基因工程制藥課件

第二章基因工程制藥2.4基因工程菌生長(zhǎng)代謝的特點(diǎn)一、比生長(zhǎng)速率μ(h-1)細(xì)胞生長(zhǎng)速率rX

：?jiǎn)挝粫r(shí)間內(nèi)細(xì)胞濃度的變化（g/L·h）。

X為細(xì)胞濃度，通常用單位體積培養(yǎng)液中所含細(xì)胞（或稱菌體）的干燥質(zhì)量（drycellweight，DCW）表示（g/L,gDCW/L）。培養(yǎng)過程中，細(xì)胞的生長(zhǎng)速率與細(xì)胞濃度成正比。2g/L4g/L10g/L20g/L生長(zhǎng)速率rX

：?jiǎn)挝粫r(shí)間內(nèi)細(xì)胞濃度的變化（g/L·h）

2g/L·h10g/L·h

1h-11h-11h2.5基因工程菌的穩(wěn)定性一、質(zhì)粒的不穩(wěn)定性（1）分裂不穩(wěn)定性工程菌分裂時(shí)出現(xiàn)一定比例不含質(zhì)粒的子代菌。

相關(guān)因素：質(zhì)粒的丟失率（宿主菌、質(zhì)粒特性和培養(yǎng)條件）含質(zhì)粒菌與不含質(zhì)粒菌的生長(zhǎng)速度差異（2）結(jié)構(gòu)不穩(wěn)定

DNA從質(zhì)粒上丟失、質(zhì)粒上序列發(fā)生重排等。二、提高質(zhì)粒穩(wěn)定性的方法1.選擇合適的宿主菌株2.選擇合適的載體低拷貝數(shù)質(zhì)粒丟失的頻率較大含高拷貝數(shù)質(zhì)粒的菌比生長(zhǎng)速度明顯低于不含質(zhì)粒菌。3.加入抗生素二、提高質(zhì)粒穩(wěn)定性的方法4.分階段培養(yǎng)表達(dá)水平越高，重組質(zhì)粒越不穩(wěn)定。

二階段培養(yǎng)：第一階段菌體生長(zhǎng)第二階段誘導(dǎo)表達(dá)5.控制培養(yǎng)條件

高比生長(zhǎng)速率下質(zhì)粒穩(wěn)定性明顯增加。培養(yǎng)基成分、溫度等培養(yǎng)條件對(duì)質(zhì)粒穩(wěn)定性也有影響。6.固定化

固定化適用于分泌表達(dá)的蛋白，對(duì)非分泌表達(dá)蛋白難以大規(guī)模采用。3、連續(xù)培養(yǎng)（continuousculture）培養(yǎng)開始時(shí)為分批培養(yǎng)，培養(yǎng)至一定程度后，連續(xù)不斷的補(bǔ)加新鮮培養(yǎng)基同時(shí)排出等量培養(yǎng)液。一定時(shí)間后，細(xì)胞濃度和培養(yǎng)基中各種物質(zhì)濃度均保持不變。基因工程菌不穩(wěn)定，很難連續(xù)培養(yǎng)。4、透析培養(yǎng)（dialysisculture）

通過透析除去乙酸。

E.coliHB101(pPAKS2)生產(chǎn)青霉素酰化酶提高11倍。二、基因工程菌的培養(yǎng)工藝1、培養(yǎng)基的影響

碳源：葡萄糖、甘油、乳糖、果糖等。氮源、無機(jī)鹽等其他成分。通過單因子實(shí)驗(yàn)、正交設(shè)計(jì)等方法優(yōu)化培養(yǎng)基組成，提高蛋白表達(dá)水平。2、接種量的影響

接種量小，延遲期長(zhǎng)，菌容易老化，不利于蛋白表達(dá)。較大的接種量延遲期短，適于蛋白表達(dá)。接種量一般為5~15％。3、溫度的影響

溫度對(duì)基因表達(dá)的調(diào)控機(jī)理很復(fù)雜，對(duì)不同蛋白，最佳的誘導(dǎo)表達(dá)溫度不同。4、溶氧（dissolvedoxygen，DO）的影響

較高水平的DO（大于10~30％）的有利于蛋白表達(dá)，供氧不足，產(chǎn)生乙酸。加大攪拌、增加氣流、提高氧分壓、提高罐壓?？刂铺窃吹牧骷铀俣?。

恒溶氧發(fā)酵：通過以上手段控制DO在一恒定值。5、pH的影響

流加酸、堿調(diào)節(jié)pH。pH一般控制在6.8~7.6，少數(shù)例外。6、誘導(dǎo)時(shí)機(jī)的影響

一般在對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期進(jìn)行誘導(dǎo)表達(dá)。三、高密度發(fā)酵理論上計(jì)算大腸桿菌發(fā)酵所能達(dá)到的最高菌體密度（干重）為400g/L，一般認(rèn)為最高的發(fā)酵密度（干重）為200g/L。目前培養(yǎng)所達(dá)到的最高密度是175g/L。高密度發(fā)酵的成功關(guān)鍵是補(bǔ)料策略。

乙酸的積累是高密度培養(yǎng)生產(chǎn)重組蛋白質(zhì)的一個(gè)主要問題是。

三、高密度發(fā)酵工藝上對(duì)策：在發(fā)酵工藝上常通過改變培養(yǎng)基組成（以甘油為初始碳源）降低培養(yǎng)溫度限制性流加葡萄糖提高供氧能力（加強(qiáng)攪拌、提高氧分壓、提高罐壓）三、高密度發(fā)酵菌種上對(duì)策：阻斷E.coli乙酸產(chǎn)生：敲除磷酸轉(zhuǎn)乙酰酶基因（pta1）和乙酸激酶（ack）的基因；改變代謝流方法：導(dǎo)入丙酮酸脫羧酶基因pdc1和乙醇脫氫酶adh2，丙酮酸生成乙醇；限制葡萄糖攝取主要途徑（磷酸轉(zhuǎn)移系統(tǒng)），同時(shí)還需加強(qiáng)其他葡萄糖攝取途徑；引入血紅蛋白基因2.7基因工程藥物的分離純化二、建立分離純化工藝需了解的因素1、起始物料的特點(diǎn)菌種類型、蛋白的表達(dá)部位、產(chǎn)物濃度等。2、目的產(chǎn)物特性（各種物理化學(xué)性質(zhì)、穩(wěn)定性）3、雜質(zhì)的種類和性質(zhì)4、產(chǎn)品質(zhì)量的要求

準(zhǔn)許存在的雜質(zhì)種類和最低含量、純度、比活等。三、細(xì)胞破碎物理方法

珠磨、高壓勻漿、超聲波破碎、勻漿、凍融、低滲裂解、研磨等化學(xué)方法有機(jī)溶劑（甲苯、丙酮等）、表面活性劑等。

生物方法酶法：溶菌酶、葡聚糖酶、溶壁酶等；自溶：一定pH和溫度；一般采用加熱法，自溶時(shí)間較長(zhǎng)。

四、固液分離胞外蛋白：離心包含體：離心、低速離心胞內(nèi)蛋白：去除細(xì)胞碎片高速離心、微濾（0.1～10um）、雙水相萃?。≒EG-Dextran、PEG-鹽系統(tǒng)）、絮凝、膨脹床吸附

五、分離純化方法

主要為各種層析方法：離子交換層析、凝膠過濾、疏水層析、親和層析超濾六、非蛋白類雜質(zhì)的去除DNA（離子交換、疏水層析等）熱原（脂多糖，超濾、陰離子交換、疏水層析、多黏菌素B親和層析）病毒（紫外線照射、40nm膜過濾）2.8、包含體的復(fù)性

外源基因在大腸桿菌中高水平表達(dá)時(shí)通常會(huì)形成一種由目的蛋白構(gòu)成的不溶的、無活性的蛋白聚集體即包含體（InclusionBody）

包含體內(nèi)約90%的成分是蛋白質(zhì)，目的蛋白占50％以上。一、包含體表達(dá)的優(yōu)點(diǎn)表達(dá)量高密度高（1.2-1.4g/mL之間），容易分離抗蛋白酶對(duì)宿主毒性小二、包含體蛋白處理過程細(xì)胞破碎包涵體分離包涵體溶解目的產(chǎn)物的復(fù)性變性條件下純化包涵體洗滌三、包含體的復(fù)性方法方法：1.稀釋復(fù)性2.透析復(fù)性3.層析復(fù)性影響復(fù)性的操作參數(shù)：蛋白濃度、溫度、pH、離子強(qiáng)度。提高蛋白復(fù)性率的策略：復(fù)性添加劑如PEG、表面活性劑分子伴侶常用半胱氨酸之間形成二硫鍵方法：1.空氣氧化法在堿性條件下通空氣，氧化時(shí)可以加入二價(jià)銅離子加快反應(yīng)速度，能夠取得更好的效果，缺點(diǎn)是不易控制氧化還原電勢(shì)，而且二硫鍵的氧化形成速度慢；2.氧化還原對(duì)重排體系常用氧化還原對(duì)有氧化型谷胱甘肽/還原型谷胱甘肽和胱氨酸/半胱氨酸，通過調(diào)整氧化還原兩種物質(zhì)的比例可以控制較精確的氧化還原電勢(shì)，對(duì)二硫鍵反應(yīng)進(jìn)行控制，其二硫鍵形成速率快于空氣氧化法。2.9基因工程藥物的質(zhì)量控制

生物材料、培養(yǎng)過程、純化過程、產(chǎn)品的質(zhì)量控制。

目標(biāo)產(chǎn)品的質(zhì)量控制：產(chǎn)品的鑒別、純度、活性、安全性、穩(wěn)定性、一致性。1.生物活性測(cè)定活性、比活2.產(chǎn)品的鑒定（1）相對(duì)分子量

SDS、凝膠過濾，允許10%誤差。

必要時(shí)采用質(zhì)譜準(zhǔn)確測(cè)定。（2）等電點(diǎn)

等電聚焦測(cè)定，等電點(diǎn)常不均一，每批測(cè)定結(jié)果應(yīng)一致。（3）紫外吸收光譜

特征型吸收，每批一致（4）氨基酸序列測(cè)定

送檢中試頭三批產(chǎn)品，N端15個(gè)氨基酸序列，C端1～3個(gè)氨基酸殘基。（5）氨基酸組成分析（6）免疫印跡（westernblot）（7）圓二色光譜（8）肽圖一般用胰蛋白酶或CNBr裂解，再用RP-HPLC或SDS分析（9）二硫鍵分析3.蛋白純度分析

必須采用非還原SDS和HPLC進(jìn)行檢定，其他檢測(cè)方法包括CE（毛細(xì)管電泳）等。4.雜質(zhì)檢測(cè)（1）內(nèi)毒素家兔法、鱟試劑法（2）宿主細(xì)胞蛋白免疫分析（3）宿主細(xì)胞殘余DNA

核酸雜交，100pg/劑量（4）細(xì)菌、酵母、真菌、支原體、病毒微生物學(xué)方法（5）其他物質(zhì)抗生素牛血清采用了抗體親和層析，檢測(cè)小鼠IgG含量。5.穩(wěn)定性檢測(cè)

在不同溫度下保存，定期取樣檢測(cè)生物活性及其他特性的變化。6.一致性

各批次產(chǎn)品均符合標(biāo)準(zhǔn)規(guī)格。產(chǎn)品的保存：液態(tài)保存低溫：-20℃、-80℃和液氮、短期4℃穩(wěn)定的pH

高濃度加保護(hù)劑：糖類、脂類、蛋白類、還原劑（二硫蘇糖醇）等固體保存含水量5%以下，4℃長(zhǎng)期保存冷凍干燥

凍干過程中加保護(hù)劑：低分子化合物（葡萄糖、蔗糖等）、高分子物質(zhì)（糊精、血清）