土壤微生物生物量的測定（滴定法）

本文格式為Word版，下載可任意編輯——土壤微生物生物量的測定（滴定法）1.土壤微生物生物量的測定(滴定法)

一、試驗?zāi)康暮蛢?nèi)容

土壤微生物生物量是指土壤中體積小于5～10μm3活的微生物總量，是土壤有機(jī)質(zhì)中最活躍的和最易變化的部分。耕地表層土壤中，土壤微生物量碳（Bc）一般占土壤有機(jī)碳總量的3％左右，其變化可直接或間接地反映土壤耕作制度和微生物肥力的變化，并可以反映土壤污染的程度。近30年來，國外大量學(xué)者對土壤微生物生物量的測定方法進(jìn)行了比較系統(tǒng)的研究，但由于土壤微生物的多樣性和繁雜性，還沒有發(fā)現(xiàn)一種簡單、快速、確鑿、適應(yīng)性廣的方法。目前廣泛應(yīng)用的方法包括：氯仿熏蒸培養(yǎng)法（FI）、氯仿熏蒸浸提法（FE）、基質(zhì)誘導(dǎo)呼吸法（SIR）、精氨酸誘導(dǎo)氨化法和三磷酸腺苷（ATP）法。

氯仿熏蒸浸提法（FE）的原理是：土壤經(jīng)氯仿熏蒸處理，微生物被殺死，細(xì)胞破碎后，細(xì)胞內(nèi)容物釋放到土壤中，導(dǎo)致土壤中的可提取碳、氨基酸、氮、磷和硫等大幅度增加。通過測定浸提液中全碳的含量可以計算土壤微生物生物量碳。二、試驗材料和用具

儀器：培養(yǎng)箱；真空枯燥器；真空泵；往復(fù)式振蕩機(jī)（速率200次每min）；1L廣口玻璃瓶；定量濾紙；紫外分光光度計；LNK-872型消煮爐（XX省宜興市科教儀器研究所）試劑：

1.無乙醇氯仿：市售的氯仿都含有乙醇（作為穩(wěn)定劑），使用前必需除去乙醇。方法

為：量取500ml氯仿于1000ml分液漏斗中，參與50ml硫酸溶液[ρ(H2SO4)=5%]，充分搖勻，棄除下層硫酸溶液，如此進(jìn)行3次。再參與50ml去離子水，同上搖勻，棄去上部的水分，如此進(jìn)行5次。將下層的氯仿轉(zhuǎn)移存放在棕色瓶中，并參與約20g無水K2CO3，在冰箱的冷藏室中保存?zhèn)溆谩?/p>

2.硫酸鉀溶液[c(K2SO4)=0.5mol·L-1]稱取硫酸鉀（K2SO4，化學(xué)純）87.10g，先溶于

300ml去離子水中，加熱，轉(zhuǎn)移溶液至容器中，再加少量去離子水溶解余下的部分，轉(zhuǎn)移溶液至同一容器中，如此反復(fù)屢屢。最終定容至1L；

3.重鉻酸鉀[c(1/6K2Cr2O7)=0.4000mol·L-1]：稱取經(jīng)130℃烘干2～3h的重鉻酸鉀

（K2Cr2O7，分析純）19.622g，溶于1000ml去離子水中；

4.鄰啡羅啉亞鐵指示劑：稱取鄰啡羅啉（C12H8N2H2O，分析純）1.49g，溶于含有

0.70gFeSO4·7H2O的100ml去離子水中，密閉保存于棕色瓶中；5.硫酸亞鐵溶液[c（FeSO4·7H2O）＝0.0667mol·L-1]：稱取硫酸亞鐵（FeSO4·7H2O，

化學(xué)純）18.52g，溶解于600ml～800ml去離子水中，加濃硫酸（化學(xué)純）15ml，攪拌均勻，定容至1000ml，于棕色瓶中保存。此溶液不穩(wěn)定，需標(biāo)定其濃度。6.硫酸亞鐵溶液濃度的標(biāo)定：吸取重鉻酸鉀標(biāo)準(zhǔn)溶液（試劑3）10.00ml放入100ml

三角瓶中，加水約20ml，加濃硫酸3～5ml和鄰啡羅啉指示劑2～3滴，用FeSO4溶液滴定，根據(jù)FeSO4溶液的消耗量即可計算FeSO4溶液的確鑿濃度。

三、操作步驟

1．采樣與樣品預(yù)處理

土壤樣品的采集方法和要求與測定其它土壤性質(zhì)時沒有本質(zhì)區(qū)別。采集到的新鮮土壤樣品馬上去除植物殘體、根系和可見的土壤動物（如蚯蚓）等，然后盡快過篩（2～3mm），或放在低溫下（2～4℃）保存。假使土壤太濕無法過篩，進(jìn)行晾干時必需經(jīng)常翻動土壤，避免局部風(fēng)干導(dǎo)致微生物死亡。過篩的土壤樣品調(diào)理到40％左右的田間持水量，在室溫下放在密閉的裝置中預(yù)培養(yǎng)1周，密閉容器中要放入兩個適中的燒杯，分別參與水和稀NaOH溶液，以保持其濕度和吸收釋放的CO2。預(yù)培養(yǎng)后的土壤最終馬上分析，也可放在低溫下（2～4℃）保存。

2．熏蒸

確鑿稱取相當(dāng)于25.0g烘干土重的潮濕土壤3份，分別放在約100ml的玻璃瓶中，一起放入同一枯燥器中，枯燥器底部放置幾張用水潮濕的濾紙，用少量真空膠密封枯燥器，在專用三角瓶里裝入約50ml無乙醇氯仿，把枯燥器，裝有無乙醇氯仿的三角瓶和真空泵裝置連接好，使三通管連通枯燥器和真空泵而不連通接氯仿瓶的閥門，開啟電源開關(guān)，抽氣至真空后，使三連通管連通上已裝有約50ml無水乙醇氯仿的三角瓶，時間持續(xù)約2～3秒，至氯仿沸騰，馬上關(guān)閉接抽氣機(jī)的三通管（注意！），接著關(guān)閉真空泵電源。使氯仿不能回流到真空泵而損壞真空泵。然后在裝氯仿的三角瓶下面接一盆熱水（70℃），直到有氯仿液滴滴入枯燥器，證明氯仿飽和，關(guān)閉枯燥器的閥門，開啟放氣閥，氯仿倒回瓶中可重復(fù)使用。然后從真空表處拔出連接枯燥器的軟管，枯燥器連同軟管在25℃的黑暗條件下放置24～48h。防備開啟閥門，假使沒有空氣滾動的聲音，表示枯燥器漏氣，應(yīng)重新稱樣進(jìn)行熏蒸處理。當(dāng)枯燥器不漏氣時，在通風(fēng)處開啟，取出土樣，讓氯仿?lián)]發(fā)約30min，擦盡枯燥器底部，直到土壤聞不到氯仿氣味為止。同時稱同樣量的土壤3份（也可在浸提前再稱樣），不進(jìn)行熏蒸處理，作為對照。3．浸提

熏蒸終止后，熏蒸處理過的土壤樣品和未進(jìn)行熏蒸處理的對照土壤樣品轉(zhuǎn)移到250ml塑料瓶中，參與100ml硫酸鉀溶液（試劑2）（硫酸鉀溶液：土重＝4：1），在振蕩機(jī)上振蕩浸提30min（25℃），用定量濾紙過濾。同時做不加土壤的空白對照。4．微生物生物量碳的測定（滴定法）

確鑿吸取浸提液5.0ml放入消煮管中，參與重鉻酸鉀標(biāo)準(zhǔn)溶液（試劑3）2.00ml，濃硫酸5ml，搖動試管，充分混勻，在試管上放一小漏斗，以冷凝蒸出的水氣。將試管放入溫度為175℃左右的石蠟油浴鍋，注意調(diào)理使油浴鍋溫度維持在170－180℃，從試管內(nèi)容物開始沸騰（有較大氣泡）算起，確鑿煮沸10min，取出試管，稍冷卻，拭凈試管外部油滴。

將試管內(nèi)容物傾入150ml三角瓶中，用蒸餾水少量屢屢洗凈試管和漏斗，溶液亦并入三角瓶中。加水稀釋至60－70ml，維持溶液酸度2－3mol（1/2H2SO4）L-1，參與2－3滴鄰啡羅啉亞鐵指示劑，然后用標(biāo)準(zhǔn)硫酸鹽鐵溶液滴定，溶液由橙色經(jīng)過綠色，最終突變?yōu)榇u紅色，即為終點。四、結(jié)果計算

（一）微生物生物量碳的計算1．有機(jī)碳（Oc）的計算

ω(C)＝(V0-V1)×c×3×ts×1000/m

式中：ω(C)——有機(jī)碳（Oc）質(zhì)量分?jǐn)?shù)，mg·kg-1；V0——滴定空白樣時所消耗的FeSO4體積，ml；V1——滴定樣品時所消耗的FeSO4體積，ml；c——FeSO4溶液的濃度，mol·L-1

3——碳（1/4C）的毫摩爾質(zhì)量，M（1/4C）=3mg/mmol；ts——稀釋倍數(shù)；100ml/5ml＝20m——為烘干土質(zhì)量，g。2．微生物生物量碳的計算ω(C)=Ec/KEc