第六章工業(yè)微生物育種

第六章工業(yè)微生物育種第1頁，共43頁，2023年，2月20日，星期一誘變育種是指利用物理或化學誘變劑處理均勻分散的微生物細胞群，在促進其突變頻率顯著提高的基礎上，從中挑選少數符合目的的突變株，以供科學實驗或生產實踐使用。

第2頁，共43頁，2023年，2月20日，星期一

效價：指有效成分的濃度。1ug/ul稱為1單位1945時間1943194319431947195519711977目前發(fā)酵單位(u/ml)100250500～850～850～8000～2萬～5萬5～10萬

從青霉素產量看誘變育種第3頁，共43頁，2023年，2月20日，星期一誘變育種目的提高有效產物的產量改變菌種特性，提高產品質量簡化工藝條件開發(fā)新品種第4頁，共43頁，2023年，2月20日，星期一誘變育種的過程

選擇合適的出發(fā)菌株制備待處理的菌懸液誘變處理篩選保藏和擴大試驗第5頁，共43頁，2023年，2月20日，星期一

一、誘變育種的實驗準備（一）誘變前對出發(fā)菌株的了解1、區(qū)分不同菌落類型2、出現(xiàn)不同菌落類型原因出發(fā)菌株第6頁，共43頁，2023年，2月20日，星期一（二）全面了解菌種特性和生產性能的關系（三）了解影響菌種生長發(fā)育的主要因素1、培養(yǎng)基2、斜面培養(yǎng)基的制備技術3、接種量4、溫度5、濕度6、藥品和原材料質量第7頁，共43頁，2023年，2月20日，星期一（四）了解菌種有效產物中的各種組分在代謝合成過程中與培養(yǎng)條件的關系（五）建立一個準確、簡便、快速檢測產物的方法（六）研究最佳的菌種保藏培養(yǎng)基和培養(yǎng)條件第8頁，共43頁，2023年，2月20日，星期一二、誘變育種的步驟及方法

（一）選擇合適的出發(fā)菌株1、對一般菌株的要求野生菌株對誘變劑敏感最好選用來自生產中的自發(fā)突變菌株。具有有利性狀（如高產、生長速度快、營養(yǎng)要求粗放、標記明顯等）；可選用已發(fā)生過其他突變的菌株。第9頁，共43頁，2023年，2月20日，星期一

2、選擇具有一定生產能力或某種特性的菌株作為出發(fā)菌株3、選擇純種做出發(fā)菌株4、選擇出發(fā)菌株應考慮其穩(wěn)定性5、連續(xù)誘變育種過程中如何選擇出發(fā)菌株6、采用多出發(fā)菌株7、了解菌種代謝特點第10頁，共43頁，2023年，2月20日，星期一

（三）制備待處理的菌懸液

1、選用單細胞或單孢子懸液（均勻、分散）目的：①使每個細胞能均勻接觸誘變劑；②減少表型延遲現(xiàn)象（誘變后性狀的分離及退化現(xiàn)象）同步培養(yǎng)（生理狀態(tài)一致）菌齡：對誘變劑最敏感時期

營養(yǎng)細胞：對數期

孢子或芽孢：萌發(fā)前期第11頁，共43頁，2023年，2月20日，星期一菌懸液的制備方法物理誘變：生理鹽水配制化學誘變：緩沖液配制菌懸液的濃度酵母菌，霉菌的孢子：106個/mL

細菌，放線菌孢子：108個/mL不產孢子真菌：采用幼齡菌絲，三種方法制。制備原生質體作為誘變材料。第12頁，共43頁，2023年，2月20日，星期一誘變劑的選擇（高效，簡便）

物理誘變劑：頻度低、大損傷，難修復，且操作簡便；化學誘變劑：頻度高，點突變，易回復突變，操作麻煩。

(NTG——超誘變劑）UV是最常用的一種誘變劑（四）誘變劑的選擇及處理方法2、根據菌種特性和遺傳穩(wěn)定性來選擇誘變劑3、參考出發(fā)菌株原有的誘變譜系來選擇誘變劑第13頁，共43頁，2023年，2月20日，星期一常以殺菌率來表示相對劑量（劑量-存活率曲線）

最適劑量：既能擴大變異幅度，又能使變異向正突變范圍移動的劑量。(P103)突變率隨劑量的增加而提高，達一定程度后，再提高劑量,反而會使突變率下降。正變較多出現(xiàn)在偏低劑量中，而負變較多出現(xiàn)在偏高劑量中。常采用相對殺菌率為70-75%。4.劑量的選擇第14頁，共43頁，2023年，2月20日，星期一（五）誘變處理方法單因素處理或多因素的復合處理：①同一誘變劑的重復使用；②兩種或多種誘變劑的先后使用；③兩種或多種誘變劑的同時使用；④紫外線光復活交替處理⑤誘變劑處理時間與誘變效應的關系第15頁，共43頁，2023年，2月20日，星期一（六）影響突變率的因素1、菌種遺傳特性不同2、菌體細胞壁結構不同3、環(huán)境條件的影響1）誘變前預培養(yǎng)2）溫度、pH、氧氣等外界條件對誘變效應的影響3）菌落密度效應第16頁，共43頁，2023年，2月20日，星期一表型延遲（phenotypiclag）：表型的改變落后于基因型改變的現(xiàn)象.

分離性延遲：

突變的基因經DNA復制和細胞分裂后變成純合狀態(tài)，表型才能表現(xiàn)出來。

生理性延遲：

由雜合狀態(tài)變?yōu)榧兒蠣顟B(tài)，突變表型仍不能表現(xiàn)出來。分離性延遲的原因:

對數生長期中，單核細胞常出現(xiàn)雙核現(xiàn)象，多核細胞的核也成倍增加，誘變對數期的細胞時，突變通常發(fā)生在一個核上，故其變異或非變異的細胞必須經過一代或幾代繁殖才能分離，這種純種變異細胞出現(xiàn)的推遲現(xiàn)象稱為分離延遲現(xiàn)象。生理性延遲的原因:

當變異細胞由雜合狀態(tài)變?yōu)榧兒蠣顟B(tài)時,由于雜合期所合成的非變異的蛋白或酶仍然發(fā)揮作用,必須經過細胞多代分離后,才能將這些非變異的酶稀釋掉,最終達到變異后應該表現(xiàn)的形態(tài),如營養(yǎng)缺陷型突變株的篩選過程。（四）中間培養(yǎng)（CM，培養(yǎng)過夜）目的：克服表型延遲第17頁，共43頁，2023年，2月20日，星期一

初篩復篩1.初篩（以量為主）（1）利用形態(tài)變異：需預先測定形態(tài)與產量的相關性（2）根據平板顏色反應直接挑選透明圈法（蛋白酶、脂肪酶、纖維素酶）；抑菌圈法（抗生素）；變色圈法（檸檬酸）、顯色圈（氨基酸）；沉淀圈法（外毒素透明圈直徑（H）/菌落直徑（C）：產量高低（初篩指標）方法需簡便、快速2步（五）突變株的篩選第18頁，共43頁，2023年，2月20日，星期一（3）濃度梯度法（4）影印平板法（5）瓊脂塊大通量篩選方法第19頁，共43頁，2023年，2月20日，星期一2.復篩（以質為主，定量測定）（1）搖瓶培養(yǎng)，直接檢測所需產物（2）產物活性檢查瓊脂平板活性圈法紙片法瓊脂薄層紙片法（3）復篩數據的調整菌落、菌體形態(tài)觀察進一步篩選突變株；培養(yǎng)基和條件的調整；菌株純度及遺傳特性進行研究第20頁，共43頁，2023年，2月20日，星期一二、誘變育種的基本原則

選擇簡便有效的誘變劑；挑選優(yōu)良的出發(fā)菌株；處理單細胞或單孢子懸液；選用最適的誘變劑量；充分利用復合處理的協(xié)同效應；利用和創(chuàng)造形態(tài)、生理與產量間的相關指標；設計高效篩選方案；創(chuàng)造新型篩選方法。第21頁，共43頁，2023年，2月20日，星期一1.抗性突變株的篩選(1)抗終代謝物結構類似物突變株的篩選用途：篩選相應代謝物的高產菌株三、幾種重要突變株的篩選方法結構類似物（又稱代謝拮抗物）是指那些在結構上和代謝終產物（氨基酸、嘌呤、維生素等）相似的物質。如：異煙肼（“雷米封”）是吡哆醇的結構類似物，利用含異煙肼梯度平板篩選異煙肼抗性突變株，可達到定向培育吡哆醇高產突變株的目的。第22頁，共43頁，2023年，2月20日，星期一

（2）抗藥性突變株用途：篩選相應藥物(抗生素)的高產菌株或遺傳標記制作

篩選的方法:

a.高于臨界濃度的平板進行分離；

b.梯度平板法

敏感菌苔

抗性菌落加入含異煙肼的上層

加入不含異煙肼的底層

第23頁，共43頁，2023年，2月20日，星期一（1）幾個概念：基本培養(yǎng)基（MM）[-]：某野生型能生長的最低成分的組合培養(yǎng)基。完全培養(yǎng)基（CM）[+]：各種營養(yǎng)缺陷型能生長的天然或半組合培養(yǎng)基補充培養(yǎng)基（SM）[A]:[-]+A，[B]:[-]+B相應營養(yǎng)缺陷型能生長的組合或半組合培養(yǎng)基

2.營養(yǎng)缺陷型突變株的篩選第24頁，共43頁，2023年，2月20日，星期一三種遺傳型：野生型（wildtype）從自然界分離到的、發(fā)生營養(yǎng)缺陷型突變前的原始菌株。[A+B+],可在[-]生長。營養(yǎng)缺陷型（auxotroph）野生型菌株經誘變劑處理后，由于發(fā)生了喪失某種酶合成能力的突變，因而只能在加有該酶合成產物的培養(yǎng)基中才能生長的突變菌株（主要指合成維生素、氨基酸及嘌呤、嘧啶的能力）。

[A+B-]：能在[+]、[B]生長

[A-B+]：能在[+]、[A]生長

[A-B-]：能在[+]生長原養(yǎng)型（prototroph）營養(yǎng)缺陷型經回復突變或重組，回到原來野生型的營養(yǎng)要求[A+B+],可在[-]生長第25頁，共43頁，2023年，2月20日，星期一（2）篩選步驟（5步）誘變處理中間培養(yǎng)淘汰野生型檢出缺陷型鑒定缺陷型第26頁，共43頁，2023年，2月20日，星期一①中間培養(yǎng)CM或SM培養(yǎng)基，培養(yǎng)過夜?？朔硇脱舆t。②淘汰野生型即濃縮缺陷型，以提高檢出率

饑餓培養(yǎng)（無N）MM6~12h2N培養(yǎng)(2N)MM1~2h

加抗生素(或菌絲過濾)，培養(yǎng)過夜

抗生素法（G+細菌：青霉素；酵母菌和霉菌：制霉菌素）

菌絲過濾法（絲狀真菌、放線菌）方法第27頁，共43頁，2023年，2月20日，星期一③營養(yǎng)缺陷型的檢出方法逐個檢出法夾層培養(yǎng)法限量補充培養(yǎng)法影印平板法第28頁，共43頁，2023年，2月20日，星期一④營養(yǎng)缺陷型的鑒定分兩步：a.三大類營養(yǎng)要求（氨基酸、維生素、核苷酸）的鑒定b.具體到某一種營養(yǎng)要求的鑒定(哪一種氨基酸,哪一種維生素,或哪一種堿基)具體操作:一般采用“濾紙片法”生長譜法：快速，直觀第29頁，共43頁，2023年，2月20日，星期一

a.不含維生素的酪素水解液或氨基酸混合液

b.維生素混合液

c.0.1%堿水解酵母核酸液a

b

c三大類營養(yǎng)要求的鑒定第30頁，共43頁，2023年，2月20日，星期一以氨基酸缺陷為例進行說明將21種氨基酸按右表分為6組特點：每2組只有一種共同物質單一營養(yǎng)物質要求的鑒定：組別化合物代號1178910112271213141533812161718449131619205510141719216611151820211

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6第31頁，共43頁，2023年，2月20日，星期一（3）營養(yǎng)缺陷型的用途生產菌

(氨基酸、核苷酸、維生素等高產菌需求)；研究代謝途徑和雜交、轉化等遺傳規(guī)律的遺傳標記。第32頁，共43頁，2023年，2月20日，星期一

1.從生產中選育

2.定向培育優(yōu)良品種

一般指用特定因素長期處理微生物群體，同時不斷地對它們進行移種傳代，以達到積累并選擇相應的自發(fā)突變株的目的。例：卡介苗（牛型結核分枝桿菌的減毒活菌苗）三、自發(fā)突變與育種第33頁，共43頁，2023年，2月20日，星期一思考題1、

誘變劑主要有哪三類？2、簡述紫外線照射誘變育種的原理、方法和基本步驟。3、化學誘變劑主要有哪些種類？4、烷化劑的作用機制是什么？5、簡述亞硝基胍誘變育種的原理、過程和安全注意事項。6、生物誘變劑按照誘變方式主要分為哪三類?為什么在篩選突變株時,不能直接用代謝產物,而必須用其結構類似物?第34頁，共43頁，2023年，2月20日，星期一一、電離輻射致DNA的損傷

電離輻射損傷DNA途徑:直接作用指射線直接作用于DNA分子，通過電離和激發(fā)使DNA受到損傷。間接作用