植物基因工程載體及其構(gòu)建課件

第八章

植物基因工程載體及其構(gòu)建第一節(jié)

植物基因工程載體種類第二節(jié)

根癌農(nóng)桿菌Ti質(zhì)粒的結(jié)構(gòu)與功能第三節(jié)

Ti質(zhì)?；蜣D(zhuǎn)化機理第四節(jié)

Ti質(zhì)粒的改造及載體構(gòu)建第五節(jié)

常用選擇標記和報告基因植物基因轉(zhuǎn)化系統(tǒng)l

1.載體轉(zhuǎn)化系統(tǒng)（Ti質(zhì)粒轉(zhuǎn)化載體、Ri質(zhì)粒轉(zhuǎn)化載體、病毒轉(zhuǎn)化載體）l

2.

DNA直接導(dǎo)入轉(zhuǎn)化系統(tǒng)（原生質(zhì)體、基因槍）l

3.種質(zhì)轉(zhuǎn)化系統(tǒng)（花粉管通道法、生殖細胞浸泡法、胚囊子房注射法）。載體轉(zhuǎn)化系統(tǒng)是目前植物基因工程中使用最多、機理最清楚、技術(shù)最成熟的、最重要的一種轉(zhuǎn)化系統(tǒng),其中又以Ti質(zhì)粒轉(zhuǎn)化載體最為重要。

第一節(jié)

植物基因工程載體種類

根據(jù)其功能和構(gòu)建過程，可分為以下種類。（1）目的基因克隆載體：其功能是保存和克隆目的基因。與微生物基因工程相似，通常是由多拷貝的E.Coli小質(zhì)粒為載體。（2）中間克隆載體：是構(gòu)建中間表達載體的基礎(chǔ)質(zhì)粒。是由大腸桿菌質(zhì)粒插入T-DNA片段、目的基因和標記基因等構(gòu)建而成。（3）中間表達載體：是含有植物特異啟動子的中間載體。是構(gòu)建轉(zhuǎn)化載體的質(zhì)粒。（4）卸甲載體：是解除武裝的Ti質(zhì)?；騌i質(zhì)粒，是構(gòu)建轉(zhuǎn)化載體的受體質(zhì)粒。（5）植物基因轉(zhuǎn)化載體：是最后用于目的基因?qū)酥参锛毎妮d體，亦稱工程載體。它是由中間表達載體和卸甲載體構(gòu)建而成。

一、Ti質(zhì)粒的遺傳特性、結(jié)構(gòu)及功能

1.Ti質(zhì)粒的遺傳特性及類型l

Ti質(zhì)粒是根癌農(nóng)桿菌染色體外的遺傳物質(zhì)，為雙股共價閉合的環(huán)狀DNA分子，其分子量為95～156×106D,約有200kb組成。l

根據(jù)其誘導(dǎo)的植物冠癭瘤中所合成的冠癭堿種類不同，Ti質(zhì)?？梢员环殖伤姆N類型：章魚堿型(octopine)、胭脂堿型(nopaline)、農(nóng)桿堿型（agropine）和農(nóng)桿菌素堿型（agrocinopine）或稱琥珀堿型(succinamopine)2.Ti質(zhì)粒的功能區(qū)域

Ti質(zhì)粒可分為四個區(qū)。（1）T-DNA區(qū)（transferred-DNAregions）：T-DNA是農(nóng)桿菌侵染植物細胞時，從Ti質(zhì)粒上切割下來轉(zhuǎn)移到植物細胞的一段DNA，稱為轉(zhuǎn)移DNA。該DNA片段上的基因與腫瘤的形成有關(guān)。（2）Vir區(qū)（virulenceregion）該區(qū)段上的基因能激活T-DNA轉(zhuǎn)移，使農(nóng)桿菌表現(xiàn)出毒性，故稱之為毒區(qū)。T-DNA區(qū)與Vir區(qū)在質(zhì)粒DNA上彼此相鄰，約占Ti質(zhì)粒DNA的三分之一。（3）Con區(qū)（regionsencodingconjugations）該區(qū)段上存在著與細菌間接合轉(zhuǎn)移的有關(guān)基因（tra），調(diào)控Ti質(zhì)粒在農(nóng)桿菌之間的轉(zhuǎn)移。冠癭堿能激活tra基因，誘導(dǎo)Ti質(zhì)粒轉(zhuǎn)移，因此稱之為接合轉(zhuǎn)移編碼區(qū)。（4）Ori區(qū)（originofreplication）該區(qū)段基因調(diào)控Ti質(zhì)粒的自我復(fù)制，故稱之為復(fù)制起始區(qū)。

3.Ti質(zhì)粒的生物學(xué)功能Ti質(zhì)粒的功能可歸為以下7個方面:①

參與寄主細胞合成植物激素吲哚乙酸（IAA）和一些細胞分裂素的活動。②誘發(fā)植物產(chǎn)生冠癭瘤并決定所誘導(dǎo)的腫瘤的形態(tài)學(xué)特征和冠癭堿成分。③

賦予寄主菌株具有分解代謝各種冠癭堿化合物的能力。④

賦予寄主菌株對土壤桿菌所產(chǎn)生的細菌素的反應(yīng)性。⑤

為農(nóng)桿菌提供附著于植物細胞壁的能力。⑥

決定寄主菌株的植物寄主范圍。⑦

有的Ti質(zhì)粒能夠抑制某些根瘤土壤桿菌噬菌體生長與發(fā)育，即具有對噬菌體的“排外性”。二、T-DNA的基因結(jié)構(gòu)與功能

1.T-DNA的發(fā)現(xiàn)Chilton等人（1982）利用同位素標記的Ti質(zhì)粒做探針發(fā)現(xiàn)，加入高濃度煙草腫瘤細胞的DNA后，Ti質(zhì)粒DNA的復(fù)性速度有加快的趨勢。這表明腫瘤DNA中有Ti質(zhì)粒的順序，但該順序不多，而且沒有檢測到完整的Ti質(zhì)粒。以后這些作者將章魚堿型的Ti質(zhì)粒B6-806用內(nèi)切酶SmaI分解成19個片段，分別用同位素標記做成探針，然后與腫瘤DNA進行分子雜交，結(jié)果有二段Ti質(zhì)粒的DNA（3b和10c。）能和腫瘤DNA雜交，也就是Ti質(zhì)粒中這兩段DNA是與腫瘤DNA同源的部分。進一步研究證明，這部分DNA是從質(zhì)粒DNA上切割后，轉(zhuǎn)移到腫瘤細胞，故稱之為轉(zhuǎn)移DNA（transferred-DNA）。這是首次證明在高等植物的細胞內(nèi)存在有微生物的DNA順序。3.T-DNA上的編碼基因及功能

T-DNA的轉(zhuǎn)錄有下述共同點：①T-DNA的兩條鏈都是有意義鏈,即都能被轉(zhuǎn)錄。②T-DNA上每個基因都有各自的啟動子。③基因的轉(zhuǎn)錄由植物細胞RNA聚合酶Ⅱ完成。④T-DNA具典型的真核生物RNA合成起始和終止的調(diào)節(jié)信號，在其5’端轉(zhuǎn)錄起始處有TATA和CAAT盒。同時AATAAA加尾信號也在同一條鏈上發(fā)現(xiàn)，故T-DNA的轉(zhuǎn)錄機理可能與真核生物相同。⑤植物或農(nóng)桿菌中可能有甲基化或去甲基化的調(diào)節(jié)基因活性。T-DNA區(qū)基因的功能

研究方法：用遺傳學(xué)方法在T-DNA區(qū)中引入轉(zhuǎn)座子，使特定的基因發(fā)生突變，從而在腫瘤細胞中T-DNA的一個或多個轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物也隨之消朱?；蛲蛔兒蟛荒苻D(zhuǎn)錄出它所編碼的mRNA，這時可觀察到帶有突變基因的T-DNA的植物細胞的表型，從而確定這些基因轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物的功能。用這種方法證明了編碼兩類轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物的基因序列：

T-DNA區(qū)編碼基因的功能

Aux基因突變將阻斷腫瘤細胞生長素的大量合成，使細胞內(nèi)的細胞分裂素與生長激素的比值升高。野生型腫瘤細胞中細胞分裂素與生長素的比值為0．22，而突變型該值上升到14.4，因此有利于芽的形態(tài)發(fā)生。同時Cyt基因突變將會阻斷細胞分裂素的大量合成，兩者之間的比值下降到0.02，因此有利于根的形態(tài)發(fā)生。正是由于Tms和Tmr基因的表達，使轉(zhuǎn)化植物細胞內(nèi)激素平衡紊亂，冠癭瘤細胞無限生長，形成激素自主性特性，引起癌變。Tms和Tmr基因是致瘤所必須的基因，因此又稱它們?yōu)橹铝龌颍╫ncgene）。三、Vir區(qū)操縱子的基因結(jié)構(gòu)與功能

1.Vir區(qū)操縱子的基因結(jié)構(gòu)除T-DNA外，Ti質(zhì)粒的vir區(qū)也是農(nóng)桿菌致瘤所必須的。Vir區(qū)僅位于T區(qū)DNA左側(cè)。兩者之間的距離常隨Ti質(zhì)粒類型不同而有差異:Octopine的間隔距離較大,而Nopaline間隔距離很小。OctopineTi質(zhì)粒的Vir區(qū)大小為40bp,含有VirA、B、C、D、E、F、G、H(舊稱PinF)等8個操縱子(operon),共24個基因。它們協(xié)同調(diào)節(jié)，形成一個調(diào)控子(regulon),起共調(diào)控作用(co-regulation)。而Nopaline有7個操縱子,比Octoppine少一個VirF操縱子。

3.VirG操縱子的誘導(dǎo)表達及功能VirG操縱子小于VirA，只有1.0kb，同樣是單基因結(jié)構(gòu)，只能編碼一條多肽，被稱為VirG蛋白，即DNA結(jié)合活化蛋白（DNA-bindingactivatorprotein）。它的C端已知有DNA結(jié)合活性。它的N未端部分具有磷酸化的酸性結(jié)構(gòu)。當(dāng)磷酸化的A蛋白將其磷酸基轉(zhuǎn)到VirG蛋白（30kD）保守的天冬氨酸鹽殘基上時，使VirG蛋白活化?；罨腣irG蛋白可能以二體或多體形式結(jié)合到Vir區(qū)啟動子的特定區(qū)域，從而成為其它Vir基因轉(zhuǎn)錄的激活因子，打開VirB、C、D、E、H等幾個基因。并己證明，VirA或VirG突變后會減弱或完全失去對其它Vir位點活化的誘導(dǎo)。VirA及VirG的這種調(diào)控作用被稱為雙因子調(diào)控體系（two一componentregu1atorysystem）。4.VirH、F及Tzs操縱子的誘導(dǎo)表達及其功能這些基因?qū)|(zhì)粒是特異性的，在Octopine中有VirF、VirH，在Nopaline中有Tzs。

VirH：可能對植物產(chǎn)生的某些殺菌或抑菌化合物起解毒作用，從而使農(nóng)桿菌的生長不受這些物質(zhì)的抑制，可增強致瘤能力。Tzs：大部分Nopaline菌株的Ti質(zhì)粒上均有Tzs基因,即轉(zhuǎn)運玉米素合成酶基因（trans-zeatinsyntheasegene），在細菌中表達后將玉米素分泌到細胞外。該細胞分裂素被植物所吸收后，能促進農(nóng)桿菌感染部位的植物組織脫分化和細胞分裂，提高植物對農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化的感受性。VirF操縱子編碼一個23kD蛋白，它與任何數(shù)據(jù)庫中所有蛋白質(zhì)的序列無明顯同源性。最近采用報告基因連接插入法研究發(fā)現(xiàn)，VirF在T-DNA運輸時發(fā)揮作用。第三節(jié)

農(nóng)桿菌Ti質(zhì)?；蜣D(zhuǎn)化機理

已知農(nóng)桿菌附著到植物細胞后，只留在細胞間隙中。T-DNA首先在細菌中被加工、剪切、復(fù)制，然后轉(zhuǎn)入植物細胞，并非整個Ti質(zhì)粒都進入植物細胞。該基因轉(zhuǎn)化過程是一個復(fù)雜的遺傳工程。1.T-DNA的復(fù)制

首先是在下鏈（或稱底鏈bottomstrand）25bp重復(fù)序列的右邊界左起第3和第4堿基間缺口剪切，然后從缺口3′端開始合成新的DNA鏈，并一直延伸到左邊界第22堿基處，置換出原來的下鏈，形成ssDNA，即T鏈。NopalineT-DNA在缺口剪切后形成包括左右邊界在內(nèi)的單一T鏈，但OctopineT-DNA在剪切后則可形成6種T鏈，即TL、TC、TR、TL-TC、TC-TR,以及TL-TC-TR，這意味著邊界序列的剪切是相互獨立的。2.VirD1及VirD2的功能VirD1（16kD）及VirD2（47Kd）蛋白與T-DNA的加工有關(guān)，它決定在邊界重復(fù)序列的特定位點上形成切口，產(chǎn)生T鏈斷裂。VirD1及virD2突變，T-DNA邊界便不能缺口剪切并形成T鏈。這種缺口剪切可分成兩步：VirDl首先與25bp邊界序列親和結(jié)合，使邊界序列松弛，然后使VirD2可在特異位點剪切。VirD2至少有兩個功能，①特異剪切，并與T鏈的5′端共價結(jié)合,應(yīng)當(dāng)指出,農(nóng)桿菌并非以裸露的DNA分子轉(zhuǎn)入植物細胞,而是T鏈的5′端與VirD2蛋白共價結(jié)合,這樣可使T鏈的5′端不受核酸酶的攻擊。②導(dǎo)向功能。已知僅VirD2蛋白分子N-端的50%已足以缺口剪切,形成T鏈。VirD2蛋白分子的另一半即C端可作為核定位的信號,引導(dǎo)T鏈進到植物的細胞核,故稱這為“向?qū)А?。這是因為C端含有特異的氨基酸序列(核靶序列,nucleartargetngsequence)之故。

3.VirC的功能

VirC編碼兩種蛋白VirC1及VirC2蛋白。VirC1蛋白可特異地與OctopineTi質(zhì)粒上的超驅(qū)動序列結(jié)合,從而促進T-DNA邊界序列的缺口剪切。若VirC操縱子突變，則侵染性減弱。當(dāng)VirD1、VirD2不足時,VirC1有促進T-DNA加工的作用，但當(dāng)VirD1、VirD2高量表達時,則VirC1對T鏈的形成無作用。VirC2蛋白的功能尚不清楚。

其它Vir基因產(chǎn)物與邊界缺口剪切及T鏈形成無關(guān)。三、T鏈復(fù)合體的轉(zhuǎn)運及VirB的功能如上所述,T鏈復(fù)合體至少包括T鏈,VirD2及VirE2。VirD2及VirE2可能已足以保護Ｔ鏈并對Ｔ鏈的轉(zhuǎn)運起導(dǎo)向作用，但Ｔ鏈的轉(zhuǎn)運無疑還需要其它活性物質(zhì)。這種活性物質(zhì)可能來自蛋白質(zhì)，可以是細菌和/或植物的特異蛋白。若為細菌蛋白，則可能是VirB蛋白。因為Ｔ鏈轉(zhuǎn)運的第一步是通過細菌細胞膜，因此首先必須形成跨膜孔道，需有跨膜或膜結(jié)合蛋白的參與。

1.跨膜或膜結(jié)合蛋白有兩個主要特性

(1)穿膜通常需在蛋白質(zhì)的N端有一信號肽序列，這種蛋白可能獨立地或在類似伴隨蛋白受體幫助下穿越細菌內(nèi)膜（IM），特異肽酶在N端信號序列處剪切，產(chǎn)生成熟蛋白，并停止繼續(xù)轉(zhuǎn)運。(2)有富含疏水殘基的約20個氨基酸的密接伸長段（contiguousstretches）。向IM轉(zhuǎn)運的蛋白質(zhì)可以（但非必須）在其N端含剪切的信號序列，但疏水伸長段則有錨式功能，使蛋白質(zhì)駐留（1odging）在膜上。五、T鏈整合植物基因組

的分子機理

1.整合位點及其特性遺傳作圖的分析表明，T-DNA在植物染色體中的插入是隨機的。它可插入任何一條植物染色體。但插入位點常有以下特點：①T-DNA優(yōu)先整合到轉(zhuǎn)錄活躍的植物基因位點；②T-DNA與植物DNA連接處富含A，T堿基對；③植物DNA上的插入靶位點與T-DNA邊界序列有一定程度的同源性。Matsumoto等人認為正是由于這種同源性才使得插入的T-DNA和靶序列能互相靠近，并有效地發(fā)生DNA鏈的交換。非常有趣的是他們還發(fā)現(xiàn)在植物基因組靶序列附近有一段（dG-dT）10序列。這種（dG一dT）10是真核基因組中保守的高度重復(fù)序列。當(dāng)DNA處于負超螺旋時，該重復(fù)序列極易形成Z-DNA，使位于它附近的序列部分解旋，為DNA重組、T-DNA插入提供位點。2.T-DNA的整合機理

Mayerhofer等從轉(zhuǎn)化的擬南芥菜中分離并測定插入的T-DNA及插入位點序列，發(fā)現(xiàn)T-DNA的插入使得靶序列缺失29～73bp。一部分整合的T-DNA片段不完整，兩端均有缺失。靶序列斷裂處與插入的T-DNA兩端有部分重疊。另一部分整合的T-DNA卻保持完整。其中一些插入的T-DNA能精確地取代植物靶序列，其右邊界與靶序列連接，T-DNA左未端和靶序列裂口同源。還有一種情形則是，T-DNA插入片段的未端與缺失的靶序列裂口處并無同源性，而是在其內(nèi)部有部分短片段與T-DNA未端同源。在靶序列裂口處還發(fā)現(xiàn)有DNA序列的倒位或重復(fù)。T-DNA的整合是異常重組（illegitimaterecombination）的結(jié)果。T-DNA右未端在靶序列的識別及連接中是必需的，T-DNA左未端和兩個靶DNA未端則參與部分配對和DNA修復(fù)。3.T-DNA整合的遺傳效應(yīng)

T-DNA插入的位點不同，可使轉(zhuǎn)基因植物具有不同的表型和遺傳特性，即所謂位點效應(yīng)（positioneffect）。已知T-DNA可插入多個物理位點。遺傳位點數(shù)一般少于或等于插入的物理位點數(shù)，這是因為甲基化可使基因不表達，或者幾個拷貝連鎖在一起。多拷貝的T-DNA可插入不同的獨立位點，或可首尾串聯(lián)（trandem）插入同一位點，多拷貝T-DNA進人同一植物細胞后，這些拷貝之間可能相互作用，導(dǎo)致基因的沉默，這種現(xiàn)象現(xiàn)被稱為共抑制（co-supression）。T-DNA插入的遺傳特性：(1)T-DNA的插入不引起植物DNA大的重排。但多數(shù)插入會導(dǎo)致靶位點處小的缺失，缺失多至79個核苷酸。(2)另一個常見的結(jié)果是，在T-DNA／植物DNA連接處，會有幾個至33個核苷酸的“填充”DNA（FillerDNA）存在，這些“填充”DNA的序列與靠近連接處的植物DNA序列相似。(3)在植物靶位處不要求有特異的序列，但若在T-DNA兩端和植物靶位處之間有一段短序列（5～10b）同源，則可以在整合中起作用。六、農(nóng)桿菌染色體基因?qū)-DNA轉(zhuǎn)移的調(diào)控

目前已發(fā)現(xiàn)位于細菌染色體上的一些基因也和T-DNA的轉(zhuǎn)移有關(guān)，并且已經(jīng)了解它們編碼的蛋白質(zhì)的功能。ChvA、ChvB、ChvC參與細菌的附著功能；Cel位點與細菌表面纖維絲的合成有關(guān);Att基因影響農(nóng)桿菌細胞表面蛋白的合成；ivr基因的突變能使農(nóng)桿菌細胞表面的脂多糖發(fā)生改變而影響農(nóng)桿菌宿主范圍；PscA和ExoC基因與多糖合成有關(guān)，并影響農(nóng)桿菌附著能力。以上這些基因的突變將使細菌表面成分發(fā)生變化，從而喪失與植物細胞識別和結(jié)合的能力。此外，ChvD位點影響AS對毒性區(qū)的誘導(dǎo)效率和農(nóng)桿菌的致瘤能力。CbvE位點編碼一個單糖結(jié)合蛋白，與單糖影響Vir區(qū)的表達有關(guān)。Ros基因與Vir基因的負調(diào)節(jié)有關(guān)?？梢?，目前已知農(nóng)桿菌染色體上有10個基因與T-DNA轉(zhuǎn)移有關(guān)。第四節(jié)

農(nóng)桿菌Ti質(zhì)粒的改造及載體構(gòu)建

一、Ti質(zhì)粒的改造及卸甲載體構(gòu)建二、中間載體的構(gòu)建三、中間表達載體的構(gòu)建四、植物基因轉(zhuǎn)化載體系統(tǒng)的構(gòu)建一、Ti質(zhì)粒的改造及卸甲載體構(gòu)建

野生型Ti質(zhì)粒直接作為植物基因工程載體，存在如下障礙：①Ti質(zhì)粒分子量過大，一般在160～240kb，比pBR322質(zhì)粒大50倍左右，在基因工程中難以操作；②大型的野生Ti質(zhì)粒上分布著各種限制酶的多個切點，不論用何種限制酶切割，都會被切成很多片段，因此難以找到可利用的單一限制性內(nèi)切酶位點，不能通過體外DNA重組技術(shù)直接向野生型Ti質(zhì)粒導(dǎo)入外源基因；③T-DNA區(qū)內(nèi)含有許多編碼基因，其中Onc基因的產(chǎn)物干擾宿主植物中內(nèi)源激素的平衡，轉(zhuǎn)化細胞長成腫瘤，阻礙細胞的分化和植株的再生；④Ti質(zhì)粒不能在大腸桿菌中復(fù)制,即使得到重組質(zhì)粒，也只能在農(nóng)桿菌中進行擴增；而農(nóng)桿菌的轉(zhuǎn)化率極低（10％左右）,因此，通過Ti質(zhì)粒的體外操作，在常規(guī)分子克隆條件下幾乎不能構(gòu)建在T-DNA中只有單一切點的載體；⑤Ti質(zhì)粒上還存在一些對于T-DNA轉(zhuǎn)移不起任何作用的基因。

為了使Ti質(zhì)粒成為有效的外源基因?qū)胼d體，必須對野生型Ti質(zhì)粒進行一番科學(xué)的改造。十分幸運的是，大腸桿菌具有能與農(nóng)桿菌高效地接合轉(zhuǎn)移的特性。因此，科學(xué)家們可以先將T-DNA片段克隆到大腸桿菌的質(zhì)粒中，并插入外源基因，最后通過接合轉(zhuǎn)移把外源基因引入到農(nóng)桿茵的Ti質(zhì)粒上，這是一種把預(yù)先進行亞克隆、切除、插入或置換的T-DNA引入Ti質(zhì)粒的有效方法。帶有重組T-DNA的大腸桿菌質(zhì)粒衍生載體稱為”中間載體”（intermediatevector），而接受中間載體的Ti質(zhì)粒則稱為受體Ti質(zhì)粒（acceptorTip1asmid），一般是卸甲載體（disarmedvector）。1．

Onc-卸甲載體

所謂卸甲載體就是無毒的（non-oncogenic）Ti質(zhì)粒載體。因為利用野生型的Ti質(zhì)粒作載體時，影響植株再生的直接原因是T-DNA中Onc基因的致瘤作用。因此，為了使野生型的Ti質(zhì)粒成為基因轉(zhuǎn)化的載體，必須切除T-DNA上的Onc基因，即“解除”其“

武裝”,構(gòu)建成所謂“卸甲”或稱“繳械”載體（disarmedvector）。在這種Onc-載體中，已經(jīng)缺失的T-DNA部位被大腸桿菌的一種常用的質(zhì)粒pBR322取代。這樣任何適合于克隆在pBR322質(zhì)粒中的外源DNA片段，都可以通過與pBR322質(zhì)粒DNA的同源重組，而被共整合到Onc-Ti質(zhì)粒載體上。2.Onc十卸甲載體

對于研究外源基因在轉(zhuǎn)基因植株中的表達，以及對于以改良農(nóng)作物為目的的植物基因工程而言，Onc一體系是最有用的。不過，人們可能還要設(shè)計一些特殊的實驗來研究外源基因在冠癭瘤組織中的表達問題。在這種情況下，使用Onc十

菌株載體則比較合適。由于冠癭瘤組織具有不依賴于激素的表型特征，所以這種載體系統(tǒng)的優(yōu)點在于它可以快速地增生冠癭組織，比較快速而容易得到轉(zhuǎn)化體。二、中間載體的構(gòu)建

1.中間載體的基本結(jié)構(gòu)與特點為解決Ti質(zhì)粒不能直接導(dǎo)入目的基因的困難，構(gòu)建中間載體（intermediatevector）是有效方法之一。中間載體是一種在一個普通大腸桿菌的克隆載體（例如pBR322質(zhì)粒）中插入了一段合適的T-DNA片段，而構(gòu)成的小型質(zhì)粒。中間載體通常是多拷貝的E.Coli小質(zhì)粒，這一點對于通過體外遺傳操作導(dǎo)入外源基因是非常必要的。從結(jié)構(gòu)特點看可分為兩類中間載體，即共整合系統(tǒng)中間載體和雙元載體系統(tǒng)中間載體。共整合系統(tǒng)中間載體的特征①中間載體必須含有與Ti質(zhì)粒T-DNA區(qū)同源的序列，此外含有pBR的序列，在其被引入到根癌農(nóng)桿菌后即可高頻地與Ti質(zhì)粒的T-DNA的同源序列進行重組；②它應(yīng)具有一個或幾個細菌選擇標記，這將有利于篩選共整合質(zhì)粒；③它必須

有bom位點，在有誘導(dǎo)質(zhì)粒存在的情況下，bom位點的存在可以使中間載體在不同細菌細胞內(nèi)進行轉(zhuǎn)移；④它應(yīng)該含有陽性植物選擇標記，以利于轉(zhuǎn)化植物細胞的篩選，例如新霉素磷酸轉(zhuǎn)移酶(neomycinphosphotransferase,Npt-Ⅱ)基因，其可賦予轉(zhuǎn)化植物細胞卡那霉素抗性；⑤它應(yīng)該含有單一的限制性內(nèi)切酶切點，以利于外源基因的插入；⑥無Ti質(zhì)粒的邊界序列。雙元載體系統(tǒng)的中間載體與共整合系統(tǒng)中間載體不同之處是①無同源序列；②具有LB和RB;③無Co1E1復(fù)制點

三、中間表達載體的構(gòu)建中間載體從功能看可分為兩大類，即克隆載體和表達載體?？寺≥d體的主要功能是復(fù)制和擴增基因；表達載體是適于在受體細胞中表達外源基因的載體。

上述構(gòu)建的中間載體導(dǎo)入農(nóng)桿菌Ti質(zhì)粒并轉(zhuǎn)化到植物細胞后，插入的外源基因能否得到表達是一個十分重要的問題。研究表明，早期曾通過各種中間載體引入的外源基因，如轉(zhuǎn)座子的抗生素抗性基因、酵母的乙醇脫氫酶基因、動物的β-珠蛋白基因和干擾素基因等，均未能在植物中表達。這是因為這些外源基因都缺乏特異啟動子的緣故，后來的研究發(fā)現(xiàn)，在中間載體中加上能在植物細胞中表達的各種啟動子后，可使外源基因能在植物細胞中表達。這類含植物特異啟動子的中間載體就稱為中間表達載體（intermediateexpressionvector）。1．啟動子及其它調(diào)控序列轉(zhuǎn)錄的調(diào)控對真核生物基因表達起著關(guān)鍵性作用。就真核生物基因表達調(diào)控序列而言，大多數(shù)真核生物在轉(zhuǎn)錄起始點的5′端上游區(qū)第30至25bp處具有TATA盒，在70至80bp處還有CAAT盒。在大多數(shù)真核生物基因的3′端具有AATAA序列。這些5′和3′端的調(diào)控序列對真核生物的基因表達起著關(guān)鍵性作用。Ti質(zhì)粒雖然來源于農(nóng)桿菌，

但其Nos、Ocs、Tmr等基因具有與真核生物啟動子類似的TATA盒和CAAT盒，均能在植物細胞中表達，并且無組織特異性。因此，它們成為早期構(gòu)建嵌合基因的啟動子，其中以Nos啟動子（pNos）最常用。1．啟動子及其它調(diào)控序列近年來的研究發(fā)現(xiàn),來自花椰菜花葉病毒DNA的CaMV的35s啟動子能使嵌合的外源基因在植物細胞中表達，并表現(xiàn)出強烈的表達功能。由CaMV35s啟動子、外源結(jié)構(gòu)基因及Nos3′端的非編碼區(qū)域組成的嵌合基因，能在植物細胞中很快高效表達。CaMV35s啟動子既無組織特異性，又不受發(fā)育時期的影響，是一個理想的植物基因工程的啟動子。另外，近年來也發(fā)現(xiàn)，19s啟動子亦能使嵌合基因在植物細胞中表達。近年來，從植物基因中分離出組織特異表達啟動子及誘導(dǎo)表達啟動子，為實現(xiàn)外源基因的定時、定位高效表達奠定了基礎(chǔ)。

2.嵌合基因（chimericgene）構(gòu)建

所謂嵌合基因就是來自兩種或兩種以上生物的啟動子、結(jié)構(gòu)基因、終止子連接在一起構(gòu)成基因。3中間表達載體的構(gòu)建過程中間表達載體是由中間載體加上能在植物細胞中表達的啟動子及基因構(gòu)成，也就是嵌合基因插入中間載體后構(gòu)成，所以中間載體的構(gòu)建是一個十分復(fù)雜的過程。

下面以pLGV2381為例簡要地說明其構(gòu)建過程。（見圖8-1）四、植物基因轉(zhuǎn)化載體系統(tǒng)的構(gòu)建上述構(gòu)建的中間表達載體仍然不能直接作為植物外源基因轉(zhuǎn)化的載體，因為中間表達載體仍是一種細菌的質(zhì)粒，不能把外源基因轉(zhuǎn)化到植物細胞。因此，必須進一步把中間載體引入到上述已改造的受體Ti質(zhì)粒中，并構(gòu)建成能侵染植物細胞的基因轉(zhuǎn)化載體，才能應(yīng)用于植物基因的轉(zhuǎn)化。它是由兩種以上質(zhì)粒構(gòu)成的復(fù)合型載體，故稱之為載體系統(tǒng)。近年來的研究已經(jīng)建立許多種載體系統(tǒng)，但目前主要采用兩種Ti質(zhì)?；蜣D(zhuǎn)化載體系統(tǒng)，即一元載體系統(tǒng)和雙元載體系統(tǒng)。1．一元載體系統(tǒng)的構(gòu)建這一類載體是中間表達載體與改造后的受體Ti質(zhì)粒之間，通過同源重組所產(chǎn)生的一種復(fù)合型載體，通常亦稱為共整合載體（co-intergratedvecter），又由于該載體的T-DNA區(qū)與Ti質(zhì)粒Vir區(qū)連鎖，因此又稱之為順式載體（cis-vector）。一元載體的特點是:①由兩個質(zhì)粒（E.coli質(zhì)粒和Ti質(zhì)粒）重組而成，分子量較大；②共合體的形成頻率與兩個質(zhì)粒的重組頻率有關(guān),相對較低；③必須用Southern雜交或PCR對大的共整合體質(zhì)粒進行檢測；④構(gòu)建時比較困難。一元載體系統(tǒng)目前主要有兩種載體：共整合載體和拼接未端載體（split-endvector,SEV）。

（1）共整合載體的構(gòu)建共整合載體的特點是：①中間表達載體與受體Ti卸甲載體，通過同源重組共整合而構(gòu)建；②中間表達載體與受體Ti質(zhì)粒之間同源序列是pBR322。共整合載體的構(gòu)建過程l）中間載體pLGV1103導(dǎo)入農(nóng)桿菌:目前通常采用兩種方法，即接合轉(zhuǎn)移法（conjugativetransfer）和三親雜交轉(zhuǎn)移法。2）中間載體與受體Ti質(zhì)粒的同源重組。3）共整合載體的選擇。

（2）SEV的構(gòu)建SEV系統(tǒng)即T-DNA邊界拼接系統(tǒng)，亦稱拼接末端載體（sp1it-endvecter,SEV）。它是由Freley等人于1985年建立的另一種共整合載體，也因為它的兩個LIH序列在同源重組前分別處于不同質(zhì)粒上而得名。SEV與pGV3850的差異及構(gòu)建過程如下述：1）SEV的受體Ti質(zhì)粒的T-DNA上的致瘤基因（onc）及TR都已被缺失，T-DNA的保留部分被稱為“左邊界內(nèi)部同源區(qū)”（1eftinsidehomcology，LIH）。該受體Ti質(zhì)粒還保留了Vir基因及其它正常的功能基因，同時還攜有用于細菌篩選的抗性基因。2）SEV中間載體具有一個細菌的抗性基因，一個植物抗性基因及與受體Ti質(zhì)粒同源的LIH序列及TR。3）通過三親雜交將中間載體導(dǎo)入農(nóng)桿菌后，由于它們之間都具有LIH同源序列，即可發(fā)生同源重組，形成SEV的共整合載體。

（3）SEV與pGV3850比較兩者都是通過受體Ti質(zhì)粒與中間載體同源重組而形成，故同屬于共整合的一元載體系統(tǒng)，但它們之間有著一定的差異：1）它們的受體Ti質(zhì)粒與中間載體的結(jié)構(gòu)不同。pGV3850的左右邊界在一個受體Ti質(zhì)粒上，而SEV來自二個質(zhì)粒，即TR來自中間載體。、2）同源序列不同。pGV3850重組的同源序列是pBR322，而SEV是LIH。3）SEV是更有效的共整合載體。由于pGV3850共整合載體，帶有大腸桿菌pBR322序列，外源基因嵌合在該序列中，因而轉(zhuǎn)化的植物中也帶有重復(fù)的pBR322序列。此重復(fù)序列可能對轉(zhuǎn)化植物中的外源基因的穩(wěn)定性有影響，而SEV系統(tǒng)則排除了這種可能。2．雙元載體系統(tǒng)

雙元載體（binaryvecter）系統(tǒng)是指由兩個分別含T-DNA和Vir區(qū)的相容性突變Ti質(zhì)粒構(gòu)成的雙質(zhì)粒系統(tǒng),又因為其T-DNA與Vir基因在兩個獨立的質(zhì)粒上，通過反式激活T-DNA轉(zhuǎn)移,故稱之為反式載體（transvecter）.（1）雙元載體系統(tǒng)的構(gòu)建原理雙元載體主要包括兩個Ti質(zhì)粒，即微型Ti質(zhì)粒和輔助Ti質(zhì)粒。

Ti質(zhì)粒上的Vir基因與T-DNA具有反式互補作用，Vir基因可以反式激活T-DNA的轉(zhuǎn)移。其次，中間載體含有廣泛寄主范圍質(zhì)粒的復(fù)制起始點（oriV），而代替了共整合載體中用以重組的同源區(qū)，能夠在任何農(nóng)桿菌寄主里自發(fā)復(fù)制。（2）微型Ti質(zhì)粒（mini-Tiplasmid）雙元載體系統(tǒng)是在微型Ti質(zhì)?；A(chǔ)上產(chǎn)生的。所謂微型質(zhì)粒就是含有T-DNA邊界、缺失vir基因的Ti質(zhì)粒。Mini-Ti是一個廣譜質(zhì)粒，除含有T-DNA（左、右邊界）外，還具有廣譜質(zhì)粒的復(fù)制位點oriV及選擇標記基因。Bevan等（1984）構(gòu)建的pBinl9微型質(zhì)粒（圖822）是應(yīng)用得最廣泛的Mini-Ti。它含有來自pTiT37的T-DNA左右邊界序列，在兩個邊界序列之間的T-DNA區(qū)含有植物選擇標記NptII基因，以及來自噬菌體M13mpl9的多種酶連接接頭的LacZ基因。在LacZ基因內(nèi)部含有多克隆位點，外源基因可以便利地插入其間使其本身失活。此外，Binl9含有廣宿主質(zhì)粒Rk2的復(fù)制和轉(zhuǎn)移的起始位點。（3）輔助Ti質(zhì)粒含有Vir區(qū)段的Ti質(zhì)粒稱為輔助Ti質(zhì)粒（he1perTi）。實際上輔助Ti質(zhì)粒是T-DNA缺失的突變型Ti質(zhì)粒，完全喪失了致瘤功能，因此是相當(dāng)于在共整合載體系統(tǒng)中的卸甲Ti質(zhì)粒（disarmedTi）。其主要作用是提供Vir基因功能，激活處于反式位置上的T-DNA轉(zhuǎn)移，該卸甲載體在此又稱之為輔助Ti質(zhì)粒（he1perTi）。

最常用的輔助Ti質(zhì)粒是根癌農(nóng)桿菌LBA4404所含有的Ti質(zhì)粒pAL4404。其為章魚堿型Ti質(zhì)粒pTiAch5的衍生質(zhì)粒，其T-DNA區(qū)已發(fā)生缺失突變，但仍保存有完整的Vir基因功能。近年來的研究表明，野生型的Ti質(zhì)粒即不卸甲的Ti質(zhì)粒，同樣可以作為輔助Ti質(zhì)粒，而且具有更強毒性。

（4）雙元載體的構(gòu)建將MiniTi質(zhì)粒轉(zhuǎn)入含有He1perTi質(zhì)粒根癌農(nóng)桿菌的途徑有兩條，一條是直接用純化的MiniTi質(zhì)粒轉(zhuǎn)化速凍的根癌農(nóng)桿菌感受態(tài)細胞；另一條是與共整合載體構(gòu)建一樣，采用三親接合的方式。MiniTi質(zhì)粒均能以E.coli的pRK2013為輔助質(zhì)粒，通過三親雜交而接合轉(zhuǎn)移到含有輔助Ti質(zhì)粒的農(nóng)桿菌細胞內(nèi)。由于E.coli的pRK2013不能在農(nóng)桿菌中復(fù)制最后消失，含有MiniTi質(zhì)粒和He1perTi質(zhì)粒的根癌農(nóng)桿菌可直接用于植物細胞的轉(zhuǎn)化。

（5）一元載體系統(tǒng)和雙元載體系統(tǒng)的比較

綜上所述，雙元載體系統(tǒng)與一元載體系統(tǒng)之間有著較大的差異：1）雙元載體不需要共整合過程，因此系統(tǒng)中的兩個質(zhì)粒不必含有同源序列。2）Mini-Ti質(zhì)粒具有E.coli質(zhì)粒的復(fù)制位點、能在農(nóng)桿菌的寄主中復(fù)制，使其質(zhì)粒的拷貝數(shù)增加10～100倍，而且Mini-Ti質(zhì)粒分子量?。?0kb），可以直接進行體外遺傳操作。3）雙元載體不需經(jīng)過兩個質(zhì)粒的共整合過程，因此構(gòu)建的操作步驟比較簡單。。4）由于mini-Ti質(zhì)粒較小，并無共整合過程，因此質(zhì)粒轉(zhuǎn)移到農(nóng)桿菌比較容易，而且構(gòu)建的頻率較高。（5）一元載體系統(tǒng)和雙元載體系統(tǒng)的比較5）由于根癌農(nóng)桿菌感染的寄主范圍是由Vir基因及染色體上的基因決定的，因此，使用雙元載體系統(tǒng)更便于根據(jù)轉(zhuǎn)化材料的來源不同選擇適宜的He1per系統(tǒng)。6）雙元載體在外源DNA轉(zhuǎn)入植物細胞前，無需進行同源重組，插入載體的外源基因變異可能要比pGV3850系統(tǒng)來得小。

7）共整合載體系統(tǒng)比雙元載體系統(tǒng)更難以應(yīng)用，通常一個共整合載體在用于植物轉(zhuǎn)化之前，應(yīng)弄清Ti質(zhì)粒的拷貝數(shù)和大小，所以必須通過southern雜交來鑒定。8)共整合載體的重組頻率很低，而雙元載體系統(tǒng)的兩個質(zhì)粒接合的頻率較高，一般至少高4倍，因此雙元載體的構(gòu)建頻率較高。9）共整合載體構(gòu)建成功后，工程菌的穩(wěn)定性較好，雙元載體穩(wěn)定性較差，容易丟失。10）雙元載體在外源基因的植物轉(zhuǎn)化中效率高于共整合載體。3．載體卡盒當(dāng)一個動植物的外源基因插入轉(zhuǎn)錄載體后實現(xiàn)表達的水平高低十分重要，高效表達系統(tǒng)的建立在基因工程中非常有用。所以科學(xué)家們不斷地構(gòu)建一些復(fù)雜的載體來提供全部必須的表達信號。最近幾年來，更先進的一代表達載體已得到發(fā)展。這些載體以卡盒形式提供基因表達所需的全部信號，包括啟動子、終止子、增強子等。然后新的外源基因被插入到表達信號簇中間的唯一限制性切點，所以稱之為盒式載體。在植物基因轉(zhuǎn)化載體構(gòu)建中同樣采用了上述原理構(gòu)建成載體卡盒。所謂載體卡盒(vectercassette)（圖8-23）是將植物標記基因、多克隆位點、細菌標記基因和廣譜質(zhì)粒的復(fù)制和動員功能均集于一身的集裝箱似的載體系統(tǒng)。利用載體卡盒可以更便利地構(gòu)建基因轉(zhuǎn)化載體。五、載體構(gòu)建中常用的選擇標記及報告基因如何選擇和篩選轉(zhuǎn)化體同樣是一個重要問題?？茖W(xué)家家一直試圖把轉(zhuǎn)化體帶上一個標記，從而便于選擇和篩選。至今己建立了許多標記基因，并已插入各種轉(zhuǎn)化載體中，作為一種標記基因。（不論是選擇標記基因還是篩選標記基因，后者亦稱報告基因）都必須具備以下四個條件：①編碼一種不存在于正常植物細胞中的酶；②基因較小，可構(gòu)成嵌合基因；③能在轉(zhuǎn)化體中得到充分表達；④檢測容易，并且能定量分析。選擇標記基因和篩選標記基因除具有上述共同之處外，它們在功能和性質(zhì)上還有一定差異。選擇標記基因的功能主要是該基因的產(chǎn)物給予植物細胞產(chǎn)生一種選擇壓力，致使未轉(zhuǎn)化細胞不能生長、發(fā)育與分化。而轉(zhuǎn)化細胞對該標記產(chǎn)生抗性，不影響其生長等，從而將轉(zhuǎn)化細胞選擇出來，例如，Cat（氯霉抗性基因）。篩選標記基因強調(diào)給轉(zhuǎn)化細胞帶上一種標記，起報告和識別作用，故稱報告基因。

1．選擇標記的應(yīng)用

選擇標記的功能是在選擇壓力下把轉(zhuǎn)化體選擇出來。為達到這一目的，首先要在選擇培養(yǎng)基中加入選擇劑，產(chǎn)生一種選擇壓力，致使未轉(zhuǎn)化細胞不能生長、發(fā)育。其次是選擇標記基因的產(chǎn)物對選擇劑產(chǎn)生抗性，致使轉(zhuǎn)化細胞不受選擇劑的影響，能正常生長、發(fā)育、分化，從而把轉(zhuǎn)化體選擇出來。近年來已研究出較多的選擇標記基因。在選擇標記的使用中值得注意的是標記基因的正確選擇。沒有一種標記在所有的植物全都行之有效；不同的標記基因?qū)D(zhuǎn)化細胞的生長發(fā)育及轉(zhuǎn)化率有著明顯的影響；即使是同一種標記基因，在不同的選擇