基因功能分析的基本策略

基因功能分析的基本策略第七章基因功能分析的基本策略基因功能是在細(xì)胞組成的多層次的復(fù)雜生命體中實(shí)現(xiàn)的，因此對基因功能的研究將極大程度上依賴于

對模式生物的研究?；蚯贸夹g(shù)、轉(zhuǎn)基因動物模型、基因轉(zhuǎn)染細(xì)胞模型、RNA干涉技術(shù)的發(fā)展，成為基因功能分析的有力工具。

第一節(jié)利用轉(zhuǎn)基因模型研究基因的功能

利用動物模型研究未知基因的功能，就是將某一基因從動物基因組中剔除或?qū)⑼庠椿蛞雱游?/p>

基因組，產(chǎn)生在遺傳上經(jīng)過基因工程修飾(改造)的動物，實(shí)現(xiàn)在整體動物、細(xì)胞或分子水平上認(rèn)識基因的功能或人類疾病發(fā)生的分子機(jī)制。

轉(zhuǎn)基因技術(shù)概念轉(zhuǎn)基因技術(shù)是指將外源基因?qū)胧芫鸭?xì)胞或胚胎干細(xì)胞中，通過外源基因與細(xì)胞染色體DNA之間隨機(jī)重組的發(fā)生而將外源基因插入到受體細(xì)胞染色體DNA上的過程。利用轉(zhuǎn)基因技術(shù)可以制備轉(zhuǎn)基因生物或穩(wěn)定轉(zhuǎn)染細(xì)胞。通常所指的轉(zhuǎn)基因生物是指將外源基因?qū)胧芫鸭?xì)胞或胚胎干細(xì)胞中，使外源基因通過隨機(jī)重組插入到受體細(xì)胞的染色體上，并隨細(xì)胞的分裂而將外源基因遺

傳給后代。

一、轉(zhuǎn)基因動物轉(zhuǎn)基因動物是指應(yīng)用轉(zhuǎn)基因技術(shù)培育出的攜帶外源基因的動物。轉(zhuǎn)基因過程：1、轉(zhuǎn)基因載體的構(gòu)建；2、將轉(zhuǎn)基因載體導(dǎo)入受精卵細(xì)胞或胚胎干細(xì)胞；3、將轉(zhuǎn)基因受精卵或胚胎干細(xì)胞植入假孕小鼠子宮內(nèi)；4、對轉(zhuǎn)基因動物進(jìn)行鑒定。

啟動子轉(zhuǎn)基因載體

結(jié)構(gòu)基因

報(bào)告基因注射

受精

增強(qiáng)子全能性細(xì)胞

轉(zhuǎn)基因小鼠

植入

Southernblot假孕小鼠

RT-PCRWesternblot

后代

轉(zhuǎn)基因動物應(yīng)用：1、通過轉(zhuǎn)基因動物來研究特定基因在組織中特異表達(dá)或表達(dá)的時(shí)相；

2、在活體內(nèi)研究或發(fā)現(xiàn)基因的新功能；3、可用于只在胚胎期才表達(dá)的基因結(jié)構(gòu)和功能研究；4、建立研究外源基因表達(dá)、調(diào)控的動物模型；5、遺傳性疾病的研究；6、建立人類疾病的動物模型，為人類的基因治療提供依據(jù)；7、動物新品種的培育；8、基因工程產(chǎn)品的制備；

轉(zhuǎn)基因技術(shù)存在的問題1、不能將外源基因定向地插入受精卵細(xì)胞染色體的特定部位；2、外源基因隨機(jī)整合可能引起插入突變，破壞宿主基

因組功能；3、外源基因隨機(jī)整合在宿主染色體上的拷貝數(shù)不同，可能出現(xiàn)不同表現(xiàn)型；

4、整合的外源基因遺傳丟失而導(dǎo)致轉(zhuǎn)基因動物癥狀的不穩(wěn)定遺傳。

二、穩(wěn)定轉(zhuǎn)染細(xì)胞穩(wěn)定轉(zhuǎn)染細(xì)胞是一種最常用的細(xì)胞水平的轉(zhuǎn)基因模型，外源基因通過轉(zhuǎn)基因過程插入到細(xì)胞染色體中，使外源基因可以作為細(xì)胞染色體的一部分得以在細(xì)胞中穩(wěn)

定表達(dá)。穩(wěn)定轉(zhuǎn)染細(xì)胞基本過程：1、真核重組表達(dá)質(zhì)粒的構(gòu)建：

將外源基因和真核表達(dá)質(zhì)粒連接構(gòu)建成重組質(zhì)粒；2、

在原核細(xì)胞中復(fù)制擴(kuò)增和克隆化真核重組表達(dá)質(zhì)粒；3、將重組表達(dá)質(zhì)粒轉(zhuǎn)染哺乳動物細(xì)胞；4、重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)染細(xì)胞的克隆化篩選、保存；5、轉(zhuǎn)染細(xì)胞表達(dá)目的蛋白、提

取、鑒定。

第二節(jié)

基因敲除技術(shù)

基因敲除技術(shù)是指通過DNA同源重組定向?qū)⑼庠椿虿迦胨拗骷?xì)胞染色體DNA,從而使特定基因在細(xì)胞內(nèi)

或生物體內(nèi)失活的過程。如果通過同源重組定向地在活體內(nèi)剔除特定基因的動物稱為基因敲除動物。目前基因敲除小鼠是應(yīng)用最廣泛的

動物模型之一。

基因敲除技術(shù)的基本過程：1、打靶載體的構(gòu)建：一般包括三次DNA體外重組①、將待剔除基因作為目的基因克隆到特定克隆載體上；

②、將帶有目的基因的重組載體作為克隆載體，利用合適的內(nèi)切酶將目的基因片段的大部分切除，使目的基因活性足以喪失，然后以此線性載體作為克隆載體，將一個(gè)陽性篩選標(biāo)志基因插入連接到目的基因的中段；例如；Neor基因：使細(xì)胞具有抵抗新霉素(G418)能力。

③、在目的基因外側(cè)線性化重組載體，并將一個(gè)陰性篩選標(biāo)志基因克隆到此。例如：單純庖疹病毒(HSV)的胸苷激酶的編碼基因?yàn)镠SV-tk。當(dāng)它在細(xì)胞內(nèi)合成出

胸苷激酶時(shí)，可以分解細(xì)胞培養(yǎng)液中加入的單核苷酸類似物而產(chǎn)生有毒的分解物使細(xì)胞死亡。這樣打靶載體包含了部分待剔除的基因片段、陽性篩選標(biāo)志基因、陰性篩選標(biāo)志基因。

在特定基因剔除時(shí)，利用打靶載體上留下的部分待剔除的基因片段作為基因組上相同基因的同源臂，當(dāng)打靶載體與細(xì)胞基因組的同源基因發(fā)生同源重組時(shí)，打靶載體上的失活基因替代基因組上的基因，同時(shí)利用插入在基因同源臂之間的陽性、陰性標(biāo)志基因進(jìn)行鑒定。

2、將打靶載體導(dǎo)入小鼠胚胎干細(xì)胞中；胚胎干細(xì)胞通常取自小鼠胚胎早期的內(nèi)細(xì)胞團(tuán)，該細(xì)胞能在體外培養(yǎng)，并保留發(fā)育的全能性。3、用陽性篩選標(biāo)志和陰性篩選標(biāo)志對轉(zhuǎn)染的胚胎干細(xì)胞

進(jìn)行篩選。4、將發(fā)生同源重組的胚胎干細(xì)胞導(dǎo)入小鼠胚泡中，然后將胚泡植入假孕小鼠子宮中；

5、篩選嵌合體小鼠。通常同源重組一般只發(fā)在一條染色體上，可以用Neor基因作探針，通過Southernblot鑒定。6、雜交育種，獲得基因剔除的純合體小鼠

待剔除基因

克隆載體

打靶載體

克隆重組載體

切割基因使待剔除基因失去活性連接

HSV-tk

陽性標(biāo)記基因Neor

內(nèi)切酶消化線性化打靶載體

打靶載體轉(zhuǎn)染基因組

純合子小鼠(基因剔除)兄妹交配

雜合子小鼠

同源重組

正常小鼠

交配

雜合子小鼠

同源重組的胚胎干細(xì)胞

雜合子

小鼠

植入胚泡

假孕小鼠

第三節(jié)利用基因沉默技術(shù)對基因功能進(jìn)行分析

結(jié)構(gòu)基因功能最終是通過其表達(dá)的蛋白質(zhì)來體現(xiàn)，因此結(jié)構(gòu)基因功能的研究可以在RNA水平上進(jìn)行，

通過干預(yù)蛋白質(zhì)的翻譯過程或減少蛋白質(zhì)的產(chǎn)量來分析基因的功能。目前在RNA水平上分析基因功能的方法主要有兩類：一類是反義RNA技術(shù)封閉mRNA的功能；另一類是RNA干涉技術(shù)使基因處于沉默狀態(tài)。

一、反義RNA技術(shù)反義RNA技術(shù)是根據(jù)RNA序列人工合成的互補(bǔ)RNA。根

據(jù)反義RNA的作用機(jī)制可將其分為三類：1、反義RNA是直接作用于靶mRNA的核蛋白體結(jié)合位點(diǎn)或與靶mRNA直接結(jié)合形成雙鏈RNA,從而直接抑制

mRNA的翻譯或被RNA酶Ⅲ識別降解。2、反義RNA是與mRNA的非編碼區(qū)結(jié)合，引起mRNA構(gòu)象的變化，從而抑制其翻譯。

3、反義RNA是作用于基因的啟動子，直接抑制靶mRNA的轉(zhuǎn)錄。

二、RNA干涉技術(shù)最早是由AndrewFire和CraigMellocai兩人在1998