核酸 結構的學習材料

核酸結構的學習材料第1頁/共164頁二十世紀是二十一世紀是物理學生命科學的世紀的世紀生命是生命=核酸+蛋白質二十一世紀是核酸、蛋白質的世紀？第2頁/共164頁第一節(jié)核酸概論

一、核酸的發(fā)現和研究簡史第3頁/共164頁第4頁/共164頁二、核酸的種類和分布（一）脫氧核糖核酸（deoxyribonucleicacid,DNA)原核：裸露的DNA分子集中于核區(qū)真核：細胞核DNA：與組蛋白、非組蛋白形成染色體細胞器DNA：雙鏈環(huán)形，一般裸露第5頁/共164頁第6頁/共164頁（二）核糖核酸（ribonucleicacid,RNA)1、轉移RNA（transferRNA,tRNA):保守性最強2、核糖體RNA（ribosomalRNA,rRNA)3、信使RNA（mesengerRNA,mRNA)4、特殊功能的RNASmallnuclearRNA,snRNASmallnucleoarRNA,snoRNASmallcytoplasmicRNA,scRNAAntisenseRNARibozymeRNaseP第7頁/共164頁三、核酸的功能（一）DNA是主要的遺傳物質1944，O.Avery肺炎雙球菌轉化實驗1952，A.DHershey和M.Chase噬菌體感染實驗第8頁/共164頁第9頁/共164頁第10頁/共164頁第11頁/共164頁第12頁/共164頁第13頁/共164頁（二）RNA功能的多樣性1、參與蛋白質的合成2、RNA的轉錄后加工與修飾3、參與基因表達的調控4、生物催化作用第14頁/共164頁第二節(jié)核酸的結構第15頁/共164頁核酸（nucleicacid)核苷酸(nucleotide)

磷酸(phosphoricacid)核苷(nucleoside)

戊糖(pentose)堿基(base)一、核酸的化學組成第16頁/共164頁P479表13-1兩類核酸的基本化學組成RNA：D-核糖，A、G、C、U堿基DNA：D-2-脫氧核糖，A、G、C、T堿基第17頁/共164頁（一）、

堿基P479結構式1.嘧啶堿：尿嘧啶胞嘧啶胸腺嘧啶2.

嘌呤堿：腺嘌呤鳥嘌呤

嘌呤衍生物：

3.核酸中的修飾堿基：100余種，多數是甲基化的產物P479表13-2核酸中的稀有堿基第18頁/共164頁第19頁/共164頁第20頁/共164頁第21頁/共164頁（二）、

核苷與脫氧核苷1、基本核苷P480結構式腺嘌呤核苷胞嘧啶脫氧核苷第22頁/共164頁★嘧啶堿：C1—N1，嘌呤堿：C1—N9?！锖怂嶂械暮塑张c脫氧核苷均為β-型★堿基平面與核糖平面互相垂直第23頁/共164頁2、核酸中的稀有核苷★稀有堿基★稀有糖苷鍵：假尿嘧啶核苷（ψ）P481★甲基化核糖第24頁/共164頁（三）、

核苷酸核苷中戊糖C2

、C3、C5羥基被磷酸酯化P481結構式：5’-AMP3’-dCMP第25頁/共164頁1、

構成DNA、RNA的核苷酸

P481表13-4DNA：dAMP、dGMP、dCMP、dTMPRNA：AMP、GMP、CMP、UMP第26頁/共164頁2、

細胞內的游離核苷酸及其衍生物①核苷5’-多磷酸化合物ATP、GTP、CTP、ppppA、ppppG在能量代謝和物質代謝及調控中起重要作用。②環(huán)核苷酸3’,5’-cAMP，3’,5’-cGMP信號分子，cAMP調節(jié)細胞的糖代謝、脂代謝。③核苷5’多磷酸3’多磷酸化合物ppGpppppGppppApp④核苷酸衍生物HSCoA、NAD+、NADP+、FAD等輔助因子。GDP-半乳糖、GDP-葡萄糖等是糖蛋白生物合成的活性糖基供體。第27頁/共164頁第28頁/共164頁第29頁/共164頁第30頁/共164頁第31頁/共164頁二、

DNA的結構一級結構：脫氧核苷酸分子間連接方式及排列順序。二級結構：DNA的兩條多聚核苷酸鏈間通過氫鍵形成的雙螺旋結構。三級結構：DNA雙鏈進一步折疊卷曲形成的構象。第32頁/共164頁（一）、

DNA的一級結構蛇毒磷酸二酯酶水解DNA（RNA）得5’-核苷酸牛脾磷酸二酯酶水解DNA（RNA）得3’-核苷酸P482圖13-1磷酸二酯酶對核酸的水解作用★DNA是dAMP、dGMP、dCMP、dTMP通過3’、5’-磷酸二酯鍵連接起來的線形或環(huán)形多聚體。

P483圖13-2DNA中多核苷酸的一個片段及縮寫符號

第33頁/共164頁寫法：5’→3’：5’-pApCpTpG-3’，或5’…ACTG…3’第34頁/共164頁★

DNA一級結構的不均一性（1）重復序列★正向重復(?repeat)★反向重復（回文序列）(invertedrepeat,palindromesequence)較長的回文結構，可形成莖環(huán)結構(發(fā)夾結構)或十字形結構較短的回文序列，可作為一種特別信號，如限制性核酸內切酶的識別位點。轉錄的終止作用與回文結構有關。★鏡象重復（mirrorrepeat)某些情況下可以三股螺旋DNA第35頁/共164頁第36頁/共164頁第37頁/共164頁第38頁/共164頁第39頁/共164頁★高度重復序列（highrepetivesequence,sateliteDNA，SSR)2-10bp/copy105-106copies/genome多為串聯重復排列（tandemrepeats)分布于著絲點、端粒區(qū)、結構基因兩側★中度重復序列（middlerepetitivesequence)0.1-1Kb/copy10-104copies/genome多為間隔重復rDNA\tDNA\Histonegenecluster★低拷貝重復：基因家族★單拷貝序列（singlecopysequence)第40頁/共164頁（2）富含AT的序列很多有重要調節(jié)功能的DNA區(qū)段都富含AT堿基對。特別是在復制起點和轉錄啟動的Pribnow區(qū)，富含AT對。第41頁/共164頁（二）、

DNA的二級結構1953年，Watson和Crick根據Chargaff規(guī)律和DNANa鹽纖維的X光衍射分析提出了DNA的雙螺旋結構模型。第42頁/共164頁★Chargaff規(guī)律1950年a.所有生物的DNA中，A=T，G=C且A+G=C+T。P485表13-5。b.DNA的堿基組成具有種的特異性。c.DNA堿基組成沒有組織和器官的特異性。d.年齡、營養(yǎng)狀況、環(huán)境等因素不影響DNA的堿基組成。第43頁/共164頁★DNA的Na鹽纖維和DNA晶體的X光衍射分析。Franklin第44頁/共164頁1、

Watson-Crick雙螺旋結構模型(B-DNA)P486圖13-5★兩條反平行的多核苷酸鏈繞同一中心軸相纏繞，形成右手雙股螺旋，一條5’→3’，另一條3’→5’★磷酸與脫氧核糖彼此通過3‘、5‘-磷酸二酯鍵相連接，構成DNA分子的骨架。★磷酸與脫氧核糖在雙螺旋外側，嘌呤與嘧啶堿位于雙螺旋的內側?！飰A基平面與縱軸垂直，糖環(huán)平面與縱軸平行★兩條核苷酸鏈之間依靠堿基間的氫鏈結合在一起?！锫萑χg主要靠堿基平面間的堆積力維持★每圈螺旋含10個核苷酸，堿基堆積距離0.34nm，雙螺旋平均直徑2nm，★大溝：寬1.2nm，深0.85nm，小溝：寬0.6nm，深0.75nm第45頁/共164頁★兩條反平行的多核苷酸鏈繞同一中心軸相纏繞，形成右手雙股螺旋，一條5’→3’，另一條3’→5’第46頁/共164頁★磷酸與脫氧核糖彼此通過3‘、5‘-磷酸二酯鍵相連接，構成DNA分子的骨架?！锪姿崤c脫氧核糖在雙螺旋外側，嘌呤與嘧啶堿位于雙螺旋的內側。第47頁/共164頁★堿基平面與縱軸垂直，糖環(huán)平面與縱軸平行★兩條核苷酸鏈之間依靠堿基間的氫鏈結合在一起。★螺圈之間主要靠堿基平面間的堆積力維持第48頁/共164頁★每圈螺旋10.4nt，堿基堆積距0.34nm，雙螺旋平均直徑2nm，★大溝：寬1.2nm，深0.85nm，★小溝：寬0.6nm，深0.75nm第49頁/共164頁第50頁/共164頁第51頁/共164頁第52頁/共164頁2、穩(wěn)定雙螺旋結構的因素①堿基堆積力形成疏水環(huán)境（主要因素）。②堿基配對的氫鍵。GC含量越多，越穩(wěn)定。③磷酸基上的負電荷與介質中的陽離子或組蛋白的正離子之間形成離子鍵，中和了磷酸基上的負電荷間的斥力，有助于DNA穩(wěn)定。④堿基處于雙螺旋內部的疏水環(huán)境中，可免受水溶性活性小分子的攻擊。第53頁/共164頁3、

DNA二級結構的多型性P489表13-6A-、B-、Z-DNA的比較相對濕度92%：B—DNA相對濕度75%：A—DNA。

第54頁/共164頁（1）

B—DNA：典型的Watson-Crick雙螺旋DNA右手雙螺旋每圈螺旋10.4個堿基對螺距：3.32nm（2）

A-DNA右手雙螺旋，外形粗短。RNA-RNA、RNA-DNA雜交分子具有這種結構。（3）Z-DNA左手螺旋，外形細長。天然B-DNA的局部區(qū)域可以形成Z-DNA。第55頁/共164頁第56頁/共164頁第57頁/共164頁（4）

三股螺旋DNAK.Hoogsteen1963通常是一條同型寡核苷酸與寡嘧啶核苷酸-寡嘌呤核苷酸雙螺旋的大溝結合：oligo(Py):oligo(Pu)—oligo(Py/Pu)第58頁/共164頁★第一股是寡嘧啶，中間是寡嘌呤，第三股可以是寡嘧啶或寡嘌呤第59頁/共164頁T=A:A,C≡G：C+T=A:TC≡G：GP489圖13-10三股螺旋DNA中的Hoogsteen-bonding★第三股與寡嘌呤之間同向平行，并按Hoogsteen配對第60頁/共164頁★當DNA的一段寡嘧啶（寡嘌呤）構成鏡像重復時可以形成三股螺旋（鉸鏈DNA，hingedDNA,H-DNA)P490圖13-11H-DNA的結構第61頁/共164頁★DNA三股螺旋結構常出現在DNA復制、轉錄、重組的起始位點或調節(jié)位點，如啟動子區(qū)。第三股鏈的存在可能使一些調控蛋白或RNA聚合酶等難以與該區(qū)段結合，從而阻遏有關遺傳信息的表達。第62頁/共164頁第63頁/共164頁第64頁/共164頁(三）、

DNA的三級結構DNA在雙螺旋的基礎上通過扭曲和折疊形成的構象★超螺旋是DNA三級結構的主要形式第65頁/共164頁1、

環(huán)狀DNA的三種典型構象P491圖13-12（1）、

松弛環(huán)形DNA線形DNA直接環(huán)化（2）、

解鏈環(huán)形DNA線形DNA擰松后再環(huán)化（3）、

正超螺旋與負超螺旋DNA第66頁/共164頁MOV:PBC\A0267501\supercoilingofDNA第67頁/共164頁第68頁/共164頁2、三種環(huán)形DNA的拓撲學特性第69頁/共164頁①連環(huán)數（linkingnumber,L）DNA雙螺旋中，一條鏈以右手螺旋繞另一條鏈纏繞的次數②扭轉數（twistingnumber,T）DNA分子中的Watson-Crick螺旋數目，以T表示③超螺旋數（纏繞數,writhingnumber,W）連環(huán)數（L）纏繞數（T）扭曲數W松馳環(huán)25250解鏈環(huán)23230超螺旋2325-2L=T+W第70頁/共164頁④比連環(huán)差（specificlinkingdifference,λ）表示DNA的超螺旋程度(Superhelixdensity)λ=（L—L0）/L0=每一圈初級螺旋（10bp，360°）出現超螺旋數L0是指松馳環(huán)形DNA的L值第71頁/共164頁一般天然DNA分子中σ=-0.05=5%負向超螺旋SV405226bpT=522W=-26(L=496)σ=-0.05E.coli4.2X106bpT=4.2X105W=4.2X105X-0.05=-2X104負超螺旋DNA是由于兩條鏈的纏繞不足引起（L），很易解鏈，易于參加DNA的復制、重組和轉錄等第72頁/共164頁3、

拓撲異構酶改變DNA拓撲異構體的L值。①拓撲異構酶酶I（解旋酶）能使雙鏈負超螺旋DNA轉變成松馳形環(huán)狀DNA，每次催化使L值增加1。②拓撲異構酶酶II（促旋酶）能使松馳環(huán)狀DNA轉變成負超螺旋形DNA，每次催化使L減少2。第73頁/共164頁4、染色體的結構（1）、整個病毒可以看成游離的染色體組成：核酸、蛋白、脂類、糖類基因組：單鏈或雙鏈的DNA（或RNA），多數環(huán)狀形狀：絲狀、多面體狀、P493圖13-13一些噬菌體的結構第74頁/共164頁（2）、細菌染色體的結構——

（擬核，nucleoid)細菌基因組多數為雙鏈環(huán)狀DNA，與堿性蛋白、RNA結合，形成帶有無數突環(huán)的刷狀染色體P494圖13-15細菌的擬核結構第75頁/共164頁（3）、真核生物染色體的結構染色質、染色體常染色質、異染色質永久性異染色質、功能性異染色質核小體（nucleosome):146bp,組蛋白：H2A、H2B、H3、H4P495圖13-17真核生物染色體DNA的組裝層次第76頁/共164頁MOV：MCB4.0\threedimensionalpackingofnuclearchromosomes第77頁/共164頁三、

RNA的結構第78頁/共164頁（一）、

RNA的一級結構P483AMP、GMP、CMP、UMP通過3’、5’磷酸二酯鍵形成的線形多聚體。

P484圖13-3RNA分子中的一段結構第79頁/共164頁①

組成RNA的戊糖是核糖②

RNA的U替代DNA中的T，此外，RNA中常有一些稀有堿基。③

天然RNA分子都是單鏈線形分子，只有部分區(qū)域是A-型雙螺旋結構。第80頁/共164頁（二）、

tRNA的結構★70-90b，分子量在25kd左右，沉降系數4S左右★有較多稀有堿基★3’末端為…CCA-OH★5’末端大多為pG…或pC…★二級結構是三葉草形★倒L形的三級結構

P496三葉草形的二級結構氨基酸臂二氫尿嘧啶環(huán)反密碼環(huán)額外環(huán)TC環(huán)（假尿嘧啶環(huán)）497倒L形的三級結構第81頁/共164頁第82頁/共164頁★tRNA的功能：●轉運氨基酸●識別密碼子●參與翻譯起始●參與DNA的反轉錄●參與基因表達調控第83頁/共164頁（三）、

mRNA的結構原核：多順反子（polycistronicmRNA)真核：單順反子，斷裂基因（splitedgene)第84頁/共164頁1、

真核mRNA的結構P484圖13-4真核mRNA的結構第85頁/共164頁★

5’-帽子：m7G5’-ppp5’-Nm（

Nm）p-O型：m7G5’-ppp5’-Np-I：m7G5’-ppp5’-Nmp-Np-II:m7G5’-ppp5’-Nmp-Nmp-Np-甲基鳥苷5’，5’-三磷酸第86頁/共164頁●由甲基化酶催化●可抵抗5’核酸外切酶降解mRNA?！窨蔀楹颂求w提供識別位點，使mRNA很快與核糖體結合，促進蛋白質合成起始復合物的形成。第87頁/共164頁★

3’-端有一段約30-300核苷酸的polyA。

●轉錄后由poly(A)聚合酶催化加尾●PolyA是mRNA由核進入胞質所必需的形式。●polyA與mRNA半壽期有關，PolyA大大提高mRNA在胞質中的穩(wěn)定性。第88頁/共164頁2、

原核mRNA的結構（多順反子）★由先導區(qū)、插入序列、翻譯區(qū)和末端序列組成。沒有5’帽子和3’polyA?！颯D序列：5’端先導區(qū)中，有一段富含嘌呤的堿基序列，典型的為5’-AGGAGGU-3’，位于起始密碼子AUG前約10核苷酸處，此序列由Shine和Dalgarno發(fā)現，稱SD序列。★SD序列和核糖體16S的rRNA的3’末端富含嘧啶堿基的序列互補。第89頁/共164頁（四）、

rRNA的結構細菌：16SrRNA、5SrRNA、23SrRNA組成30S轉錄單位真核：18SrRNA、5.8SrRNA，28SrRNA組成45S的轉錄單位，5SrRNA單獨轉錄。小亞基大亞基轉錄單位原核1652330真核185（單獨轉錄）285.85+45第90頁/共164頁大腸桿菌5SrRNA結構P498圖13-2016S、5SrRNA的結構第91頁/共164頁★rRNA的功能：●組成核糖體●催化肽鍵形成的轉移酶活性存在于23SrRNA上●參與tRNA與mRNA的結合第92頁/共164頁第三節(jié)

核酸的物理化學性質第93頁/共164頁一、核酸的水解自學第94頁/共164頁（一）酸水解★對酸的敏感性：糖苷鍵＞磷酸酯鍵嘌呤糖苷鍵＞嘧啶糖苷鍵★脫嘌呤：

pH1.6，37℃，對水透析

pH2.8，100℃，1h★脫嘧啶：

98-100%甲酸，175℃，2h

三氟乙酸，155℃，60min（DNA）或80min（RNA）★利用酸水解可以研究核酸的堿基組成第95頁/共164頁（二）、

堿水解★RNA的磷酸酯鍵對堿敏感室溫，0.3~1mol/LKOH，24h，可將RNA完全水解，得到2’-或3’-核苷酸的混合物。★DNA抗堿水解★生理意義：DNA更穩(wěn)定，遺傳信息。RNA是DNA的信使，完成任務后迅速降解。第96頁/共164頁（三）、

酶水解★非特異的磷酸二酯酶：蛇毒磷酸二酯酶水解DNA（RNA）得5’-核苷酸牛脾磷酸二酯酶水解DNA（RNA）得3’-核苷酸★特異的磷酸二酯酶：核酸酶第97頁/共164頁1、核酸酶的分類★底物專一性：核糖核酸酶RNase

脫氧核糖核酸酶DNase★作用方式：核酸外切酶（exonuclease)、核酸內切酶(endonuclease)單鏈核酸酶、雙鏈核酸酶、雜鏈核酸酶★磷酸二酯鍵的斷裂方式：5’-（寡）核苷酸3’-（寡）核苷酸第98頁/共164頁2、RNAase★RNaseH作用于DNA-RNA中的RNA鏈★牛胰核糖核酸酶（pancreaticribonuclease),RNaseI最適pH：7.0-8.2產物：以3’-嘧啶核苷酸結尾的寡核苷酸，高度專一的內切酶★RNaseT1耐熱、耐酸產物：以3’-鳥苷酸結尾的寡核苷酸，專一性更高★RNaseT2產物：以3’-腺苷酸結尾的寡核苷酸第99頁/共164頁3、DNase★核酸酶S1作用于單鏈DNA部分★牛胰核糖核酸酶，DNaseI切斷雙鏈或單鏈DNA產物：以5’-磷酸為末端的寡核苷酸★DNA限制性內切酶第100頁/共164頁4、N-糖苷酶第101頁/共164頁二、

核酸的酸堿性質

選學磷酸和堿基均能發(fā)生兩性解離。DNA等電點4—4.5RNA等電點2—2.5第102頁/共164頁1、堿基的解離P504第103頁/共164頁2、核苷的解離P505第104頁/共164頁3、核苷酸的解離P506表14-1某些堿基、核苷、核苷酸的解離常數第105頁/共164頁4、核酸的滴定曲線P507圖14-1核苷酸的滴定曲線P507圖14-2小牛胸腺DNA的滴定曲線第106頁/共164頁三、

核酸的紫外吸收堿基、核苷、核苷酸和核酸在240~290nm的紫外波段有強烈的光吸收，λmax=260nm第107頁/共164頁1、

鑒定純度純DNA的A260/A280應為1.8（1.65-1.85）純RNA的A260/A280應為2.0。若溶液中含有雜蛋白或苯酚，則A260/A280比值明顯降低。2、

含量計算1ABS值相當于：50ug/mL雙螺旋DNA

或：40ug/mL單鏈DNA（或RNA）或：20ug/mL寡核苷酸3、判斷DNA是否變性在DNA的變性過程中，摩爾吸光系數增大（增色效應）在DNA的復性過程中，摩爾吸光系數減小（減色效應）第108頁/共164頁四、

核酸的變性、復性及雜交第109頁/共164頁(一)、

變性P508圖14-4DNA變性過程★核酸雙螺旋區(qū)的氫鍵斷裂，變成單鏈，不涉及共價鍵斷裂。第110頁/共164頁

★變性因素：熱變性酸堿變性（pH小于4或大于11）變性劑（尿素、鹽酸胍、甲醛）

★變性后的理化性質：260nm吸收值升高。粘度降低，浮力密度升高。二級結構改變，部分失活。第111頁/共164頁★

增色效應與減色效應增色效應：在DNA的變性過程中，摩爾吸光系數增大減色效應：在DNA的復性過程中，摩爾吸光系數減小?！顳NA的變性是爆發(fā)式的，變性作用發(fā)生在一個很窄的溫度范圍內。第112頁/共164頁1、

熔解溫度（Tm）：★DNA的雙螺旋結構失去一半時對應的溫度。濃度50ug/mL時，雙鏈DNAA260=1.00，完全變性（單鏈）A260=1.37當A260增加到最大增大值一半時，即1.185時，對應的溫度即為Tm。DNA的Tm一般在82—95℃之間第113頁/共164頁2、

影響DNA的Tm值的因素①DNA均一性。均一性高，變性的溫度范圍越窄，據此可分析DNA的均一性。第114頁/共164頁②G-C含量與Tm值成正比。測定Tm，可推知G-C含量。G-C%=（Tm-69.3）×2.44P509圖5-19圖14-5Tm值與GC含量的關系第115頁/共164頁③介質中離子強度離子強度高，Tm高。P509圖14-6第116頁/共164頁(二)、

復性變性DNA在適當（一般低于Tm20—25℃）條件下，兩條鏈重新締合成雙螺旋結構。第117頁/共164頁★復性機制：10-20bp成拉鏈★熱變性DNA在緩慢冷卻時可以復性，快速冷卻不能復性?！顳NA片段越大，復性越慢；★DNA濃度越大，復性越快?！飶托运俣瓤捎肅o·t衡量。Co為變性DNA原始濃度mol·L-1，t為時間，以秒表示。第118頁/共164頁P352圖5-22，不同DNA的復性動力學曲線。第119頁/共164頁●1個核苷酸對（A.U），若濃度為Co=1.0mmol/L，則50%復性時，Cot1/2=4×10-6mol.s/L，t=0.004秒全部復性，Cot=10-4，t=0.1秒●E.coli4.2×106堿基對，若濃度Co=1.0umol/L，則復性50%，Cot1/2=10mol.s/L，t=107秒，約115天。復性100%，Cot=500mol.s/L，t=5×108秒，5758天。●根據復性動力學可以測定基因組的大小和重復序列的拷貝數第120頁/共164頁(三)分子雜交第121頁/共164頁1、

SouthernBlottingDNA樣品→酶切→電泳→堿變性→轉膜→固定→雜交→洗滌→放射自顯影變性（NaOH0.5mol/L）轉膜（NC膜，尼龍膜）固定（80℃，4-6h）雜交（高鹽濃度，68℃，幾小時）SouthernBlotting可用于DNA之間同源性分析，確定特異性DNA序列的大小和定位。第122頁/共164頁第123頁/共164頁第124頁/共164頁2、

NorthernBlotting研究對象是mRNA，探針一般是DNA?？俁NA或mRNA需在變性條件下電泳（乙二醛、甲醛）3、

WesternBlotting抗原與抗體的雜交研究克隆基因表達產物、鑒定克隆株的常用技術。第125頁/共164頁第四節(jié)

核酸研究技術第126頁/共164頁一、

核酸的分離純化和定量盡可能保持其天然狀態(tài)，防止降解和變性。條件溫和，防止過酸、過堿、劇烈攪拌。抑制核酸酶。第127頁/共164頁（一）、

DNA分離純化真核DNA以核蛋白（DNP）形式存在，DNP溶于水或高鹽溶液（1mol/LNaCl），但不溶于低鹽溶液（0.14mol/LNaCl），據此，采用高鹽提取，低鹽沉淀，可將DNP與RNA核蛋白分開，提取出DNP。DNP可用水飽和的酚抽提，去除蛋白質。還可用氯仿異戊醇去除蛋白質。水相中的DNA可被0.3MNaAC-70%乙醇沉淀第128頁/共164頁（二）、RNA的制備★RNase的滅活：玻璃器皿：140-200，8塑料器皿：0.1%DEPC，37，過夜提取液加鹽酸胍或異硫氰酸胍反應體系中加RNasin等特異的RNase抑制劑第129頁/共164頁★用0.14mol/LNacl使DNP沉淀，上清中即為RNA核蛋白（RNP）。鹽酸胍、苯酚等去蛋白★異硫氰酸胍/苯酚/氯仿法★異硫氰酸胍/氯化銫密度梯度離心法蛋白質：＜1.33g/mlDNA：1.71g/ml左右RNA：＞1.89g/ml★mRNA的制備：oligo(dT)纖維素（瓊脂糖凝膠）親合層析法第130頁/共164頁（三）、核酸的定量P514紫外分光光度法定磷法定糖法第131頁/共164頁二、核酸的沉降特性與超速離心不同構象的核酸（線形、環(huán)形、超螺旋），密度和沉降速率不同，用Cs-Cl密度梯度離心可以將不同構象DNA、RNA與蛋白質區(qū)分開來這一方法常用于質粒DNA的純化。第132頁/共164頁（一）密度梯度超速離心測定核酸的浮力密度：8MCsCl，45000rpm，16h密度梯度：1.80g/ml→1.55g/ml平衡時：浮力密度=CsCl密度=離心力ρ=ρ0+4.2ω2（r2-r02）×10-10ρ：浮力密度ω：角速度（弧度/秒）r：樣品到轉軸的距離第133頁/共164頁（二）密度梯度超速離心測定DNA的G-C含量G-C含量與DNA的浮力密度之間呈正比關系ρ=0.1xG-C+1.658xG-C=（ρ-1.658）×10但是5-甲基胞嘧啶多的DNA，其實際浮力密度會降低，低于理論值。第134頁/共164頁（三）密度梯度超速離心研究核酸的構象RNA＞DNA變性DNA＞雙鏈DNA＞蛋白質，變性程度越大，浮力密度越大第135頁/共164頁（四）密度梯度超速離心純化RNA或不同構象的DNA超螺旋DNA或第136頁/共164頁三、

核酸的凝膠電泳（一）、

瓊脂糖電泳用于大片段DNA的分離，精度低，但分離范圍廣第137頁/共164頁★影響遷移率的因素：①

核酸分子的大小，遷移率與分子量的對數成反比②

凝膠濃度③

DNA的構象，超螺旋最快，線形其次，環(huán)形最慢。④

電壓，不大于5V/cm★染色：0.5ug/mlEB★RNA的瓊脂糖凝膠電泳一般要加入甲醛或戊二醛第138頁/共164頁第139頁/共164頁★瓊脂糖電泳可以用于DNA分子量的測定★瓊脂糖電泳可以用于DNA的制備與純化第140頁/共164頁（二）、

PAGE電泳用于小片段DNA的分析，精度非常高第141頁/共164頁四、限制性核酸內切酶與DNA物理圖譜構建（1979年發(fā)現）(一)、

限制修飾系統(tǒng)限制性內切酶往往與一種甲基化酶同時成對存在，構成一個限制修飾系統(tǒng)，甲基化酶使細菌自身的DNA帶上標志，限制性內切酶專門用于降解入侵的外源DNA第142頁/共164頁(二)、

II型限制性核酸內切酶限制和修飾活性分開，蛋白質結構是單一成分，輔助因子Mg2+，位點序列旋轉對稱（反向重復）。第143頁/共164頁★II型酶的切割頻率識別位點444=256646=4096848=65536

★限制酶的命名：E.coRI第一位：屬名E（大寫）第二、三位：種名的頭兩個字母小寫co第四位：菌株R第五位：從該細菌中分離出來的這一類酶的編號第144頁/共164頁★同裂酶：來源不同的限制酶（名稱自然不同），識別位點相同，切割位點相同，產生同樣的粘性末端。

BamHI：GG↓ATCCBstIGG↓ATCCMboIGAT↓CSau3AGAT↓C★同尾酶：來源各異，識別的靶序列不同，但都產生相同的粘性末端。BclITG↓ATCABglIIAG↓ATCA第145頁/共164頁★星號活力：在一定條件下（低離子強度，堿性pH，或50%甘油），限制酶的特異性降低。結果，它的識別與切割所需的典型的核苷酸序列的數量和種類會發(fā)生變化。

例如HindIIIAAG↓CTT第1