國產(chǎn)胎盤間充質(zhì)干細(xì)胞制劑溶血性探討,細(xì)胞生物學(xué)論文

國產(chǎn)胎盤間充質(zhì)干細(xì)胞制劑溶血性探討,細(xì)胞生物學(xué)論文間充質(zhì)干細(xì)胞〔mesenchymalstemcells,MSCs〕來源于發(fā)育早期的中胚層和外胚層，屬于多能干細(xì)胞，不僅有較強(qiáng)的增殖潛能，還能分化成不同來源的細(xì)胞，如神經(jīng)細(xì)胞、脂肪細(xì)胞、成骨細(xì)胞、軟骨細(xì)胞、肝細(xì)胞及胰島樣細(xì)胞等，可作為理想的種子細(xì)胞，用于衰老和病變引起的組織器官的損傷修復(fù)。臨床上間充質(zhì)干細(xì)胞在治療多種血液系統(tǒng)疾病、肝硬化、神經(jīng)系統(tǒng)疾病和本身免疫性疾病等方面具有廣泛的應(yīng)用前景。國外已有多種間充質(zhì)干細(xì)胞產(chǎn)品獲批上市[1~2].最最近幾年來我們國家已經(jīng)加大了對干細(xì)胞研究支持力度。本實驗評價國產(chǎn)胎盤間充質(zhì)干細(xì)胞制劑能否可引起溶血和紅細(xì)胞聚集，以便為其在臨床上應(yīng)用提供一定的科學(xué)根據(jù)。材料與方式方法1材料間充質(zhì)干細(xì)胞人胎盤間充質(zhì)干細(xì)胞，胎盤來源于自愿捐獻(xiàn)者。經(jīng)產(chǎn)婦及其家人簽署知情同意書。動物日本大耳白兔，雄性，1只，普通級，體重2.54kg,購自北京隆安實驗動物養(yǎng)殖中心。動物使用許可證號：SYXK〔津〕2018-0005.試劑胎盤間充質(zhì)干細(xì)胞制劑順昊細(xì)胞生物技術(shù)有限公司制備。RPMI-1640培養(yǎng)基、DMEM-F-12培養(yǎng)基，均為美國Hyclone公司生產(chǎn)；10%胎牛血清，蘭州百靈生物科技有限公司生產(chǎn)；淋巴細(xì)胞分離液，天津市灝洋生物制品科技有限公司生產(chǎn)。儀器Facsealibur流式細(xì)胞儀，美國BD公司產(chǎn)品；5424離心機(jī)，德國Eppendorf公司產(chǎn)品；Ckx22顯微鏡，日本Olympus有限公司產(chǎn)品；Lxj-IIb低速臺式離心機(jī)，上海安亭科學(xué)儀器有限公司產(chǎn)品；VarioskanFlash酶標(biāo)儀，美國Thermo公司產(chǎn)品。2間充質(zhì)干細(xì)胞的分離提取和擴(kuò)增提取分離：無菌獲取胎盤，立即浸入含RPMI-1640培養(yǎng)基、10%胎牛血清及1%青-鏈霉素的組織保衛(wèi)液中，分離提取。剪取胎盤絨毛膜面1~2cm厚的組織，剪成1mm1mm1mm的碎塊，用PBS漂洗至無色，用膠原酶37℃水平搖床震蕩3h,懸液用100m細(xì)胞篩過濾，上清以2000rmin-1離心10min,棄上清，所得沉淀即為間充質(zhì)干細(xì)胞。擴(kuò)增：在沉淀細(xì)胞中，參加適量培養(yǎng)液混勻，轉(zhuǎn)入T-75培養(yǎng)瓶中，以37℃、5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。細(xì)胞生長至80%時，進(jìn)行胰酶消化傳代。傳代時，以0.25%胰蛋白酶-EDTA消化3~4min,加血清終止消化；以1500rmin-1離心5min,棄消化液，參加細(xì)胞培養(yǎng)液，吹打混勻，收集細(xì)胞懸液，接種于細(xì)胞培養(yǎng)瓶，置于37℃、5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。3間充質(zhì)干細(xì)胞樣品的制備將間充質(zhì)干細(xì)胞重懸于含有1%人血白蛋白的復(fù)方電解質(zhì)注射液中，制備濃度為5.0105cellsmL-1.將含有1%人血白蛋白的復(fù)方電解質(zhì)溶液作為空白對照。陰性對照為0.9%氯化鈉注射液。陽性對照為去離子水。4溶血實驗操作[3]家兔麻醉后，經(jīng)心臟取血10mL,用玻璃珠除去纖維蛋白，用0.9%氯化鈉注射液反復(fù)清洗紅細(xì)胞3次，至上清呈無色透明，棄上清，用0.9%氯化鈉注射液稀釋成2%的紅血球混懸液。取試管24支，均分為2組并進(jìn)行編號，華而不實每組1~5管為間充質(zhì)干細(xì)胞制劑管，第6~10管為空白對照管，第11管為陰性對照管，第12管陽性對照管。第2組試管為第1組試管的復(fù)管。參照表1進(jìn)行加樣。用直接觀察和酶標(biāo)儀比色結(jié)合的方式方法，進(jìn)行溶血實驗。直接觀察各管在15,30,45min和1,2,3h能否出現(xiàn)溶血和紅細(xì)胞凝聚現(xiàn)象。酶標(biāo)儀測定結(jié)果以光密度〔A〕表示，并計算各實驗管溶血率。假如受試藥試管中溶液的溶血率小于5%,則表示無溶血。結(jié)果1直接觀察1.1第1組試管陰性對照管〔11號〕:加樣后15~45min,管中液體呈鮮紅色渾濁；加樣后1h,少量上清液無色澄明，下層液體呈鮮紅色渾濁，少量紅細(xì)胞沉于管底；加樣后2h,管底部逐步出現(xiàn)深紅色沉淀，頂部上清液無色澄清且逐步增加。孵育3h,自培養(yǎng)箱取出試管，振搖后，見管底沉淀均勻分散，無紅細(xì)胞凝聚發(fā)生。以2000rmin-1離心后，見試管底部有少量沉淀，上清液呈無色澄清。直接觀察所見，陰性對照管未發(fā)生溶血，見表1.陽性對照管〔12號〕:自加樣15min至3h,管中液體呈澄明鮮紅色，除管底部逐步出現(xiàn)少量沉淀外，無其他明顯變化。孵育3h,振搖，見管底沉淀均勻分散，無紅細(xì)胞凝聚發(fā)生。離心后，見試管底部有少量沉淀，上清液呈澄明鮮紅色。直接觀察所見，陽性對照管發(fā)生了溶血，見表1.間充質(zhì)干細(xì)胞制劑管〔1~5號〕和空白對照管〔6~10號〕的變化，與陰性對照組變化一樣，即直接觀察所見，均未發(fā)生溶血，見表1.1.2第2組試管〔復(fù)管〕用肉眼對各管與第1組試管的直接觀察發(fā)現(xiàn)，結(jié)果完全一致。2經(jīng)酶標(biāo)儀測得結(jié)果測定結(jié)果見圖1.由圖1可見，間充質(zhì)干細(xì)胞制劑及間充質(zhì)干細(xì)胞制劑空白對照各管的溶血率均低于5%.討論間充質(zhì)干細(xì)胞具有多向分化潛能，能支持造血和促進(jìn)造血干細(xì)胞植入，具有調(diào)節(jié)免疫等特點(diǎn)。臨床上主要用于治療機(jī)體無法自然修復(fù)的組織細(xì)胞和器官損傷等多種難治性疾病，并且作為免疫調(diào)節(jié)細(xì)胞，治療免疫排擠和本身免疫性疾病[4-5].與骨髓、外周血、脂肪及胚胎等來源的間充質(zhì)干細(xì)胞相比，胎盤間充質(zhì)干細(xì)胞具有來源廣泛、取材方便、病原微生物感染率和免疫排擠發(fā)生率較低、無致瘤性以及不牽涉?zhèn)惱硐拗茊栴}等特點(diǎn)。與捐獻(xiàn)骨髓或采集發(fā)動外周血相比，供者無痛苦，感染時機(jī)少，擴(kuò)增能力強(qiáng)，具有更大的應(yīng)用潛能[6-7].本實驗結(jié)果表示清楚，胎盤間充質(zhì)干細(xì)胞制劑體外無溶血和致紅細(xì)胞聚集作用，提示胎盤間充質(zhì)干細(xì)胞制劑在臨床應(yīng)用時產(chǎn)生溶血和致紅細(xì)胞聚集的可能性很小。以下為以下為參考文獻(xiàn)：[1]丁志，楊松林.間充質(zhì)干細(xì)胞生物學(xué)特性及其分化潛能[J].中國組織工程研究與臨床康復(fù)，2018,15:147-150.[2]李麗春，何治，李劍平.胎盤間充質(zhì)干細(xì)胞的體外誘導(dǎo)分化[J].中國組織工程研究，2020,6:1116-1121.[3]國家食品藥品監(jiān)督管理總局指導(dǎo)原則課題研究組.藥物刺激性、過敏性和溶血性研究技術(shù)指導(dǎo)原則[EB/OL].[4]朱金海，陳燕凌.骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞分離培養(yǎng)及在移植肝中定居能力的研究[J].福建醫(yī)科大學(xué)學(xué)報，2018,44:45-48.[5]李麗春，李劍平.基因轉(zhuǎn)染間充質(zhì)干細(xì)胞的臨床治療：特點(diǎn)與問題[J].中國組織工程研究，2020,18:2257-2262.[6]