第三節(jié)冷凍蝕刻樣品制備技術(shù)課件

第三節(jié)冷凍蝕刻樣品制備技術(shù)課件第1頁，共23頁，2023年，2月20日，星期一一、樣品制作的基本原理

冷凍蝕刻復(fù)型法（FreezeEtchingReplica）又叫冷凍復(fù)型法（FreezeReplica），它是研究細(xì)胞膜性結(jié)構(gòu)和核孔形態(tài)結(jié)構(gòu)的專門制樣技術(shù)。它是采用深低溫冷凍方法使新鮮的或預(yù)固定的樣品硬化。這樣可大大降低細(xì)胞內(nèi)部結(jié)構(gòu)特別是膜性結(jié)構(gòu)因化學(xué)試劑作用時(shí)間太長而造成的變化。經(jīng)冷凍的樣品在專門的儀器中，并在特定的溫度下（一般是控制在－１000Ｃ）對(duì)組織進(jìn)行割斷。在此溫度下細(xì)胞斷裂的特點(diǎn)是有膜性結(jié)構(gòu)的細(xì)胞器沿細(xì)胞膜脂質(zhì)雙分子層的疏水區(qū)把膜分成內(nèi)外兩層，在其斷面上有細(xì)胞器和其間已凍結(jié)成玻璃態(tài)的水分。再升溫至－900Ｃ，使玻璃態(tài)的冰升華，充分暴露第2頁，共23頁，2023年，2月20日，星期一

出割斷面上各種細(xì)胞器的膜結(jié)構(gòu)，這一過程稱為蝕刻。然后以不同的角度在經(jīng)過蝕刻的斷面上噴上一層鉑和碳的投影膜，在斷面上形成一層復(fù)型膜；最后取出經(jīng)噴鍍的樣品，把有機(jī)組織腐蝕掉，將復(fù)型膜撈在銅網(wǎng)上，用透射電鏡觀察。在復(fù)型膜上不僅能觀察到細(xì)胞器的各種膜結(jié)構(gòu)，而且還能觀察到細(xì)胞的連接裝置，核膜孔、膜內(nèi)顆粒等。此外，圖像的立體感強(qiáng)、分辨率高（可達(dá)2.5nm），而且復(fù)型膜可長期保存。但用該技術(shù)制作樣品耗費(fèi)高，成功率較低，技術(shù)程序較復(fù)雜，一般不易掌握。

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示核孔示高爾基復(fù)合體和線粒體第4頁，共23頁，2023年，2月20日，星期一二、樣品制作前的準(zhǔn)備工作

1、儀器設(shè)備：冷凍蝕刻儀，封閉式FD-2A型，日本日立公司生產(chǎn)；開放式是用真空噴鍍儀（HUS-5GB型與冷卻割斷裝置HFZ-1日立產(chǎn)）配合組成。

2、試劑：2.5%戊二醛（磷酸緩沖液配制）、0.1mol／L磷酸緩沖液(PH7.2～7.4)；20%、30%的甘油-生理鹽水（pH7.2～7.4）；腐蝕液（次氯酸鈉）、液氮、30％的丙酮水溶液、蒸餾水、光譜純碳棒和黃金絲或鉑絲等。

3、器皿：冰盒、蠟板、雙面刀片、解剖器械、牙簽、滴管、立體解剖鏡、彎頭專用鑷子、牙科鑷子、鋁制的提勺等。第5頁，共23頁，2023年，2月20日，星期一

HFZ—1冷凍割斷裝置的組裝示意圖

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FD---2A冷凍蝕刻儀第7頁，共23頁，2023年，2月20日，星期一

三、樣品制作步驟（以開放式冷凍蝕刻裝置為例）

1、樣品的取材、固定和防凍處理：將實(shí)驗(yàn)動(dòng)物迅速殺死，在1分鐘之內(nèi)取出肝臟等組織，迅速放入預(yù)冷的2.5％的戊二醛內(nèi)，稍固定一段時(shí)間后，在蠟板上滴加少量冷固定液，將組織切成細(xì)條狀，其大小為3×1×1.5mm，再放入2.5％的戊二醛中固定15～20分鐘，組織變硬后再對(duì)組織進(jìn)行修塊，繼續(xù)固定3～5小時(shí)。然后用0.1mol/L的磷酸緩沖液（PH7.2～7.4）清洗樣品0.5～1小時(shí)，之后將樣品放入25％和30％的甘油——生理鹽水混合液中各處理4～6小時(shí)。

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2、碳棒與鉑珠的制備和組裝：（1）、碳棒的預(yù)處理：取長約5～6cm，直徑3mm的光譜純碳棒4段（A、B、C、D），將A、B兩段碳棒的一端磨成15度的斜角，C、D兩段碳棒的一頭磨成直徑為1mm，長度約為5mm。（2）、纏繞鉑絲：取直徑0.1mm的鉑絲8～12cm，纏繞到D碳棒磨細(xì)的一端的中間區(qū)。鉑絲在碳棒上一定纏繞緊密，否則會(huì)在碳棒上燒成散在的小鉑珠（見下圖）。

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碳棒的安裝及其鉑珠的燒結(jié)示意圖第10頁，共23頁，2023年，2月20日，星期一

（3）、碳棒的組裝：先將HFZ－1型冷凍割斷裝置裝好（如圖）放入HUS－5GB真空噴鍍儀的鐘罩內(nèi)的塑料底盤上，將“A”碳棒固定在鐘罩內(nèi)的一個(gè)固定電極上，碳棒的150斜面對(duì)準(zhǔn)割斷裝置的一個(gè)孔道；“C”碳棒固定在對(duì)應(yīng)的可動(dòng)電極上，使其細(xì)端頂在A碳棒斜面的中間，這就是一對(duì)碳電極。然后，將“B”碳棒固定到另一個(gè)固定電極上，使150的斜面對(duì)準(zhǔn)另一個(gè)孔道，“D”碳棒固定到“B”碳棒對(duì)應(yīng)的活動(dòng)電極上，使其細(xì)端對(duì)在“B”碳棒斜面的中間，這是鉑電極。碳電極的噴發(fā)點(diǎn)與樣品表面呈900角，鉑電極的噴發(fā)點(diǎn)與樣品表面呈450角，兩個(gè)電極噴發(fā)點(diǎn)離樣品表面為10～11cm。第11頁，共23頁，2023年，2月20日，星期一HUS---5GB真空噴鍍儀第12頁，共23頁，2023年，2月20日，星期一

（4）、噴發(fā)點(diǎn)的調(diào)整：將兩組電極安裝好后，必須用三點(diǎn)一線的方法再細(xì)心校正，使噴發(fā)點(diǎn)分別對(duì)準(zhǔn)兩隔熱板孔和噴碳與噴鉑孔道的正中央。否則鉑和碳可能噴不到樣品的表面上。最后將碳棒可動(dòng)側(cè)的彈簧調(diào)節(jié)好，使得彈力大小要適當(dāng)。如果太松加熱后可能短路，碳棒尖端會(huì)離開斜面；太緊對(duì)應(yīng)面碳棒的尖端會(huì)滑落而不能進(jìn)行噴鍍

。校準(zhǔn)完畢將割斷裝置移出噴鍍儀的鐘罩。（5）、燒制鉑珠：為了提高噴鍍效果，要在噴鍍前將碳棒上纏繞的鉑絲在低真空（10－2～10－3讬）狀態(tài)下溶化呈珠狀。鉑珠在碳棒磨細(xì)端的尖端，并將鉑珠對(duì)準(zhǔn)孔道，控制好真空度和加熱電流是鉑珠燒制的關(guān)鍵。

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HFZ—1冷凍割斷裝置的組裝示意圖

第14頁，共23頁，2023年，2月20日，星期一3、冷凍蝕刻復(fù)型裝置的準(zhǔn)備：在樣品處理到冷凍開始之前，先將真空噴鍍儀通電預(yù)抽真空。為保證割斷裝置的良好性能，每次使用之前必須認(rèn)真進(jìn)行擦拭，以除去水分、油污和氧化層，必要時(shí)可用拋光膏和丙酮進(jìn)行表面清洗。認(rèn)真接好FE－1加溫控制器的線路并進(jìn)行復(fù)查。將保溫瓶裝滿冰水保持在00C。

4、安裝樣品：在冷凍開始前應(yīng)將樣品裝入樣品杯內(nèi)，并加入少量的30％的甘油——生理鹽水。樣品應(yīng)高出孔的表面1mm，樣品杯內(nèi)應(yīng)充滿，不能有空隙。第15頁，共23頁，2023年，2月20日，星期一

5、安裝割斷刀和加熱器：將專用的刀片安裝到刀座上，刀刃要凹進(jìn)滑面0.1mm，擰緊螺絲。將加熱器固定在樣品座底部，擰緊螺絲。

6、冷凍樣品和割斷裝置：樣品安裝完并組裝好割斷裝置，將割斷裝置放入盛有液氮的廣口保溫瓶?jī)?nèi)，并使割斷裝置被液氮浸沒，待液氮停止沸騰，將有樣品的樣品杯放入液氮內(nèi)冷凍，待液氮停止沸騰，從液氮中取出割斷裝置，快速把樣品杯準(zhǔn)確的放入樣品座的杯槽內(nèi)，再用安裝棒將刀座推向樣品座，使二者的斜面吻合。第16頁，共23頁，2023年，2月20日，星期一

然后用運(yùn)輸提籃將安裝好的割斷裝置放入液氮中冷凍至液氮停止沸騰，立刻用運(yùn)載籃將割斷裝置移到HUS——5GB的真空罩內(nèi)的塑料底座上，將支架塊拉線掛在擋板的手柄上，接上溫度控制器插頭，蓋好真空玻璃罩開始抽真空，同時(shí)向真空噴鍍儀的冷阱內(nèi)加滿液氮。第17頁，共23頁，2023年，2月20日，星期一

7、樣品的斷裂和蝕刻：當(dāng)真空度達(dá)到1×10－5讬以上，樣品的溫度升至－1000～－1100C之間時(shí)是樣品斷裂的最佳時(shí)機(jī)，這是猛拉擋板手柄，刀座順勢(shì)沿斜面滑下并將樣品割斷。在樣品被割斷后升高溫度至－1000～－900C時(shí)，在此溫度下蝕刻15～19秒，蝕刻的速度為2nm／秒，蝕刻的深度約為300～400nm。

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8、在樣品表面噴鍍碳和鉑制作樣品斷面的復(fù)型：當(dāng)蝕刻的時(shí)間到，先對(duì)鉑電極通電使之加熱，以與樣品成450角向樣品表面噴鍍鉑。當(dāng)加上電流后開始碳棒尖端變紅，隨電流的增大在2～3秒內(nèi)鉑珠熔化、氣化，當(dāng)剛出現(xiàn)碳火花時(shí)即可停止通電。然后再使碳電極通電，以900角向樣品表面噴鍍碳來加固復(fù)型膜。噴碳采用間斷噴鍍法，每次噴碳時(shí)間約1秒，沒隔3～4秒噴一次，共噴4～5次。第19頁，共23頁，2023年，2月20日，星期一

樣品被割斷、蝕刻和噴鍍過程示意圖

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9、復(fù)型膜的分離與清洗：噴鍍結(jié)束后，把真空罩內(nèi)恢復(fù)大氣壓，取出樣品杯放入盛有蒸餾水的白色坩堝內(nèi)，用針尖輕輕將杯中的樣品挑于水中。然后用吸管將樣品吸到另一個(gè)坩堝內(nèi)，向樣品上滴加少量70％的次氯酸鈉水溶液，約0.5小時(shí)后復(fù)型膜逐漸與樣品分離，漂在液體的表面上，用吸管將復(fù)型膜吸入蒸餾水中，反復(fù)洗兩次。

10、撈復(fù)型膜和透射電鏡觀察：預(yù)先將400目的銅網(wǎng)浸泡在丙酮內(nèi)，將洗凈的復(fù)型膜用吸管移入30％的丙酮水溶液內(nèi)，復(fù)型膜立即展平并漂在液體表面，再用吸管將復(fù)型膜移入蒸餾水中，然后用400目銅網(wǎng)撈取，用濾紙吸去多余的水分后，即可到透射電鏡下觀察分析。

第21頁，共23頁，2023年，2月20日，星期一四、冷凍蝕刻復(fù)型圖像的辨認(rèn)

冷凍蝕刻復(fù)型法制作的樣品，主要是在透射電鏡下分析研究細(xì)胞器的膜性結(jié)構(gòu)。這種方法可把細(xì)胞質(zhì)膜沿脂質(zhì)雙分子層疏水區(qū)斷成兩層，形成兩個(gè)互補(bǔ)的半膜及四個(gè)面。

根據(jù)Branton的命名法，連接細(xì)胞外空間的或細(xì)胞內(nèi)空間（如核周間隙、線粒體內(nèi)外膜之間的間隙、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)及各種泡狀結(jié)構(gòu)的腔隙）的半膜叫“外半膜”或E半膜（Extracellularhalf）；而連接細(xì)胞質(zhì)、核質(zhì)及線粒體或葉綠體基質(zhì)的半膜叫做胞質(zhì)半膜或P半膜（Protoplasmichalf）。第22頁，共23頁，2023年，2月20日，星期一

四個(gè)面包括：細(xì)胞質(zhì)膜原有的兩個(gè)表面（親水面）和劈裂后新形成的兩