第六章體外標(biāo)記免疫分析

第六章體外標(biāo)記免疫分析第1頁(yè)，共66頁(yè)，2023年，2月20日，星期二核醫(yī)學(xué)第六章體外標(biāo)記免疫分析第2頁(yè)，共66頁(yè)，2023年，2月20日，星期二體外標(biāo)記在核醫(yī)學(xué)中的地位體內(nèi)診斷：臟器顯像

功能測(cè)定診斷

體外診斷：放射分析臨床核醫(yī)學(xué)治療：131I治療甲亢核醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)核醫(yī)學(xué)：利用核技術(shù)探索生命現(xiàn)象的本質(zhì)和物質(zhì)變化規(guī)律第3頁(yè)，共66頁(yè)，2023年，2月20日，星期二體外標(biāo)記免疫分析

體外標(biāo)記免疫分析是一門綜合性學(xué)科，也是一門邊緣學(xué)科。是集基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)、實(shí)驗(yàn)醫(yī)學(xué)及臨床應(yīng)用于一體的學(xué)科。在當(dāng)前的各種免疫診斷技術(shù)中，標(biāo)記免疫分析是最活躍、發(fā)展最快的一個(gè)領(lǐng)域。第4頁(yè)，共66頁(yè)，2023年，2月20日，星期二體外標(biāo)記免疫分析概念：

是利用放射分析方法或其派生的相關(guān)非放射分析技術(shù)測(cè)定生物樣品中微量生物活性物質(zhì)含量的一類分析方法。第5頁(yè)，共66頁(yè)，2023年，2月20日，星期二體外標(biāo)記免疫分析特點(diǎn)：

利用抗原－抗體結(jié)合反應(yīng)的特異性，加上各種標(biāo)記物（標(biāo)記抗原或抗體）的可測(cè)量性來(lái)達(dá)到方便敏感地檢測(cè)各種體內(nèi)微量生物活性物質(zhì)，包括內(nèi)分泌激素、蛋白質(zhì)、多肽、核酸、神經(jīng)遞質(zhì)、受體、細(xì)胞因子、細(xì)胞表面抗原、腫瘤標(biāo)志物、血藥濃度等。第6頁(yè)，共66頁(yè)，2023年，2月20日，星期二體外標(biāo)記免疫分析鼻祖:

(Yalow,July19,1921–)

美國(guó)科學(xué)家Yalow和Berson。于1956年創(chuàng)建的放射免疫分析(RIA)，測(cè)定人血漿胰島素獲得成功。樹立了超微量物質(zhì)體外標(biāo)記免疫分析的里程碑。1968年，Miles和Hales建立了免疫放射分析(IRMA)。第7頁(yè)，共66頁(yè)，2023年，2月20日，星期二體外標(biāo)記免疫分析獲獎(jiǎng):在1977年Yalow和Berson因創(chuàng)建了放射免疫分析，使微量物質(zhì)的測(cè)定成為可能，而榮獲諾貝爾生物醫(yī)學(xué)獎(jiǎng)。第8頁(yè)，共66頁(yè)，2023年，2月20日，星期二體外標(biāo)記免疫分析貢獻(xiàn):

隨著基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)和相關(guān)技術(shù)的發(fā)展，在RIA標(biāo)記抗原競(jìng)爭(zhēng)性抑制結(jié)合、IRMA標(biāo)記抗體非競(jìng)爭(zhēng)性結(jié)合的理論基礎(chǔ)上，相繼派生出許多其它的標(biāo)記免疫分析方法，如酶標(biāo)記免疫分析、時(shí)間分辨熒光免疫分析、化學(xué)發(fā)光免疫分析、電化學(xué)發(fā)光免疫分析等多種形式、多種反應(yīng)模式的綜合性標(biāo)記免疫分析體系，并廣泛應(yīng)用于基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)、臨床醫(yī)學(xué)、教學(xué)及科研諸多領(lǐng)域，有力地推動(dòng)了醫(yī)學(xué)科學(xué)的發(fā)展。第9頁(yè)，共66頁(yè)，2023年，2月20日，星期二體外標(biāo)記免疫分析

發(fā)展:

電化學(xué)發(fā)光免疫分析化學(xué)發(fā)光酶免疫分析化學(xué)發(fā)光標(biāo)記免疫分析

時(shí)間分辨熒光免疫分析酶標(biāo)記免疫分析

放射受體分析

免疫放射分析

放射免疫分析第10頁(yè)，共66頁(yè)，2023年，2月20日，星期二體外標(biāo)記免疫分析競(jìng)爭(zhēng)放射結(jié)合分析：標(biāo)記抗原，抗體限量非競(jìng)爭(zhēng)放射結(jié)合分析：標(biāo)記抗體，抗體過量分類第11頁(yè)，共66頁(yè)，2023年，2月20日，星期二第一節(jié)體外標(biāo)記免疫分析的基本原理第12頁(yè)，共66頁(yè)，2023年，2月20日，星期二體外標(biāo)記免疫分析基本原理:非競(jìng)爭(zhēng)性(標(biāo)記抗體)IRMA體外標(biāo)記免疫分析競(jìng)爭(zhēng)性(標(biāo)記抗原)RIA第13頁(yè)，共66頁(yè)，2023年，2月20日，星期二放射免疫分析（RIA）原理放射免疫技術(shù)是標(biāo)記抗原與未標(biāo)抗原競(jìng)爭(zhēng)有限量的抗體，然后通過測(cè)定標(biāo)記抗原抗體復(fù)合物中放射性強(qiáng)度的改變，測(cè)定出未標(biāo)記抗原量。第14頁(yè)，共66頁(yè)，2023年，2月20日，星期二放射免疫分析（RIA）原理

Ag待測(cè)抗原+*Ag+Ab*AgAb+*Ag(標(biāo)記抗原)(特異性抗體)(標(biāo)記抗原抗體復(fù)合物)(游離的標(biāo)記抗原)

AgAb+Ag

抗原抗體復(fù)合物放射免疫分析（RIA）原理標(biāo)記抗原(*Ag)和非標(biāo)記原(Ag)與限量抗體(Ab)競(jìng)爭(zhēng)結(jié)合。*Ag和Ag具有相同的與Ab結(jié)合的能力第15頁(yè)，共66頁(yè)，2023年，2月20日，星期二RIA(競(jìng)爭(zhēng)結(jié)合反應(yīng))原理示意圖AgAg*AbCFAg*BFB/F１.*Ag:定量、足量２.Ab:限量、特異３.*Ag和Ag具有相同的免疫活性４.Ag+*Ag>Ab的有效結(jié)合位點(diǎn)５.*Ag和Ag通過競(jìng)爭(zhēng)的方式與Ab結(jié)合，隨著Ag增加，*Ag與Ab結(jié)合形成的*AgAb復(fù)合物的量減少第16頁(yè)，共66頁(yè)，2023年，2月20日，星期二放射免疫分析（RIA）實(shí)驗(yàn)操作步驟：加樣（Ag，*Ag，Ab)→混勻，溫育（反應(yīng)達(dá)到平衡）→分離→測(cè)量→數(shù)據(jù)處理，質(zhì)量控制第17頁(yè)，共66頁(yè)，2023年，2月20日，星期二測(cè)量測(cè)量復(fù)合物計(jì)數(shù)示意圖：

光子(射線能)與閃爍體的作用↓閃爍體(光脈沖、光能)↓光電倍增管(電能)↓前置放大器(電脈沖)↓電子探測(cè)儀

（計(jì)數(shù)單位是探測(cè)器輸出的電脈沖數(shù)，CPM或CPS）第18頁(yè)，共66頁(yè)，2023年，2月20日，星期二第19頁(yè)，共66頁(yè)，2023年，2月20日，星期二RIA(競(jìng)爭(zhēng)性結(jié)合)標(biāo)準(zhǔn)品劑量反應(yīng)曲線依所測(cè)得的復(fù)合物的放射性計(jì)數(shù)(CPM)，對(duì)比標(biāo)準(zhǔn)品劑量反應(yīng)曲線，求知待測(cè)品的含量第20頁(yè)，共66頁(yè)，2023年，2月20日，星期二免疫放射分析(IRMA)原理單位點(diǎn)：

Ag+*Ab(Ag-*Ab)+*Ab抗原（待測(cè)）標(biāo)記抗體抗原標(biāo)記抗體復(fù)合物雙位點(diǎn)：Ad-Ag+*AbAd-Ag-*Ab

固體抗體-抗原（待測(cè)）標(biāo)記抗體固體抗體-抗原-標(biāo)記抗體復(fù)合物第21頁(yè)，共66頁(yè)，2023年，2月20日，星期二IRMA(非竟?fàn)幗Y(jié)合)反應(yīng)原理第22頁(yè)，共66頁(yè)，2023年，2月20日，星期二IRMA(非竟?fàn)幗Y(jié)合)劑量反應(yīng)曲線第23頁(yè)，共66頁(yè)，2023年，2月20日，星期二RIA＆IRMA的區(qū)別方法RIAIRMA1.標(biāo)記*Ag*Ab2.免疫反應(yīng)式Ag+*Ag+Ab

*Ag-Ab+AgAg+*AbAg-*Ab+*Ab3.Ab限量過量4.競(jìng)爭(zhēng)競(jìng)爭(zhēng)非競(jìng)爭(zhēng)5.測(cè)量復(fù)合物*Ag-AbAg-*Ab6.測(cè)量物計(jì)數(shù)值與標(biāo)本含量呈反比呈正比7.標(biāo)準(zhǔn)曲線形態(tài)╲╱8.靈敏度較低高9.測(cè)量范圍較窄較寬第24頁(yè)，共66頁(yè)，2023年，2月20日，星期二第二節(jié)體外標(biāo)記免疫分析的基本試劑和基本技術(shù)第25頁(yè)，共66頁(yè)，2023年，2月20日，星期二基本試劑和基本技術(shù)１.標(biāo)準(zhǔn)品、質(zhì)控品２.特異性抗體３.示蹤劑(標(biāo)記品)４.分離技術(shù)第26頁(yè)，共66頁(yè)，2023年，2月20日，星期二１.標(biāo)準(zhǔn)品(1)化學(xué)結(jié)構(gòu):應(yīng)與待測(cè)物具有相同的化學(xué)結(jié)構(gòu)(2)化學(xué)純度：高度純化(3)化學(xué)度量：準(zhǔn)確(4)穩(wěn)定性：不易變質(zhì)、不易降解第27頁(yè)，共66頁(yè)，2023年，2月20日，星期二２.特異性抗體(1)親和力大(2)高滴度(3)特異性強(qiáng)(4)可長(zhǎng)期保存第28頁(yè)，共66頁(yè)，2023年，2月20日，星期二３.示蹤劑（標(biāo)記品）

（1）高比活度（2）生物活性與免疫活性與標(biāo)記前一致（3）化學(xué)純度>95%（4）穩(wěn)定性好：標(biāo)記品不易脫落第29頁(yè)，共66頁(yè)，2023年，2月20日，星期二４.分離技術(shù)---要求(1)結(jié)合部分與游離部分盡可能完全分開(2)非特異性結(jié)合率（NSB%）低，小于5%(3)分離的成分便于測(cè)量(4)分離效果不受外界環(huán)境影響(5)分離試劑操作簡(jiǎn)便、價(jià)廉易得第30頁(yè)，共66頁(yè)，2023年，2月20日，星期二微孔濾膜法鹽析法活性炭吸附法磁化顆粒法雙抗體法固相分離法分離方法第31頁(yè)，共66頁(yè)，2023年，2月20日，星期二第32頁(yè)，共66頁(yè)，2023年，2月20日，星期二第33頁(yè)，共66頁(yè)，2023年，2月20日，星期二第34頁(yè)，共66頁(yè)，2023年，2月20日，星期二第35頁(yè)，共66頁(yè)，2023年，2月20日，星期二第36頁(yè)，共66頁(yè)，2023年，2月20日，星期二第37頁(yè)，共66頁(yè)，2023年，2月20日，星期二

第三節(jié)體外標(biāo)記免疫分析的類型第38頁(yè)，共66頁(yè)，2023年，2月20日，星期二體外標(biāo)記免疫分析的類型體外標(biāo)記免疫分析放射性核素標(biāo)記免疫分析(RIA、IRMA)酶標(biāo)記免疫分析發(fā)光標(biāo)記免疫分析(化學(xué)發(fā)光標(biāo)記免疫分析化學(xué)發(fā)光酶免疫分析電化學(xué)發(fā)光免疫分析)時(shí)間分辯熒光免疫分析第39頁(yè)，共66頁(yè)，2023年，2月20日，星期二放射性核素標(biāo)記免疫分析概念：一種將放射性核素測(cè)量的高靈敏性、高精確性和抗原抗體反應(yīng)的高特異性相結(jié)合的體外測(cè)定超微量（10-9～10-15g）物質(zhì)的新技術(shù)。第40頁(yè)，共66頁(yè)，2023年，2月20日，星期二放射性核素標(biāo)記免疫分析分類:競(jìng)爭(zhēng)性(標(biāo)記抗原,抗體限量)RIA非競(jìng)爭(zhēng)性(標(biāo)記抗體,抗體過量)IRMA放射性核素標(biāo)記第41頁(yè)，共66頁(yè)，2023年，2月20日，星期二放射性核素標(biāo)記免疫分析

優(yōu)缺點(diǎn)：

自1959年Yalow和Berson創(chuàng)建的放射免疫分析（RIA）具有靈敏度高、特異性強(qiáng)、簡(jiǎn)便實(shí)用、成本低廉等優(yōu)點(diǎn)。為生物醫(yī)學(xué)的微量物質(zhì)分析開創(chuàng)了新的領(lǐng)域。發(fā)展到目前為止由此衍生出了各種各樣的標(biāo)記免疫分析技術(shù)。雖然RIA仍有較廣泛的使用市場(chǎng)和價(jià)值，但其方法學(xué)上固有的弱點(diǎn)使發(fā)展受到一定限制。如必須使用放射性同位素作為標(biāo)記物，存在人為的因素影響較大、輻射防護(hù)及防止污染的問題，試劑盒使用時(shí)間短，可測(cè)量范圍相對(duì)較窄，難以實(shí)現(xiàn)操作及測(cè)量的自動(dòng)化等。第42頁(yè)，共66頁(yè)，2023年，2月20日，星期二酶標(biāo)記免疫分析（EIA）概念：是應(yīng)用酶標(biāo)記抗體（抗原）與抗原（抗體）產(chǎn)生特異性反應(yīng)，根據(jù)酶對(duì)底物的顯色反應(yīng)而定量分析待測(cè)抗原或抗體含量。分類:均相EIA：酶增強(qiáng)免疫分析（EMIT）非均相EIA:酶聯(lián)免疫吸附分析法（ELASA）第43頁(yè)，共66頁(yè)，2023年，2月20日，星期二時(shí)間分辨熒光免疫分析(TrFIA)概念：是應(yīng)用鑭系元素標(biāo)記抗原或抗體，利用紫外線或激光使其發(fā)射熒光，結(jié)合波長(zhǎng)和時(shí)間兩種分辨技術(shù)的微量分析方法。常用鑭系元素：銪、鋱、釤、鏑特點(diǎn)：分析范圍寬靈敏度高專一度高穩(wěn)定性強(qiáng)1234第44頁(yè)，共66頁(yè)，2023年，2月20日，星期二發(fā)光標(biāo)記免疫分析化學(xué)發(fā)光標(biāo)記免疫分析（CLIA）電化學(xué)發(fā)光免疫分析(ECLIA)化學(xué)發(fā)光酶免疫分析(CLEIA)分類第45頁(yè)，共66頁(yè)，2023年，2月20日，星期二化學(xué)發(fā)光標(biāo)記免疫分析（CLIA）

化學(xué)發(fā)光免疫技術(shù)：化學(xué)發(fā)光分析是根據(jù)化學(xué)反應(yīng)產(chǎn)生的輻射光的強(qiáng)度來(lái)確定物質(zhì)含量的分析方法?；瘜W(xué)發(fā)光免疫分析是將化學(xué)發(fā)光系統(tǒng)與免疫反應(yīng)相結(jié)合，用化學(xué)發(fā)光相關(guān)的物質(zhì)標(biāo)記抗體或抗原，與待測(cè)的抗原或抗體反應(yīng)后，經(jīng)過分離游離態(tài)的化學(xué)發(fā)光標(biāo)記物，加入化學(xué)發(fā)光系統(tǒng)的其它相關(guān)物產(chǎn)生化學(xué)發(fā)光，進(jìn)行抗原或抗體的定量或定性檢測(cè)。第46頁(yè)，共66頁(yè)，2023年，2月20日，星期二發(fā)光YYY磁微粒被測(cè)抗原+抗體+帶吖啶酯標(biāo)記物抗體YYYYYYYYYYY沖洗后---夾心法（1）加入H2O2（pH<10）（2）加入堿（pH>10）第47頁(yè)，共66頁(yè)，2023年，2月20日，星期二化學(xué)發(fā)光標(biāo)記免疫分析（CLIA）概念：利用化學(xué)反應(yīng)中釋放大量自由能產(chǎn)生激發(fā)態(tài)中間體，當(dāng)其退激到基態(tài)時(shí)，發(fā)射出光子，對(duì)這些光子量進(jìn)行測(cè)量從而進(jìn)行定量分析抗原含量。常用發(fā)光劑：魯米諾類、吖啶酯類特點(diǎn)：靈敏度高特異性強(qiáng)重復(fù)性好測(cè)定范圍寬1234第48頁(yè)，共66頁(yè)，2023年，2月20日，星期二化學(xué)發(fā)光酶免疫分析(CLEIA)是將高特異性的酶標(biāo)記免疫分析技術(shù)和具有高靈敏度的化學(xué)發(fā)光分析技術(shù)相結(jié)合的一種標(biāo)記免疫分析方法。發(fā)光劑：金剛烷特點(diǎn)：標(biāo)記結(jié)合穩(wěn)定發(fā)光持續(xù)時(shí)間長(zhǎng)有利于測(cè)定123第49頁(yè)，共66頁(yè)，2023年，2月20日，星期二辣根過氧化物酶標(biāo)記化學(xué)發(fā)光免疫分析示意圖

第50頁(yè)，共66頁(yè)，2023年，2月20日，星期二電化學(xué)發(fā)光免疫分析(ECLIA)簡(jiǎn)介：是新一代標(biāo)記免疫分析技術(shù)，與其它標(biāo)記發(fā)光免疫分析的原理不同，是一種在電極表面由電化學(xué)引發(fā)的特異性化學(xué)發(fā)光反應(yīng)，采用更為理想的標(biāo)記物，使用磁性分離及電激發(fā)等新技術(shù)，進(jìn)一步推動(dòng)了發(fā)光免疫分析的發(fā)展，是目前最先進(jìn)的化學(xué)發(fā)光免疫測(cè)定系統(tǒng)。第51頁(yè)，共66頁(yè)，2023年，2月20日，星期二電化學(xué)發(fā)光免疫分析(ECLIA)原理：以電化學(xué)發(fā)光劑三聯(lián)吡啶釕標(biāo)記抗體（抗原），與待測(cè)標(biāo)本中抗原（抗體）產(chǎn)生免疫反應(yīng)形成復(fù)合物以三丙胺(TPA)為電子供體，在電場(chǎng)中因電子轉(zhuǎn)移而發(fā)生特異性化學(xué)發(fā)光反應(yīng)，它包括電化學(xué)發(fā)光和化學(xué)發(fā)光反應(yīng)兩個(gè)過程。

特點(diǎn)準(zhǔn)確性好多元檢測(cè)均相測(cè)量穩(wěn)定性好靈敏度高第52頁(yè)，共66頁(yè)，2023年，2月20日，星期二

在電化學(xué)發(fā)光免疫分析系統(tǒng)中，磁性微粒為固相載體包被抗體(抗原)，用三聯(lián)吡啶釕標(biāo)記抗原(抗體)，在反應(yīng)體系內(nèi)待測(cè)標(biāo)本與相應(yīng)的抗體(抗原)發(fā)生免疫反應(yīng)后，形成磁性微粒包被抗體-待測(cè)抗原-三聯(lián)吡啶釕標(biāo)記抗體復(fù)合物，這時(shí)將上述復(fù)合物吸入流動(dòng)室，同時(shí)引人TPA緩沖液。當(dāng)磁性微粒流經(jīng)電極表面時(shí)，被安裝在電極下面的電磁鐵吸引住，而未結(jié)合的標(biāo)記抗體和標(biāo)本被緩沖液沖走。與此同時(shí)電極加壓，啟動(dòng)電化學(xué)發(fā)光反應(yīng)，使三聯(lián)吡啶釕和TPA在電極表面進(jìn)行電子轉(zhuǎn)移，產(chǎn)生電化學(xué)發(fā)光，光的強(qiáng)度與待測(cè)抗原的濃度成正比。第53頁(yè)，共66頁(yè)，2023年，2月20日，星期二

[Ru(bpy)3]2+為標(biāo)記物三聯(lián)吡啶釕為水溶性、高穩(wěn)定性的小分子，可以確保電化學(xué)發(fā)光的高穩(wěn)定性，并且無(wú)噪音干擾。三聯(lián)吡啶釕結(jié)構(gòu)簡(jiǎn)單,分子量小，所以，易于標(biāo)記到任何物質(zhì)（如抗原、抗體、核酸，等）上，并且對(duì)原物質(zhì)的生物活性及免疫活性影響小。TPA是ECL中的電子供體，氧化后生成的中間產(chǎn)物是形成激發(fā)態(tài)[Ru(bpy)3]2+化學(xué)能來(lái)源。電化學(xué)發(fā)光免疫分析(ECLIA)的標(biāo)記物第54頁(yè)，共66頁(yè)，2023年，2月20日，星期二電化學(xué)發(fā)光免疫(ECLIA)反應(yīng)模式圖第55頁(yè)，共66頁(yè)，2023年，2月20日，星期二電化學(xué)發(fā)光免疫分析測(cè)定示意圖第56頁(yè)，共66頁(yè)，2023年，2月20日，星期二第四節(jié)體外標(biāo)記免疫分析的質(zhì)量控制第57頁(yè)，共66頁(yè)，2023年，2月20日，星期二質(zhì)量控制的目的近期目的：

通過對(duì)測(cè)定結(jié)果的分析，對(duì)本次測(cè)定的質(zhì)量作出評(píng)價(jià)，并按照預(yù)定的要求決定結(jié)果的取舍。遠(yuǎn)期目的：

通過對(duì)不同批測(cè)定結(jié)果的比較，發(fā)現(xiàn)造成成誤差的原因，從而改進(jìn)實(shí)驗(yàn)條件或設(shè)計(jì)，以提高質(zhì)量。第58頁(yè)，共66頁(yè)，2023年，2月20日，星期二分析誤差