第一單元蛋白質(zhì)化學(xué)

第一單元蛋白質(zhì)化學(xué)第1頁(yè)，共143頁(yè)，2023年，2月20日，星期一1氨基酸:蛋白質(zhì)的構(gòu)件分子2氨基酸的分類3氨基酸的酸堿化學(xué)4氨基酸的化學(xué)反應(yīng)5氨基酸的光學(xué)活性和光譜性質(zhì)6氨基酸混合物的分析分離第2頁(yè)，共143頁(yè)，2023年，2月20日，星期一1氨基酸:蛋白質(zhì)的構(gòu)件分子酸水解：HCL、H2SO4引起消旋，但色氨酸破壞，羥基氨基酸部分水解，酰胺鍵水解。

堿水解：NaOH水解完全，會(huì)引起消旋，但色氨酸不破壞

酶水解：胰蛋白酶、胃蛋白酶水解不完全，不引起消旋，色氨酸不破壞，主要用于蛋白質(zhì)的部分水解。

1.1蛋白質(zhì)的水解蛋白質(zhì)是由氨基酸構(gòu)成的第3頁(yè)，共143頁(yè)，2023年，2月20日，星期一組成蛋白質(zhì)的20種氨基酸稱為基本氨基酸。它們中除脯氨酸外都是α-氨基酸，即在α-碳原子上有一個(gè)氨基。1.2α-氨基酸的一般結(jié)構(gòu)第4頁(yè)，共143頁(yè)，2023年，2月20日，星期一2氨基酸的分類2.1常見(jiàn)的蛋白質(zhì)氨基酸2.2不常見(jiàn)的蛋白質(zhì)氨基酸2.3非蛋白質(zhì)氨基酸第5頁(yè)，共143頁(yè)，2023年，2月20日，星期一2.1常見(jiàn)的蛋白質(zhì)氨基酸氨基酸有兩種分類方法：(1)按側(cè)鏈R基的結(jié)構(gòu)(2)按側(cè)鏈R基的極性第6頁(yè)，共143頁(yè)，2023年，2月20日，星期一按側(cè)鏈R基的結(jié)構(gòu)（1）脂肪簇氨基酸①中性氨基酸：Gly、Ala、Val、Leu、Ile②含羥基或硫氨基酸：Ser、Thr、Cys、Met③酸性氨基酸及其酰胺：Asp、Glu、Asn、Gln④堿性氨基酸：Lys、Arg（2）芳香簇氨基酸Phe、Tyr、Trp（3）雜環(huán)簇氨基酸His、Pro第7頁(yè)，共143頁(yè)，2023年，2月20日，星期一（1）非極性R基氨基酸Gly、Ala、Val、Leu、Ile、Met、Pro、Phe、Trp（2）不帶電荷的極性R基氨基酸Ser、Thr、Cys、Tyr、Asn、Gln（3）帶正電荷的R基氨基酸（4）帶負(fù)電荷的R基氨基酸Lys、Arg、HisAsp、Glu按側(cè)鏈R基的極性氨基酸有兩種分類方法第8頁(yè)，共143頁(yè)，2023年，2月20日，星期一編碼蛋白質(zhì)氨基酸的結(jié)構(gòu)、代號(hào)中性氨基酸第9頁(yè)，共143頁(yè)，2023年，2月20日，星期一第10頁(yè)，共143頁(yè)，2023年，2月20日，星期一第11頁(yè)，共143頁(yè)，2023年，2月20日，星期一第12頁(yè)，共143頁(yè)，2023年，2月20日，星期一第13頁(yè)，共143頁(yè)，2023年，2月20日，星期一第14頁(yè)，共143頁(yè)，2023年，2月20日，星期一第15頁(yè)，共143頁(yè)，2023年，2月20日，星期一

根據(jù)生物體的需要，可將氨基酸分為：必需氨基酸半必需氨基酸非必需氨基酸其余氨基酸ArgHisLys、ValIleLeupheMetTrpThr編碼蛋白質(zhì)的氨基酸分類第16頁(yè)，共143頁(yè)，2023年，2月20日，星期一2.2不常見(jiàn)的蛋白質(zhì)氨基酸有些不常見(jiàn)的氨基酸在某些蛋白質(zhì)中存在，是由相應(yīng)的常見(jiàn)氨基酸經(jīng)修飾而來(lái)。在結(jié)締組織的膠原蛋白中有5-羥賴氨酸、4-羥脯氨酸；肌球蛋白含有甲基化的氨基酸（6-N-甲基賴氨酸）；凝血酶原中發(fā)現(xiàn)了γ－羧基谷氨酸；細(xì)菌紫膜質(zhì)中存在焦谷氨酸；甲狀腺蛋白中Tyr的衍生物：

3.5

-二碘酪氨酸、甲狀腺素等。第17頁(yè)，共143頁(yè)，2023年，2月20日，星期一第18頁(yè)，共143頁(yè)，2023年，2月20日，星期一2.3非蛋白質(zhì)氨基酸除參與蛋白質(zhì)組成的20多種氨基酸外，生物體內(nèi)存在大量的氨基酸中間代謝產(chǎn)物，它們不是蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)單元，但在生物體內(nèi)具有很多生物學(xué)功能。（1）L-型α–氨基酸的衍生物：L-瓜氨酸和L-鳥(niǎo)氨酸（2）D-型氨基酸：D-Glu、D-Ala（肽聚糖中）、D-Phe（短桿菌肽S）（3）β-、γ-、δ-氨基酸：β-Ala（泛素的前體）、γ-氨基丁酸（神經(jīng)遞質(zhì)）。第19頁(yè)，共143頁(yè)，2023年，2月20日，星期一3氨基酸的酸堿化學(xué)氨基酸在結(jié)晶形態(tài)或在水溶液中，并不是以游離的羧基或氨基形式存在，而是以兼性離子的形式存在。在兩性離子中，氨基是以質(zhì)子化(-NH3+)形式存在，羧基是以離解狀態(tài)(-COO-)存在。3.1氨基酸的兼性離子形式第20頁(yè)，共143頁(yè)，2023年，2月20日，星期一

氨基酸在水中的兩性離子既能像酸一樣放出質(zhì)子，也能像堿一樣接受質(zhì)子，氨基酸具有酸堿性質(zhì)，是一類兩性電解質(zhì)。Asanacid（protondonor）：Asabase（protonacceptor）：3.2氨基酸的解離第21頁(yè)，共143頁(yè)，2023年，2月20日，星期一3.3氨基酸的等電點(diǎn)H3N—CH—COOHR+在酸性溶液中的氨基酸H3N—CH—COO-R+在晶體狀態(tài)或水溶液中的氨基酸H2N—CH—COO-R在堿性溶液中的氨基酸調(diào)節(jié)氨基酸溶液的pH，可以使氨基酸處于正負(fù)電荷相等即凈電荷為零得兼性離子狀態(tài)。此時(shí)氨基酸所處溶液的pH值稱為該氨基酸的等電點(diǎn)（pI）。（pH=pI）凈電荷=0（pH＞pI）凈電荷為負(fù)（pH＜pI）凈電荷為正3.3.1定義第22頁(yè)，共143頁(yè)，2023年，2月20日，星期一氨基酸在等電點(diǎn)狀態(tài)下，溶解度最小。pH

>

pI時(shí)，氨基酸帶負(fù)電荷，-COOH解離成-COO-，向正極移動(dòng)。pH

=

pI時(shí)，氨基酸凈電荷為零。pH

<

pI時(shí)，氨基酸帶正電荷，-NH2解離成-NH3+，向負(fù)極移動(dòng)。第23頁(yè)，共143頁(yè)，2023年，2月20日，星期一

實(shí)驗(yàn)證明在等電點(diǎn)時(shí)，氨基酸主要以兼性離子狀態(tài)存在，少數(shù)解離成數(shù)目相等的陽(yáng)離子和陰離子，以及極少數(shù)為中性分子。

第24頁(yè)，共143頁(yè)，2023年，2月20日，星期一3.3.2氨基酸等電點(diǎn)的確定1）酸堿滴定2）根據(jù)解離常數(shù)pK值計(jì)算第25頁(yè)，共143頁(yè)，2023年，2月20日，星期一甘氨酸滴定曲線一氨基一羧基AA的等電點(diǎn)計(jì)算：pI=2pK′1+pK′21）酸堿滴定Titrationofanaminoacid.Shownhereisthetitrationcurveof0.1Mglycineat25C.第26頁(yè)，共143頁(yè)，2023年，2月20日，星期一2）根據(jù)pK值中性氨基酸：以Gly為例pIGly=（pK1+pK2）/2=（2.34+9.60）/2=5.97第27頁(yè)，共143頁(yè)，2023年，2月20日，星期一酸性氨基酸，以Asp為例：第28頁(yè)，共143頁(yè)，2023年，2月20日，星期一堿性氨基酸，以Lys為例：第29頁(yè)，共143頁(yè)，2023年，2月20日，星期一氨基酸等電點(diǎn)的計(jì)算

氨基酸的pI值等于該氨基酸的兩性離子狀態(tài)兩側(cè)的基團(tuán)pK′值之和的二分之一。

PI＝（PK左’+PK右’）/2pI=2pK′1+pK′2一氨基一羧基AA的等電點(diǎn)計(jì)算：pI=2pK′2+pK′3二氨基一羧基AA的等電點(diǎn)計(jì)算：pI=2pK′1+pK′2一氨基二羧基AA的等電點(diǎn)計(jì)算：第30頁(yè)，共143頁(yè)，2023年，2月20日，星期一氨基酸兩性離子的NH3+是弱酸，其pKa為9.7左右，完全離解時(shí)溶液的pH約為10±，超出酸堿滴定指示劑的顯色范圍，不能用一般指示劑，例如酚酞，作酸堿滴定。但當(dāng)氨基酸的氨基與中性甲醛結(jié)合成氨基酸二羥甲基衍生物后，其氨基的堿性即大大減少，反應(yīng)向右進(jìn)行，兩性離子中NH3+基的酸性解離增加，NH3+的pKa值降低到6.5左右，溶液的pH降至6.7左右，此時(shí)NH3+離解釋出的H+即可以酚酞作指示劑用標(biāo)準(zhǔn)NaOH溶液加以滴定。每釋出的一個(gè)H+就相當(dāng)于一個(gè)氨基酸。甲醛滴定可用來(lái)測(cè)定蛋白質(zhì)的水解程度。當(dāng)氨基酸溶液中存在1mol/L甲醛時(shí)，滴定終點(diǎn)由pHl2左右移至9附近，亦即酚酞指示劑的變色區(qū)域。這就是甲醛滴定法的基礎(chǔ)。3.4氨基酸的甲醛滴定第31頁(yè)，共143頁(yè)，2023年，2月20日，星期一4氨基酸的化學(xué)反應(yīng)氨基酸的化學(xué)反應(yīng)主要是指它的α-氨基和α-羧基以及側(cè)鏈上的功能團(tuán)所參與的反應(yīng)。4.1α-氨基參加的反應(yīng)4.2α-羧基參加的反應(yīng)4.3α-氨基和α-羧基共同參加的反應(yīng)4.4側(cè)鏈R基參加的反應(yīng)。第32頁(yè)，共143頁(yè)，2023年，2月20日，星期一4.1α-氨基參加的反應(yīng)4.1.1與亞硝酸的反應(yīng)含游離α-氨基的氨基酸能與亞硝酸起反應(yīng)，定量地放出氮?dú)?，氨基酸被氧化成羥酸。含亞氨酸的脯氨酸則不能與亞硝酸反應(yīng)。第33頁(yè)，共143頁(yè)，2023年，2月20日，星期一

生成的N2可用氣體分析儀器加以測(cè)定，

即可算出氨基酸的含量。VanSlyke氨基氮測(cè)定法就是根據(jù)此反應(yīng)原理。第34頁(yè)，共143頁(yè)，2023年，2月20日，星期一Cbz-ClCbz-氨基酸4.1.2?；磻?yīng)

氨基酸的氨基與酰氯或酸酐在弱堿溶液中發(fā)生作用，氨基被酰基化。常作為蛋白質(zhì)合成中氨基的保護(hù)試劑。芐氧酰氯（Cbz-Cl）:第35頁(yè)，共143頁(yè)，2023年，2月20日，星期一氨基酸與5一二甲氨基萘-1-磺酰氯（dansylchloride,DNS）的反應(yīng)第36頁(yè)，共143頁(yè)，2023年，2月20日，星期一4.1.3烴基化反應(yīng)DNFB（dinitrofiuorobenzene）二硝基苯氨基酸DNP-Aa(黃色)++HF弱堿中氨基酸α-NH2的一個(gè)H原子可被烴基取代(鹵代烴)應(yīng)用：鑒定多肽或蛋白質(zhì)的N-末端氨基酸1）氨基酸與2,4一二硝基氟苯(DNFB)的反應(yīng)第37頁(yè)，共143頁(yè)，2023年，2月20日，星期一H2N—CH—COOH+RNCH3CH3O=S=OCl5-二甲氨基萘磺酰氯（DNS-Cl）pH9.740℃NCH3CH3O=S=OHN—CH—COOHRDNS-氨基酸DNS取代DNFB測(cè)定蛋白質(zhì)N端氨基酸，靈敏度高第38頁(yè)，共143頁(yè)，2023年，2月20日，星期一2）與異硫氰酸苯酯（PITC）的反應(yīng)苯硫乙內(nèi)酰脲氨基酸(PTH-AA)苯氨基硫甲酰氨基酸(PTC-AA)少一個(gè)氨基酸的多肽1950年能夠不斷重復(fù)循環(huán)，將肽鏈N-端氨基酸殘基逐一進(jìn)行標(biāo)記和解離。設(shè)計(jì)出“多肽順序自動(dòng)分析儀”第39頁(yè)，共143頁(yè)，2023年，2月20日，星期一4.2α-羧基參加的反應(yīng)1)成酯和成鹽反應(yīng)(堿或醇，羧基被保護(hù))2)酰氯化反應(yīng)?；噭?COCl，羧基活化3)脫羧反應(yīng)（胺）4)疊氮反應(yīng)（疊氮試劑，羧基活化）p138第40頁(yè)，共143頁(yè)，2023年，2月20日，星期一4.3α-氨基和α-羧基共同參加的反應(yīng)4.3.1與茚三酮的反應(yīng)（顏色反應(yīng)）第41頁(yè)，共143頁(yè)，2023年，2月20日，星期一對(duì)脯氨酸和羥脯氨酸反應(yīng)則生成黃色化合物，其結(jié)構(gòu)如下所示：反應(yīng)生成的化合物的顏色深淺程度以及CO2生成量，均可作為氨基酸定量分析依據(jù)。第42頁(yè)，共143頁(yè)，2023年，2月20日，星期一A.該反應(yīng)由NH2與COOH共同參與B.α-氨基酸反應(yīng)，生成藍(lán)紫色化合物C.該反應(yīng)非常靈敏，微克級(jí)就可以反應(yīng)D.可在570nm測(cè)定吸光值，測(cè)定aa的含量E.可通過(guò)二氧化碳測(cè)定氨基酸含量。F.脯氨酸、羥脯氨酸與茚三酮反應(yīng)產(chǎn)生黃色化合物。應(yīng)用：A.氨基酸定量分析（先用層析法分離）B.氨基酸自動(dòng)分析儀：用陽(yáng)離子交換樹(shù)脂，將樣品中的氨基酸分離，自動(dòng)定性定量，記錄結(jié)果。與茚三酮反應(yīng)要點(diǎn)第43頁(yè)，共143頁(yè)，2023年，2月20日，星期一4.4側(cè)鏈R基參加的反應(yīng)氨基酸的側(cè)鏈基團(tuán)R有下列幾種：1．苯環(huán)(苯丙氨酸及酪氨酸)2．酚基(酪氨酸)3．OH基(絲氨酸、蘇氨酸)4．SH基及—S—S—鍵(半胱氨酸及胱氨酸)5．吲哚基(色氨酸)6．胍基(精氨酸)7．咪唑基(組氨酸)第44頁(yè)，共143頁(yè)，2023年，2月20日，星期一1）-S-S-和-SH的氧化還原反應(yīng)R-SH：HS-CH2CH2OH巰基乙醇（mercaptoethanol）HS-CH2COOH巰基乙酸（mercaptoaceticacid）HS-CH2(CHOH)2-CH2SH二硫蘇糖醇（dithiothreitol,DTT）還原劑氧化劑第45頁(yè)，共143頁(yè)，2023年，2月20日，星期一

半胱氨酸的-SH很活潑，很容易在空氣中重新氧化形成二硫鍵，一般可用鹵代化物對(duì)-SH進(jìn)行保護(hù)。第46頁(yè)，共143頁(yè)，2023年，2月20日，星期一（2）苯環(huán)的黃色反應(yīng)phe+少量濃H2SO4+濃HNO3

黃色TyrorTrp+濃HNO3

黃色第47頁(yè)，共143頁(yè)，2023年，2月20日，星期一（3）酚基的Millon反應(yīng)（米倫氏反應(yīng)）HgNO3

Tyr+ Hg(NO3)2

紅色HNO3

第48頁(yè)，共143頁(yè)，2023年，2月20日，星期一（4）pauly反應(yīng)His+重氮苯磺酸紅色（棕紅色）Tyr+重氮苯磺酸橘黃色第49頁(yè)，共143頁(yè)，2023年，2月20日，星期一（5）Folin---酚反應(yīng)+磷鉬酸Tyr磷鎢酸orTrp藍(lán)色（鉬藍(lán)與鎢藍(lán)混合物）第50頁(yè)，共143頁(yè)，2023年，2月20日，星期一5氨基酸的光學(xué)活性和光譜性質(zhì)5.1一般物理性質(zhì)無(wú)色晶體，熔點(diǎn)極高（200℃以上），不同味道；水中溶解度差別較大（極性和非極性），能溶于稀酸、稀堿，不溶于有機(jī)溶劑。手性碳原子：與α-碳原子相連的四個(gè)原子或基團(tuán)各不相同。5.2旋光性第51頁(yè)，共143頁(yè)，2023年，2月20日，星期一

組成蛋白質(zhì)的氨基酸除Gly以外，都有手性碳原子，所以都有旋光性，能使偏振光的偏振面的向左或向右旋轉(zhuǎn)，向左旋轉(zhuǎn)的稱左旋，用“一”號(hào)表示，向右旋轉(zhuǎn)的稱右旋，用“＋”號(hào)表示。第52頁(yè)，共143頁(yè)，2023年，2月20日，星期一比旋光度（單位濃度和單位長(zhǎng)度下的旋光度）是氨基酸的重要物理常數(shù)之一，是鑒別各種氨基酸的重要依據(jù)。第53頁(yè)，共143頁(yè)，2023年，2月20日，星期一5.3氨基酸的構(gòu)型

構(gòu)型（configuration）

：一個(gè)有機(jī)分子中各個(gè)原子特有的固定的空間排列。這種排列不經(jīng)過(guò)共價(jià)鍵的斷裂和重新形成是不會(huì)改變的。組成蛋白質(zhì)的氨基酸除Gly以外都有手性碳原子，在三維空間上就有兩種不同的排列方式，凡是與L－甘油醛構(gòu)型相同的，就定義為L(zhǎng)－氨基酸，反之為D－氨基酸。第54頁(yè)，共143頁(yè)，2023年，2月20日，星期一5.4氨基酸的光學(xué)活性和立體化學(xué)Gly一種構(gòu)型,無(wú)旋光性Thr和Ile有四種光學(xué)異構(gòu)體。其余17種氨基酸有兩種光學(xué)異構(gòu)體：L型、D型。構(gòu)成蛋白質(zhì)的氨基酸均屬L-型（L-蘇氨酸）。第55頁(yè)，共143頁(yè)，2023年，2月20日，星期一蛋白質(zhì)的酸或酶促水解得到的氨基酸都是L-型的，而用堿水解得到的都是無(wú)旋光性的DL-〔外〕消旋物。胱氨酸可以形成內(nèi)消旋胱氨酸。外消旋物：D-型和L-型的等摩爾混合物。內(nèi)消旋物：分子內(nèi)消旋胱氨酸有三種立體異構(gòu)體：L-胱氨酸、D-胱氨酸、內(nèi)消旋胱氨酸。L-胱氨酸和D-胱氨酸是消旋物第56頁(yè)，共143頁(yè)，2023年，2月20日，星期一構(gòu)成蛋白質(zhì)的20種氨基酸在可見(jiàn)光區(qū)都沒(méi)有光吸收，但在遠(yuǎn)紫外區(qū)(<220nm)均有光吸收。在近紫外區(qū)(220-300nm)只有酪氨酸、苯丙氨酸和色氨酸有吸收光的能力由于大多數(shù)蛋白質(zhì)都含有這些氨基酸殘基，因此用紫外分光光度法可測(cè)定蛋白質(zhì)含量。蛋白質(zhì)最大紫外吸收峰在280nm處。5.5氨基酸的光譜性質(zhì)第57頁(yè)，共143頁(yè)，2023年，2月20日，星期一6氨基酸混合物的分析分離層析法也稱色譜法，是1903年俄國(guó)植物學(xué)家MichaelTswett發(fā)現(xiàn)并命名的。他將植物葉子的色素通過(guò)裝填有吸附劑的柱子，各種色素以不同的速率流動(dòng)后形成不同的色帶而被分開(kāi)，由此得名為“色譜法”（Chromatography)。后來(lái)無(wú)色物質(zhì)也可利用吸附柱層析分離。英國(guó)生物學(xué)家Martin和Synge。他們首先提出了色譜塔板理論，以及其遠(yuǎn)見(jiàn)卓識(shí)的預(yù)言。1944年出現(xiàn)紙層析以后，層析法不斷發(fā)展，相繼出現(xiàn)薄層層析、親和層析、凝膠層析、氣相層析、高壓液相層析（HPLC）等。第58頁(yè)，共143頁(yè)，2023年，2月20日，星期一層析法是利用混合物中各組分物理化學(xué)性質(zhì)的差異（如吸附力、分子形狀及大小、分子親和力、分配系數(shù)等），使各組分在兩相（一相為固定的，稱為固定相；另一相流過(guò)固定相，稱為流動(dòng)相）中的分布程度不同，從而使各組分以不同的速度移動(dòng)而達(dá)到分離的目的。層析系統(tǒng)固定相（靜相）流動(dòng)相（動(dòng)相）6.1分配層析法的一般原理第59頁(yè)，共143頁(yè)，2023年，2月20日，星期一第60頁(yè)，共143頁(yè)，2023年，2月20日，星期一固定相：固定相是層析的一個(gè)基質(zhì)。它可以是固體物質(zhì)（如吸附劑，凝膠，離子交換劑等），也可以是液體物質(zhì)（如固定在硅膠或纖維素上的溶液），這些基質(zhì)能與待分離的化合物進(jìn)行可逆的吸附，溶解，交換等作用。流動(dòng)相：在層析過(guò)程中，推動(dòng)固定相上待分離的物質(zhì)朝著一個(gè)方向移動(dòng)的液體、氣體等，都稱為流動(dòng)相。柱層析中一般稱為洗脫劑，薄層層析時(shí)稱為展層劑。第61頁(yè)，共143頁(yè)，2023年，2月20日，星期一混合物在層折系統(tǒng)中的分離決定于該混合物的組分在這兩相中的分配情況，一般用分配系數(shù)來(lái)描述。Kd=CA/CB利用層析法分離混合物例如氨基酸混合物，其先決條件是各種氨基酸成分的分配系數(shù)要有差異，哪怕是很小的差異。一般差異越大，越容易分開(kāi)。CA：一種物質(zhì)在A相（流動(dòng)相）中的濃度CB：一種物質(zhì)在B相（固定相）中的濃度第62頁(yè)，共143頁(yè)，2023年，2月20日，星期一按操作形式不同分類：柱層析：將固定相裝于柱內(nèi)，使樣品沿一個(gè)方向移動(dòng)而達(dá)到分離。紙層析：用濾紙做液體的載體，點(diǎn)樣后，用流動(dòng)相展開(kāi)，以達(dá)到分離鑒定的目的。薄層層析：將適當(dāng)粒度的吸附劑鋪成薄層，以紙層析類似的方法進(jìn)行物質(zhì)的分離和鑒定。紙層析和薄層層析主要適用于小分子物質(zhì)的快速檢測(cè)分析和少量分離制備，通常為一次性使用，而柱層析是常用的層析形式，適用于樣品分析、分離。生物化學(xué)中常用的凝膠層析、離子交換層析、親和層析、高效液相色譜等都通常采用柱層析形式。第63頁(yè)，共143頁(yè)，2023年，2月20日，星期一6.2分配柱層析層析柱中的填充物或稱支持劑都是一些具有親水性的不溶物質(zhì)，如纖維索、淀粉、硅膠等：支持劑吸附著一層不會(huì)流動(dòng)的結(jié)合水，可以看作為固定相，沿固定相流動(dòng)的與它不互溶的溶劑(如苯酚、正丁醇等)是流動(dòng)相。第64頁(yè)，共143頁(yè)，2023年，2月20日，星期一6.3（濾）紙層析濾紙層析也是分配層析的一種。濾紙纖維素上吸附的水是固定相，展層用的溶劑是流動(dòng)相。層析時(shí)，混合氦基酸在這兩相中不斷分配，使它們分布在濾紙的不同位置上。可用于氨基酸的定性和定量測(cè)定第65頁(yè)，共143頁(yè)，2023年，2月20日，星期一第66頁(yè)，共143頁(yè)，2023年，2月20日，星期一6.4薄層層析把支持劑涂布在玻璃板上使成一個(gè)均勻的薄層，把要分析的樣品滴加在薄層的一端，然后用合適的溶劑在密閉的容器中進(jìn)行展層，使樣品中各個(gè)成分分離開(kāi)來(lái)，最后進(jìn)行鑒定和定量測(cè)定。第67頁(yè)，共143頁(yè)，2023年，2月20日，星期一

原理：分離氨基酸時(shí)，用離子交換樹(shù)脂作為支持物，利用離子交換樹(shù)脂上的活性基團(tuán)與溶液中的離子進(jìn)行交換反應(yīng)，由于各種離子交換能力不同，與樹(shù)脂結(jié)合的牢固程度就不同，在洗脫過(guò)程中，各種離子以不同的速度移動(dòng)，從而達(dá)到分離的目的。

這種分離主要與各種離子所帶電荷有關(guān)，在電荷相同時(shí)，與極性，非極性有關(guān)。6.5離子交換層析第68頁(yè)，共143頁(yè)，2023年，2月20日，星期一6.6氣相色譜當(dāng)層折系統(tǒng)的流動(dòng)相為氣體，固定相為涂漬在固體顆粒表面的液體時(shí)，此層析技術(shù)稱為氣—液色譜(gas-liquidchromatography)或簡(jiǎn)稱為氣相色譜。利用氣相色譜法進(jìn)行分離也是基于分配過(guò)程，即利用樣品組分在流動(dòng)的氣相和固定在顆粒表面的液相中的分配系數(shù)不同達(dá)到分離組分的目的。氣相色譜法具有微量快速的優(yōu)點(diǎn)。它在分析生物成分方面的一個(gè)限制是要求樣品能氣化和熱穩(wěn)定性高。氨基酸由于含有各種極性基團(tuán)，氣化十分困難，必須把它轉(zhuǎn)變成容易揮發(fā)的化合物才能進(jìn)行氣相層析。氨基酸與苯異硫氰酸酯反應(yīng)生成PTH—氨基酸，然后經(jīng)三甲基硅烷基化，可得能很好氣化的氨基酸衍生物。第69頁(yè)，共143頁(yè)，2023年，2月20日，星期一SP-2100

氣相色譜儀器以氣體為流動(dòng)相。當(dāng)某一種被分析的多組份混合樣品被注入注樣器且瞬間汽化以后，樣品由流動(dòng)相氣體載氣所攜帶，經(jīng)過(guò)裝有固定相的色譜柱時(shí)，分子在兩相間反復(fù)多次分配，發(fā)生很大的分離效果，且由于每種樣品組份吸附、脫附的作用力不同，所反應(yīng)的時(shí)間也不同，最終結(jié)果使混合樣品中的組份得到完全地分離。被分離的組份順序進(jìn)入檢測(cè)器系統(tǒng)，由檢測(cè)器轉(zhuǎn)換為電信號(hào)送至記錄儀或積分儀繪出色譜圖。第70頁(yè)，共143頁(yè)，2023年，2月20日，星期一高效液相色譜（HighPe-rformanceLiauidChromatography，HPLC）是繼氣相色譜之后，70年代初期發(fā)展起來(lái)的一種以液體做流動(dòng)相的新色譜技術(shù)。高效液相色譜法是用來(lái)分離，分析難揮發(fā)和熱穩(wěn)定性差的有機(jī)樣品的重要手段。由于具有高分辨率、高靈敏度、速度快、和應(yīng)用范圍廣的特點(diǎn),因而已經(jīng)被廣泛應(yīng)用到生物化學(xué)、食品分析、醫(yī)藥研究、環(huán)境分析、無(wú)機(jī)分析等各種領(lǐng)域。HPLC作為一種重要的分析方法，目前已成為生物化學(xué)家和醫(yī)學(xué)家在分子水平上研究生命科學(xué)、遺傳工程、臨床化學(xué)、分子生物學(xué)等必不可少的工具。6.7高效液相色譜（HPLC）第71頁(yè)，共143頁(yè)，2023年，2月20日，星期一HPLC的特點(diǎn)是：(1)使用的固定相支持劑顆粒很細(xì)，因而表面積很大。(2)溶劑系統(tǒng)采取高壓，因此洗脫速度增大，多種類型的柱層析都可用HPLC來(lái)代替，例如分配層析、離子交換層析、吸附層析以及凝膠過(guò)濾等。第72頁(yè)，共143頁(yè)，2023年，2月20日，星期一第四章蛋白質(zhì)的共價(jià)結(jié)構(gòu)第73頁(yè)，共143頁(yè)，2023年，2月20日，星期一蛋白質(zhì)的一級(jí)結(jié)構(gòu)1蛋白質(zhì)通論2肽3蛋白質(zhì)一級(jí)結(jié)構(gòu)的測(cè)定4蛋白質(zhì)的氨基酸序列與生物功能4.5肽與蛋白質(zhì)的人工合成第74頁(yè)，共143頁(yè)，2023年，2月20日，星期一1蛋白質(zhì)通論1.1蛋白質(zhì)的化學(xué)組成和分類1.2蛋白質(zhì)的形狀和大小1.3蛋白質(zhì)功能的多樣性第75頁(yè)，共143頁(yè)，2023年，2月20日，星期一各種蛋白質(zhì)的含氮量很接近，平均為16%。由于體內(nèi)組織的主要含氮物是蛋白質(zhì)，因此，只要測(cè)定生物樣品中的氮含量，就可以按下式推算出蛋白質(zhì)大致含量：蛋白質(zhì)含量＝蛋白質(zhì)含N量×6.25

這是凱氏定氮法測(cè)蛋白質(zhì)含量的理論依據(jù)1.1蛋白質(zhì)的化學(xué)組成和分類單純蛋白質(zhì)的元素組成為C50～55%、H6%～7%、O19%～24%、N13%～19%，除此之外還有S0～4%。有的蛋白質(zhì)含有P、I。少數(shù)含F(xiàn)e、Cu、Zn、Mn、Co、Mo等金屬元素。第76頁(yè)，共143頁(yè)，2023年，2月20日，星期一

三聚氰胺蛋白質(zhì)主要由氨基酸組成。蛋白質(zhì)平均含氮量為16％左右，而三聚氰胺的含氮量為66％左右。常用的蛋白質(zhì)測(cè)試方法“凱氏定氮法”是通過(guò)測(cè)出含氮量乘以6.25來(lái)估算蛋白質(zhì)含量，因此，添加三聚氰胺會(huì)使得食品的蛋白質(zhì)測(cè)試含量虛高，從而使劣質(zhì)食品和飼料在檢驗(yàn)機(jī)構(gòu)只做粗蛋白質(zhì)簡(jiǎn)易測(cè)試時(shí)蒙混過(guò)關(guān)。有人估算在植物蛋白粉和飼料中使測(cè)試蛋白質(zhì)含量增加一個(gè)百分點(diǎn)，用三聚氰胺的花費(fèi)只有真實(shí)蛋白原料的1/5。三聚氰胺作為一種白色結(jié)晶粉末，沒(méi)有什么氣味和味道，所以摻雜后不易被發(fā)現(xiàn)。

第77頁(yè)，共143頁(yè)，2023年，2月20日，星期一單純蛋白質(zhì)（simpleprotein)：僅由氨基酸組成，不含其它化學(xué)成分。綴合蛋白質(zhì)(conjugatedprotein)：除含有氨基酸外的各種化學(xué)成分作為其結(jié)構(gòu)的一部分。非蛋白質(zhì)部分稱為輔基(prostheticgroup)或配體(ligand)。第78頁(yè)，共143頁(yè)，2023年，2月20日，星期一單純蛋白質(zhì)分類第79頁(yè)，共143頁(yè)，2023年，2月20日，星期一結(jié)合蛋白質(zhì)分類第80頁(yè)，共143頁(yè)，2023年，2月20日，星期一1.2蛋白質(zhì)的形狀和大小形狀纖維狀球狀膜蛋白蛋白質(zhì)的相對(duì)分子量從大約6000～1×106或更大一些一般將分子量小于6000的稱為肽蛋白質(zhì)分子量≌氨基酸數(shù)目X110第81頁(yè)，共143頁(yè)，2023年，2月20日，星期一單體蛋白質(zhì)(monomericprotein)：僅由一條多肽鏈組成。其相對(duì)分子量除以110估計(jì)氨基酸殘基的數(shù)目。寡聚蛋白質(zhì)(oligomericprotein)：由兩條或多條多肽鏈組成。每條多肽鏈稱為亞基(subunit)。第82頁(yè)，共143頁(yè)，2023年，2月20日，星期一

蛋白質(zhì)（protein）是生活細(xì)胞內(nèi)含量最豐富、功能最復(fù)雜的生物大分子，并參與了幾乎所有的生命活動(dòng)和生命過(guò)程。因此，研究蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)與功能始終是生命科學(xué)最基本的命題。生物體最主要的特征是生命活動(dòng)，而蛋白質(zhì)是生命活動(dòng)的體現(xiàn)者。1.4蛋白質(zhì)功能的多樣性第83頁(yè)，共143頁(yè)，2023年，2月20日，星期一1878年，思格斯就在《反杜林論》中指出：“生命是蛋白體的存在方式，這種存在方式本質(zhì)上就在于這些蛋白體的化學(xué)組成部分的不斷的自我更新?！贝呋δ埽唤Y(jié)構(gòu)功能；運(yùn)輸功能；儲(chǔ)藏功能；運(yùn)動(dòng)功能；防御功能；調(diào)節(jié)功能；感覺(jué)功能；遺傳調(diào)控功能；

蛋白質(zhì)的序列異構(gòu)現(xiàn)象是蛋白質(zhì)生物功能多樣性和物種特異性的結(jié)構(gòu)基礎(chǔ)。第84頁(yè)，共143頁(yè)，2023年，2月20日，星期一催化功能

生物體內(nèi)的酶大部分是由蛋白質(zhì)構(gòu)成的，它們是有機(jī)體新陳代謝的催化劑。己糖激酶第85頁(yè)，共143頁(yè)，2023年，2月20日，星期一結(jié)構(gòu)功能蛋白質(zhì)可以作為生物體的結(jié)構(gòu)成分。在高等動(dòng)物里，膠原是主要的細(xì)胞外結(jié)構(gòu)蛋白，參與結(jié)締組織和骨骼作為身體的支架，占蛋白總量的1/4。細(xì)胞里的片層結(jié)構(gòu)，如細(xì)胞膜、線粒體、葉綠體和內(nèi)質(zhì)網(wǎng)等都是由不溶性蛋白與脂類組成的。動(dòng)物的毛發(fā)和指甲都是由角蛋白構(gòu)成的。第86頁(yè)，共143頁(yè)，2023年，2月20日，星期一運(yùn)輸功能脊椎動(dòng)物紅細(xì)胞中的血紅蛋白和無(wú)脊椎動(dòng)物體內(nèi)的血藍(lán)蛋白在呼吸過(guò)程中起著運(yùn)輸氧氣的作用。血液中的β1-脂蛋白可運(yùn)輸脂肪，轉(zhuǎn)鐵蛋白可轉(zhuǎn)運(yùn)鐵。一些脂溶性激素的運(yùn)輸也需要蛋白，如甲狀腺素要與甲狀腺素結(jié)合球蛋白結(jié)合才能在血液中運(yùn)輸。第87頁(yè)，共143頁(yè)，2023年，2月20日，星期一貯存功能某些蛋白質(zhì)的作用是貯存氨基酸作為生物體的養(yǎng)料和胚胎或幼兒生長(zhǎng)發(fā)育的原料。蛋類中的卵清蛋白、奶類中的酪蛋白和小麥種子中的麥醇溶蛋白等。肝臟中的鐵蛋白可將血液中多余的鐵儲(chǔ)存起來(lái)，供缺鐵時(shí)使用。第88頁(yè)，共143頁(yè)，2023年，2月20日，星期一運(yùn)動(dòng)功能肌肉中的肌球蛋白和肌動(dòng)蛋白是運(yùn)動(dòng)系統(tǒng)的必要成分，它們構(gòu)象的改變引起肌肉的收縮，帶動(dòng)機(jī)體運(yùn)動(dòng)。細(xì)菌中的鞭毛蛋白有類似的作用，它的收縮引起鞭毛的擺動(dòng)，從而使細(xì)菌在水中游動(dòng)。第89頁(yè)，共143頁(yè)，2023年，2月20日，星期一防御功能高等動(dòng)物的免疫反應(yīng)是機(jī)體的一種防御機(jī)能，它主要也是通過(guò)蛋白質(zhì)（抗體）來(lái)實(shí)現(xiàn)的。凝血與纖溶系統(tǒng)的蛋白因子、溶菌酶、干擾素等，也擔(dān)負(fù)著防御和保護(hù)功能。第90頁(yè)，共143頁(yè)，2023年，2月20日，星期一調(diào)節(jié)功能

某些激素、一切激素受體和許多其他調(diào)節(jié)因子都是蛋白質(zhì)。第91頁(yè)，共143頁(yè)，2023年，2月20日，星期一感覺(jué)功能感受味道需要味覺(jué)蛋白視覺(jué)信息的傳遞要有視紫紅質(zhì)參與。視桿細(xì)胞中的視紫紅質(zhì)，只需1個(gè)光子即可被激發(fā)，產(chǎn)生視覺(jué)。第92頁(yè)，共143頁(yè)，2023年，2月20日，星期一遺傳調(diào)控功能遺傳信息的儲(chǔ)存和表達(dá)都與蛋白質(zhì)有關(guān)。DNA在儲(chǔ)存時(shí)是纏繞在蛋白質(zhì)（組蛋白）上的。有些蛋白質(zhì)，如阻遏蛋白，與特定基因的表達(dá)有關(guān)。β－半乳糖苷酶基因的表達(dá)受到一種阻遏蛋白的抑制，當(dāng)需要合成β－半乳糖苷酶時(shí)經(jīng)過(guò)去阻遏作用才能表達(dá)。第93頁(yè)，共143頁(yè)，2023年，2月20日，星期一近年來(lái)的研究還指出記憶、痛苦、感情靠的是蛋白質(zhì)的構(gòu)象變化幾年前，在歐洲乃至全世界引起恐慌的瘋牛病，其致病元兇就是蛋白粒子（prion），這種只有蛋白質(zhì)而沒(méi)有核酸的病原體，可引起人或動(dòng)物的瘋牛病，這一發(fā)現(xiàn)又一次說(shuō)明了蛋白質(zhì)是生命的物質(zhì)基礎(chǔ)。

總而言之，一切重要的生理活動(dòng)都離不開(kāi)蛋白質(zhì)，蛋白質(zhì)是生命現(xiàn)象的最基本的物質(zhì)基礎(chǔ)。第94頁(yè)，共143頁(yè)，2023年，2月20日，星期一2肽2.1肽和肽鍵的結(jié)構(gòu)2.2肽的物理和化學(xué)性質(zhì)2.3天然存在的活性肽第95頁(yè)，共143頁(yè)，2023年，2月20日，星期一肽：一個(gè)氨基酸分子的α-羧基與另一個(gè)氨基酸分子的α-氨基在適當(dāng)?shù)臈l件下脫水縮合而成化合物。肽鍵：氨基酸之間脫水后形成的鍵稱肽鍵（酰胺鍵）肽是氨基酸的線性聚合物，常稱多肽鏈（peptidechain）2.1肽和肽鍵的結(jié)構(gòu)第96頁(yè)，共143頁(yè)，2023年，2月20日，星期一肽鍵中的C-N鍵具有部分雙鍵性質(zhì)，不能自由旋轉(zhuǎn)。在大多數(shù)情況下，以反式結(jié)構(gòu)存在。N=C0.127nm鍵長(zhǎng)=0.132nmN-C0.148nm肽鍵第97頁(yè)，共143頁(yè)，2023年，2月20日，星期一第98頁(yè)，共143頁(yè)，2023年，2月20日，星期一

1.

由于C=O雙鍵中的π電子云與N原子上的未共用電子對(duì)發(fā)生“電子共振”，使肽鍵具有部分雙鍵的性質(zhì)，不能自由旋轉(zhuǎn)。

2.與肽鍵相連的六個(gè)原子構(gòu)成剛性平面結(jié)構(gòu)，稱為肽單元或肽鍵平面。由于α-碳原子與其他原子之間均形成單鍵，因此兩相鄰的肽鍵平面可以作相對(duì)旋轉(zhuǎn)。肽平面或酰胺平面：第99頁(yè)，共143頁(yè)，2023年，2月20日，星期一氨基酸殘基：組成多肽的氨基酸單元氨基端或N-端：通常在多肽鏈的一端含有一個(gè)游離的-氨基羧基端或C-端：在另一端含有一個(gè)游離的-羧基，N端氨基酸殘基氨基酸殘基C端多肽鏈片斷結(jié)構(gòu)通式第100頁(yè)，共143頁(yè)，2023年，2月20日，星期一二肽：由兩個(gè)氨基酸組成的肽稱為二肽，由多個(gè)氨基酸組成的肽則稱為多肽。氨基酸BH2NCHCR1OHNCHCR2OOH氨基酸AHHNCHCR1O氨基酸COH氨基酸殘基氨基酸殘基氨基酸殘基第101頁(yè)，共143頁(yè)，2023年，2月20日，星期一★多肽鏈可以看成由Cα串聯(lián)起來(lái)的無(wú)數(shù)個(gè)酰胺平面組成第102頁(yè)，共143頁(yè)，2023年，2月20日，星期一肽鏈中包含的共價(jià)鍵（covalentbonds）主要指肽鍵（peptidebond）和二硫鍵（disulfidebond）二硫鍵：是由肽鏈中相應(yīng)部位上兩個(gè)半胱氨酸殘基脫氫連接而成，是連接肽鏈內(nèi)或肽鏈間的主要橋鍵。第103頁(yè)，共143頁(yè)，2023年，2月20日，星期一N末端C末端牛核糖核酸酶第104頁(yè)，共143頁(yè)，2023年，2月20日，星期一丙氨酰甘氨酰亮氨酸

Ala－Gly－Leu(orAla?Gly?Leu)根據(jù)氨基酸組成，由N端→C端命名,稱為某氨基酰某氨基?！嘲被帷５?05頁(yè)，共143頁(yè)，2023年，2月20日，星期一肽鏈寫(xiě)法：游離α-氨基在左，游離α-羧基在右，氨基酸之間用“-”表示肽鍵。H2N-絲氨酸-纈氨酸-酪氨酸-天冬氨酸-谷氨酰氨-COOHSer-Val-Tyr-Asp-Gln（S-V-Y-D-Q）第106頁(yè)，共143頁(yè)，2023年，2月20日，星期一肽的化學(xué)反應(yīng)也和氨基酸一樣，游離的α－氨基、α－羧基和R基可以發(fā)生與氨基酸中相應(yīng)的基團(tuán)類似的反反應(yīng)。雙縮脲反應(yīng)是肽和蛋白質(zhì)所特有的，而為氨基酸所沒(méi)有的一個(gè)顏色反應(yīng)。2.2肽的物理和化學(xué)性質(zhì)第107頁(yè)，共143頁(yè)，2023年，2月20日，星期一在堿性溶液中雙縮脲與銅離子結(jié)合形成復(fù)雜的紫紅色復(fù)合物。而蛋白質(zhì)及多肽的肽鍵與雙縮脲的結(jié)構(gòu)類似，也能與Cu2+形成紫紅色絡(luò)合物，其最大光吸收在540nm處。其顏色深淺與蛋白質(zhì)濃度成正比，而與蛋白質(zhì)的分子量及氨基酸的組成無(wú)關(guān)，該法測(cè)定蛋白質(zhì)的濃度范圍適于1~10mg/mL。雙縮脲法可用于肽、蛋白質(zhì)的定性、定量分析。具有兩個(gè)或兩個(gè)以上肽鍵的化合物皆有雙縮脲反應(yīng)。第108頁(yè)，共143頁(yè)，2023年，2月20日，星期一2.3天然存在的活性肽許多分子量比較小的多肽以游離狀態(tài)存在。具有一定生物學(xué)活性的肽類物質(zhì)稱生物活性肽。生物活性肽是傳遞細(xì)胞之間信息的重要信息分子在調(diào)節(jié)代謝、生長(zhǎng)、發(fā)育、繁殖等生命活動(dòng)中起著重要作用生理活性肽的功能類別：激素、促激素、神經(jīng)調(diào)質(zhì)以及許多器官合成、釋放的功能調(diào)節(jié)因子第109頁(yè)，共143頁(yè)，2023年，2月20日，星期一這類物質(zhì)大都是一些寡肽（幾個(gè)氨基酸構(gòu)成）或低肽（十幾個(gè)氨基酸構(gòu)成），氨基酸數(shù)目比較少，不同的排列、組合就可產(chǎn)生各種不同生物功能。由于生物活性肽對(duì)機(jī)體的重要作用，使它具備了巨大的開(kāi)發(fā)價(jià)值。肽類物質(zhì)除營(yíng)養(yǎng)等作用外，在生物制藥、功能食品、美容、科研及診斷試劑方面存在著廣泛的應(yīng)用前景。第110頁(yè)，共143頁(yè)，2023年，2月20日，星期一

谷胱甘肽在體內(nèi)參與氧化還原過(guò)程，作為某些氧化還原酶的輔因子，或保護(hù)巰基酶，或防止過(guò)氧化物積累。谷胱甘肽（GSH）三肽第111頁(yè)，共143頁(yè)，2023年，2月20日，星期一均為9肽，第3位和第9位氨基酸不同。催產(chǎn)素使子宮和乳腺平滑肌收縮，具有催產(chǎn)和促使乳腺排乳作用。升壓素促進(jìn)血管平滑肌收縮，升高血壓，減少排尿。催產(chǎn)素和升壓素第112頁(yè)，共143頁(yè)，2023年，2月20日，星期一促腎上腺皮質(zhì)激素（ACTH）39肽，活性部位為第4～10位的7肽片段：Met-Glu-His-Phe-Arg-Trp-Gly。腦肽腦啡肽具有強(qiáng)烈的鎮(zhèn)痛作用（強(qiáng)于嗎啡），不上癮。Met-腦啡肽Tyr-Gly-Gly-Phe-MetLeu-腦啡肽Tyr-Gly-Gly-Phe-Leuβ-內(nèi)啡肽（31肽）具有較強(qiáng)的嗎啡樣活性與鎮(zhèn)痛作用。第113頁(yè)，共143頁(yè)，2023年，2月20日，星期一3蛋白質(zhì)一級(jí)結(jié)構(gòu)的測(cè)定3.1蛋白質(zhì)測(cè)序的策略3.2N-末端和C-末端氨基酸殘基的鑒定3.3二硫橋的斷裂3.4氨基酸組成的分析3.5多肽鏈的部分裂解和肽段混合物的分離純化3.6肽段氨基酸序列的測(cè)定3.7肽段在多肽鏈中次序的決定3.8二硫橋位置的確定3.9蛋白質(zhì)測(cè)序舉例3.10蛋白質(zhì)序列數(shù)據(jù)庫(kù)第114頁(yè)，共143頁(yè)，2023年，2月20日，星期一1測(cè)定蛋白質(zhì)分子量及肽鏈數(shù)目a、樣品必須是均一的，純度應(yīng)在97%以上；b、測(cè)定蛋白質(zhì)的分子質(zhì)量（電泳、層析、離心等），其誤差允許在10%左右。c、通過(guò)測(cè)定末端氨基酸殘基的摩爾數(shù)與蛋白質(zhì)相對(duì)分子量之間的關(guān)系，即可確定多肽鏈的數(shù)目。第115頁(yè)，共143頁(yè)，2023年，2月20日，星期一3.1蛋白質(zhì)測(cè)序的策略(1)測(cè)定蛋白質(zhì)分子中多肽鏈的數(shù)目。

(2)拆分蛋白質(zhì)分子的多肽鏈。

(3)測(cè)定多肽鏈的氨基酸組成。

(4)分析多肽鏈的N末端和C末端殘基。

(5)斷裂多肽鏈內(nèi)的二硫鍵。

(6)多肽鏈斷裂成肽段。

(7)測(cè)定各個(gè)肽段的氨基酸順序。

(8)確定肽段在多肽鏈中的次序。

(9)確定原多肽鏈中二硫鍵的位置。第116頁(yè)，共143頁(yè)，2023年，2月20日，星期一FrederickSanger

多肽鏈的氨基酸測(cè)序的方法由英國(guó)科學(xué)家FrederickSanger發(fā)明。這個(gè)方法首先應(yīng)用于牛胰島素的序列測(cè)定，并于1954年取得成功，F(xiàn)rederickSanger也因此獲得1958年的Nobel獎(jiǎng)。這項(xiàng)工作在結(jié)構(gòu)生物學(xué)上具有里程碑式的意義?，F(xiàn)在的蛋白質(zhì)自動(dòng)測(cè)序儀也是以Sanger的方法為基礎(chǔ)發(fā)展起來(lái)的。第117頁(yè)，共143頁(yè)，2023年，2月20日，星期一將肽段順序進(jìn)行疊聯(lián)以確定完整的順序

將肽段分離并測(cè)出順序?qū)Ｒ恍粤呀饽┒税被釡y(cè)定二硫鍵拆開(kāi)純蛋白質(zhì)蛋白質(zhì)順序測(cè)定基本方法路線第118頁(yè)，共143頁(yè)，2023年，2月20日，星期一3.2N-末端和C-末端氨基酸殘基的鑒定1)N-末端分析（1）DNFB法；（2）DNS法（3）PITC法（4）氨肽酶法2)C-末端分析（1）肼解法；（2）還原法（3）羧肽酶法第119頁(yè)，共143頁(yè)，2023年，2月20日，星期一Sanger法。2,4-二硝基氟苯在堿性條件下，能夠與肽鏈N-端的游離氨基作用，生成二硝基苯衍生物（DNP）。在酸性條件下水解，得到黃色DNP-氨基酸。該產(chǎn)物能夠用乙醚抽提分離。不同的DNP-氨基酸可以用色譜法進(jìn)行鑒定。末端基氨基酸測(cè)定二硝基氟苯（DNFB）法第120頁(yè)，共143頁(yè)，2023年，2月20日，星期一在堿性條件下，丹磺酰氯（二甲氨基萘磺酰氯）可以與N-端氨基酸的游離氨基作用，得到丹磺酰氨基酸。此法的優(yōu)點(diǎn)是丹磺酰-氨基酸有很強(qiáng)的熒光性質(zhì)，檢測(cè)靈敏度可以達(dá)到110-9mol。末端基氨基酸測(cè)定丹磺酰氯法(DNS)第121頁(yè)，共143頁(yè)，2023年，2月20日，星期一氨肽酶是一種肽鏈外切酶，它能從多肽鏈的N-端逐個(gè)的向里水解。根據(jù)不同的反應(yīng)時(shí)間測(cè)出酶水解所釋放出的氨基酸種類和數(shù)量，按反應(yīng)時(shí)間和氨基酸殘基釋放量作動(dòng)力學(xué)曲線，從而知道蛋白質(zhì)的N-末端殘基順序。最常用的氨肽酶是亮氨酸氨肽酶，水解以亮氨酸殘基為N-末端的肽鍵速度最大。末端基氨基酸測(cè)定氨肽酶(aminopeptidases)法第122頁(yè)，共143頁(yè)，2023年，2月20日，星期一此法是多肽鏈C-端氨基酸分析法。多肽與肼在無(wú)水條件下加熱，C-端氨基酸即從肽鏈上解離出來(lái)，其余的氨基酸則變成肼化物。肼化物能夠與苯甲醛縮合成不溶于水的物質(zhì)而與C-端氨基酸分離。末端基氨基酸測(cè)定肼解法第123頁(yè)，共143頁(yè)，2023年，2月20日，星期一羧肽酶是一種肽鏈外切酶，它能從多肽鏈的C-端逐個(gè)的水解AA。根據(jù)不同的反應(yīng)時(shí)間測(cè)出酶水解所釋放出的氨基酸種類和數(shù)量，從而知道蛋白質(zhì)的C-末端殘基順序。目前常用的羧肽酶有四種：A,B,C和Y；A和B來(lái)自胰臟；C來(lái)自柑桔葉；Y來(lái)自面包酵母。羧肽酶A能水解除Pro,Arg和Lys以外的所有C-末端氨基酸殘基；B只能水解Arg和Lys為C-末端殘基的肽鍵。末端基氨基酸測(cè)定羧肽酶(carboxypeptidase)法第124頁(yè)，共143頁(yè)，2023年，2月20日，星期一3.3二硫橋的斷裂斷裂二硫橋的主要方法是過(guò)甲酸氧化法和巰基化合物還原法。ssHCOOOHSO3HSO3H第125頁(yè)，共143頁(yè)，2023年，2月20日，星期一3.4氨基酸組成的分析用于蛋白的氨基酸組成測(cè)定的水解方法主要是酸水解，同時(shí)輔以堿水解。氨基酸分析儀圖譜第126頁(yè)，共143頁(yè)，2023年，2月20日，星期一方法：6MHcl優(yōu)點(diǎn)：不引起消旋，能得到L-氨基酸（17種）缺點(diǎn)：Trp側(cè)鏈的吲哚基團(tuán)被破壞；Asn，Gln的酰胺基團(tuán)被水解，變成Asp，Glu酸水解：方法：5MNaOH優(yōu)點(diǎn)：Trp缺點(diǎn)：多數(shù)氨基酸會(huì)不同程度的破壞，產(chǎn)生消旋。堿水解：第127頁(yè)，共143頁(yè)，2023年，2月20日，星期一3.5多肽鏈的部分裂解和肽段混合物的分離純化1)酶裂解法胰蛋白酶(trypsin)這是最常用的蛋白水解酶，專一性強(qiáng)，只斷裂賴氨酸或精氨酸的羧基參與形成的肽鍵。得到的是以Arg或Lys為C-末端殘基的肽段，肽段數(shù)目等于多肽鏈中Arg和Lys總數(shù)加1。第128頁(yè)，共143頁(yè)，2023年，2月20日，星期一為了減少胰蛋白酶的作用位點(diǎn)，可以通過(guò)化學(xué)修飾將其側(cè)鏈基因保護(hù)起來(lái)。用馬來(lái)酸酐可以保護(hù)Lys殘基側(cè)鏈上的ε－NH2，胰蛋白酶就不會(huì)水解Lys竣基參與形成的肽鍵，只能斷裂Arg羧基所形成的肽鍵；反之，如果用1，2－環(huán)己二酮修飾Arg的胍基，則胰蛋白面只能裂解Lys羧基所形成的肽鍵。如果想增加多肽鏈中胰蛋白酶的斷裂點(diǎn)，可以用丫丙啶處理多肽鏈樣品，這時(shí)Cys殘基側(cè)鏈被修飾成類似Lys的側(cè)鏈，也具有ε－NH2。這樣胰蛋白酶便能斷裂Cys羧基端的肽鍵。R1=Lys和Arg側(cè)鏈（專一性較強(qiáng)，水解速度快）。R2=Pro水解受抑。第129頁(yè)，共143頁(yè)，2023年，2月20日，星期一糜蛋白酶(chymotrypin)或胰凝乳蛋白酶(Chymotrypsin)：它斷裂Phe、Trp和Tyr等疏水氨基酸的羧基參與形成的肽鍵。斷裂鍵鄰近的基團(tuán)是堿性的，裂解能力增加；是酸性的，裂解能力將減弱。肽鏈水解位點(diǎn)R1=Phe,Trp,Tyr時(shí)水解快;R1=Leu，Met和His水解稍慢。R2=Pro水解受抑。第130頁(yè)，共143頁(yè)，2023年，2月20日，星期一肽鏈水解位點(diǎn)胃蛋白酶(pepsin)它要求被斷裂鍵兩側(cè)的殘基都是疏水性氨基酸，如Phe-Phe。此外與糜蛋白酶不同的是酶作用的最適pH，前者是pH2，后者是pH8-9，由于二硫鍵在酸性條件下穩(wěn)定，因此確定二硫鍵位置時(shí)，常用胃蛋白酶來(lái)水解。R1和R2＝Phe,Trp,Tyr;Leu以及其它疏水性氨基酸水解速度較快。第131頁(yè)，共143頁(yè)，2023年，2月20日，星期一消化道內(nèi)幾種蛋白酶的專一性（Phe.Tyr.Trp）（Arg.Lys）（脂肪族）胰凝乳蛋白酶胃蛋白酶彈性蛋白酶羧肽酶胰蛋白酶氨肽酶羧肽酶（Phe.Trp）第132頁(yè)，共143頁(yè)，2023年，2月