)4000r/min離心，除去菌絲，取上清液即為發(fā)酵粗提液用于活性測定?！?〕殺線蟲活性測定在裝有1.5mL發(fā)酵粗提液的小凹玻皿中，參加備好的燈盞花根結(jié)線蟲2齡幼蟲50~70條，將小凹玻皿放入大培養(yǎng)皿中保濕，置于25℃恒溫箱中，分別于12h,24h,36h,48h后檢測線蟲的死亡率。設(shè)無菌的空白培養(yǎng)基和無菌水作對照，重復(fù)3次，計算各處理的死線蟲數(shù)和統(tǒng)計校正死亡率。死亡率統(tǒng)計方式方法參考蓋鈞鎰等的方式方法.-:校正死亡率10%下面；+:校正死亡率11%~30%;++:校正死亡率31%~50%;+++:校正死亡率51%~80%;++++:校正死亡率大于80%線蟲死活的鑒別采用NaCI檢測法,用細挑針挑取僵硬的線蟲，置于2%NaCI中5min后，假死線蟲僵硬的蟲體彎曲并開場運動，死亡的線蟲蟲體仍保持僵硬不動。殺線蟲活性強弱的分級按Chan-dravadana等的方式方法。1.3淡紫擬青霉對燈盞花根結(jié)線蟲的盆栽防治效果試驗在溫室大棚內(nèi)進行，供試菌孢子含量為1.471011個/g的淡紫擬青霉YC0447菌株麥粒菌劑，燈盞花根結(jié)線蟲為南方根結(jié)線蟲〔M.incognita〕。栽培基質(zhì)為腐質(zhì)土、無病土、煙草漂浮育苗專用肥按25:50:1比例混合配成，每盆1株。從感染燈盞花根結(jié)線蟲的番茄病根上剪取新鮮根結(jié)，移栽時將40g病土+30個新鮮根結(jié)+20g1施于每株燈盞花根部。對照為40g病土+30個新鮮根結(jié)+20g麥粒。每一處理設(shè)20盆。接菌后按常規(guī)管理，于接種后60d將全部處理植株扣盆倒出，統(tǒng)計株高和地上部鮮重、根鮮重，并進行根結(jié)嚴重度分級,計算病情指數(shù)和防治效果。2、結(jié)果與分析2.1淡紫擬青霉對燈盞花根結(jié)線蟲卵的寄生效果在水瓊脂平板上混合接種淡紫擬青霉YC0447菌株孢子和線蟲卵，8d后觀察有44.62%的卵被寄生，隨著時間的延長，卵的寄生率不斷加快，12d后觀察有83.50%的卵被寄生，對照中的卵和處理中未被寄生的卵發(fā)育和孵化也相應(yīng)加快。光學(xué)顯微鏡觀察發(fā)現(xiàn)接種淡紫擬青霉3d后菌絲侵入卵中，5~6d后卵殼外表布滿菌絲，外表粗糙，8d后卵粒變形變軟，卵完全被淡紫擬青霉菌絲所包裹。2.2淡紫擬青霉發(fā)酵液的殺線蟲活性不同濃度淡紫擬青霉發(fā)酵液對燈盞花根結(jié)線蟲2齡幼蟲致死活性測定結(jié)果見表1.從表1中能夠看出，淡紫擬青霉發(fā)酵液對燈盞花根結(jié)線蟲致死效果較好。當發(fā)酵液濃度稀釋到40%時，48h后的校正死亡率達80%以上〔++++〕；在濃度為60%時，校正死亡率與濃度為80%時差異不同不大。講明發(fā)酵液稀釋到60%時的殺線蟲效果最佳。2.3淡紫擬青霉發(fā)酵液致死的根結(jié)線蟲2齡幼蟲死亡狀態(tài)觀察經(jīng)淡紫擬青霉發(fā)酵液處理12h,24h,36h,48h的根結(jié)線蟲2齡幼蟲用2%NaC1檢測其死亡情況，并觀察蟲體構(gòu)造的變化。用發(fā)酵液處理1h后，線蟲的活動變得遲鈍，僵硬假死的根結(jié)線蟲經(jīng)2%NaC1處理5min后蟲體恢復(fù)彎曲并開場運動。12h后的線蟲僵硬并死亡，能看出其內(nèi)部構(gòu)造發(fā)生微小的變化，線蟲的體腔內(nèi)部構(gòu)造部分消解，同時產(chǎn)生液泡。24h后能夠清楚地觀察到死亡的線蟲的體腔內(nèi)部構(gòu)造產(chǎn)生大量消解，體壁與腸分離。48h后從口腔開場變得模糊，有的看不清口針，食道模糊，尾部的內(nèi)部構(gòu)造與體壁分離，體腔內(nèi)部構(gòu)造幾乎完全消解。2.4淡紫擬青霉對燈盞花根結(jié)線蟲病的防治效果盆栽試驗結(jié)果〔表2〕表示清楚，防治的平均株高比對照高9cm,地上、地下部鮮重顯著高于對照，100g土中幼蟲數(shù)量明顯減少，病情指數(shù)降低，花數(shù)增加，防治效果為64.7%.經(jīng)防治的燈盞花根系發(fā)達、強健,而未防治的燈盞花根系較稀疏，嫩根上1.防治的燈盞花根系只要少量根結(jié)出現(xiàn)于老根和上部根上，其病情指數(shù)明顯低于對照。由此揣測，淡紫擬青霉菌劑對根有一定的保衛(wèi)作用，在控制根結(jié)線蟲再侵染經(jīng)過中發(fā)揮了重要作用。3、討論本研究表示清楚，淡紫擬青霉YC0447菌株對燈盞花根結(jié)線蟲分散卵的寄生率為83.50%,對卵囊的寄生率未做測定。陳淑鴻等采用雙溫測定法，測得淡紫擬青霉對爪哇根結(jié)線蟲卵囊和分散卵粒的相對孵化率分別為57.4%和23.75%.汪來發(fā)等以為這可能與菌絲寄生卵的機制有關(guān)，在寄生經(jīng)過中孢子要先附著在卵外表萌發(fā)，繼而菌絲發(fā)育而纏繞整個卵，而卵囊中的粘性基質(zhì)更有利于孢子的附著萌發(fā)和菌絲發(fā)育，分散卵由于受外表消毒的影響，沒有了粘性基質(zhì)且部分卵始終不能孵化.盆栽試驗以新鮮根結(jié)、病土和淡紫擬青霉混合接種，比擬符合田間實際，未設(shè)計不同劑量處理，需進一步討論多個劑量處理試驗，為田間試驗施用劑量提供根據(jù)。淡紫擬青霉自然寄生率低，為了開發(fā)生防菌物資源，研究者們對該菌作了大量的生防研究，當前已廣泛應(yīng)用于防治根結(jié)線蟲、孢囊線蟲等有害植物線蟲的防治實踐中。但由于土壤存在不同程度的抑菌現(xiàn)象及菌株本身與植物根部親和力的影響，這是應(yīng)用生防菌防治植物寄生線蟲不穩(wěn)定的重要原因.因而有必要從生防菌次生代謝物中尋找具有活性的物質(zhì)。Park等在淡紫擬青霉發(fā)酵液中檢測到灰白制菌素〔Leucinostatin〕的產(chǎn)生，且具有殺線蟲活性.淡紫擬青霉發(fā)酵液中檢測到6種具有內(nèi)切活性的幾丁質(zhì)酶，灰白制菌素同幾丁質(zhì)酶相結(jié)合，可作為挑選高效淡紫擬青霉生產(chǎn)菌株的指標.除此之外淡紫擬青霉發(fā)酵液還具有類似生長素和細胞分裂