沙門菌的檢驗技術(shù)集大

沙門菌的檢驗技術(shù)集大第1頁/共44頁國內(nèi)外沙門菌檢測方法（傳統(tǒng)方法）

國家標(biāo)準(zhǔn)(GB4789.4-2010:食品微生物學(xué)檢驗沙門氏菌檢驗)行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)（SN0170-1992出口食品沙門氏菌屬(包括亞利桑那菌)檢驗方法）FDA（Food&DrugAdministration）

AOAC(AssociationofOfficialAnalyticalChemists)

FSIS（FOODSAFETYANDINSPECTIONSERVICE）

ISO加拿大官方食品微生物分析方法

第2頁/共44頁標(biāo)本采集增菌培養(yǎng)腸道選擇性培養(yǎng)基分離培養(yǎng)革蘭染色生化反應(yīng)取可疑菌落血清學(xué)鑒定食品中沙門氏菌檢測的基本程序第3頁/共44頁沙門菌常用生化試驗三糖鐵（TSI）尿素酶試驗陰性（黃）陽性（紅）第4頁/共44頁沙門菌常用生化試驗吲哚試驗陰性（液面黃）陽性（液面紅）

VP試驗陽性（紅色）陰性（不變）第5頁/共44頁沙門菌常用生化試驗賴氨酸脫羧酶試驗對照陽性（紫）陰性（黃）丙二酸鹽試驗陽性（蘭）陰性（不變）第6頁/共44頁ONPG試驗陽性（黃）空白沙門菌常用生化試驗第7頁/共44頁凍肉、蛋品、乳品及其他加工食品鮮肉、鮮蛋、鮮乳或其他未經(jīng)加工的食品前增菌法25g＋BPW225mL36℃±1℃一般4h，干蛋品18h～24h10mL＋MM（或TTB）100mL10mL＋SC100mL直接增菌法25g＋滅菌生理鹽水25mL檢樣勻液25mL＋MM（或TTB）100mL檢樣勻液25mL

＋SC100mLBSDHL（或HE、WS、SS）TSI（排除A/AH2S－結(jié)果），靛基質(zhì)，尿素，KCN，賴氨酸沙門氏菌血清學(xué)試驗甘露醇山梨醇H2S＋靛＋尿－KCN－賴＋H2S－靛－尿－KCN－賴＋/－非如左述的各種反應(yīng)結(jié)果沙門氏菌血清學(xué)試驗ONPG－沙門氏菌非沙門氏菌42℃18h～24h36℃±1℃18h～24h42℃18h～24h36℃±1℃18h～24h36℃±1℃40h～48h36℃±1℃18h～24h

微生物學(xué)檢驗沙門氏菌檢驗中華人民共和國國家標(biāo)準(zhǔn)GB/T4789.4-2010第8頁/共44頁前增菌：使食品加工過程中受傷的沙門菌細胞恢復(fù)活力未經(jīng)加工過的食品，檢驗前不需要前增菌前增菌：25克（加工食品）+225毫升緩沖蛋白胨水

37度培養(yǎng)4小時（干蛋品18—24小時）。（一）前增菌第9頁/共44頁選擇性增菌含選擇性抑制劑1：1稀釋液而不是1：10，提高檢出率增菌：移取10毫升接種于100mL的增菌液中。氯化鎂孔雀綠（MM）或四硫酸鈉煌綠（TTB）、亞硒酸鹽胱氨酸（SC）。一種增菌劑不可能適合所有的沙門菌，所以，要同時使用兩種以上的培養(yǎng)基增菌第10頁/共44頁（二）分離培養(yǎng)最適生長溫度為35～37℃，最適pH值為6.8～7.8。選擇性瓊脂平板：BS培養(yǎng)基（亞硫酸鉍瓊脂）、DHL瓊脂、HE（?？祟D腸內(nèi)瓊脂培養(yǎng)基）或WS瓊脂、SS瓊脂。BS最適合，但為提高檢出率，需要使用一個BS培養(yǎng)基，同時再用另一個DHL、HE、SS或WS第11頁/共44頁選擇瓊脂平板沙門氏菌Ⅰ、Ⅱ、Ⅳ、Ⅴ、Ⅵ沙門氏菌Ⅲ（即亞利桑那菌）亞硫酸瓊脂(BS瓊脂)產(chǎn)硫化氫菌落為黑色有金屬光澤、棕褐色或灰色，菌落周圍培養(yǎng)基可呈黑色或棕色；有些菌株不產(chǎn)生硫化氫，形成灰綠色的菌落，周圍培養(yǎng)基不變。黑色有金屬光澤DHL瓊脂無色半透明，產(chǎn)硫化氫菌落中心帶黑色或幾乎全黑色。乳糖遲緩陽性或陰性的菌株與沙門氏菌Ⅰ、Ⅱ、Ⅳ、Ⅴ、Ⅵ相同；乳糖陽性的菌株為粉紅色，中心帶黑色。HE瓊脂WS瓊脂藍綠色或藍色，多數(shù)菌株產(chǎn)硫化氫，菌落中心黑色或幾乎全黑色。乳糖陽性的菌株為黃色，中心黑色或幾乎全黑色；乳糖遲緩陽性或陰性的菌株為藍綠色或藍色，中心黑色或幾乎全黑色。SS瓊脂

無色半透明，產(chǎn)硫化氫菌株有的菌落中心帶黑色，但不如以上培養(yǎng)基明顯.乳糖遲緩陽性或陰性的菌株，與沙門氏菌Ⅰ、Ⅱ、Ⅳ、Ⅴ、Ⅵ相同；乳糖陽性的菌株為粉紅色，中心黑色，但中心無黑色形成時與大腸艾希氏菌不能區(qū)分.第12頁/共44頁SS平板分離腸道致病菌的強選擇培養(yǎng)基SS平板組成基礎(chǔ)培養(yǎng)基＋乳糖＋抑制劑(膽鹽、枸櫞酸鈉、0.1%煌綠水溶液)＋指示劑(中性紅)SS平板上腸道細菌的生長現(xiàn)象腸道致病菌：不分解乳糖，菌落無色或淡黃色腸道非致病菌：分解乳糖產(chǎn)酸，菌落呈紅色腸道菌選擇性培養(yǎng)基分離培養(yǎng)第13頁/共44頁分離培養(yǎng)取增菌液劃線接種于SS瓊脂平板，于37℃培養(yǎng)18～24h，觀察菌落特征腸道致病菌在SS平板上的菌落特征沙門氏菌形成不發(fā)酵乳糖菌落無色透明，光滑濕潤、邊緣整齊菌落第14頁/共44頁發(fā)酵乳糖菌落(大腸桿菌菌落）不發(fā)酵乳糖菌落（腸道致病菌菌落）SS培養(yǎng)基平板分離第15頁/共44頁革蘭染色沙門氏菌：革蘭陰性桿菌

第16頁/共44頁（三）五項生化試驗1、三糖鐵瓊脂試驗2、靛基質(zhì)試驗（吲哚試驗）3、尿素酶試驗4、氰化鉀試驗（KCN）5、賴氨酸脫羧酶試驗第17頁/共44頁1、三糖鐵瓊脂(TSI)成分

蛋白胨20.0g

牛肉膏3.0g

乳糖

10.0g

蔗糖

10.0g

葡萄糖

1.0g

硫酸亞鐵銨(含6個結(jié)晶水)0.5g

酚紅

0.025g或5g/L溶液5mL

氯化鈉5.0g

硫代硫酸鈉0.5g

瓊脂12.0g

蒸餾水1000.0mL

第18頁/共44頁TSI生化原理

斜面部分暴露于空氣中，為有氧環(huán)境。而下部與空氣隔絕是相對厭氧的環(huán)境。因此TSI時，最重要的是斜面部分和管下部瓊脂的長度，兩者均為3cm，以保證兩部分相對應(yīng)的有氧或厭氧環(huán)境。第19頁/共44頁測試時使用接種針先穿刺至底部，而后于斜面作劃線接種，經(jīng)培養(yǎng)18-24小時后，依情況判斷糖類發(fā)酵情形。第20頁/共44頁觀察結(jié)果：有三種類型

A.非發(fā)酵型：無碳氫化合物發(fā)酵，所以無酸產(chǎn)生，斜面上瓊脂的肽降解產(chǎn)物是堿性物質(zhì)導(dǎo)致斜面變紅。這種類型的細菌稱為非發(fā)酵型。

第21頁/共44頁B.非乳糖發(fā)酵型:如果接種的是發(fā)酵葡萄糖不發(fā)酵乳糖的細菌，培養(yǎng)基內(nèi)僅有0.1%葡萄糖可以產(chǎn)酸。開始階段，培養(yǎng)8-12h時，產(chǎn)生的酸足以引起斜面和底部顏色變成黃色。在接下來的時間里，葡萄糖被完全消耗，斜面部分的細菌在有氧條件下開始氧化降解氨基酸，產(chǎn)生的胺類很快就中和斜面上存在的酸；到18-24h，整個斜面又轉(zhuǎn)換成堿性PH，顏色有變成紅色。深部（厭氧區(qū)域），氨基酸降解不足以中和形成的酸，培養(yǎng)基仍為黃色。

第22頁/共44頁C.乳糖（蔗糖）發(fā)酵型

第23頁/共44頁三糖鐵（TSI）試驗?zāi)c道桿菌科為革蘭氏陰性菌，可發(fā)酵葡萄糖產(chǎn)酸。利用糖類發(fā)酵之不同與硫化氫產(chǎn)生與否，加以區(qū)分。三糖鐵瓊脂斜面培養(yǎng)基含有1﹪乳糖及蔗糖與0.1﹪葡萄糖作為發(fā)酵基質(zhì)，且以酚紅作為酸堿指示劑，如培養(yǎng)基由橘紅轉(zhuǎn)為黃色，表示有糖類發(fā)酵第24頁/共44頁三糖鐵（TSI）瓊脂試驗本試驗可同時觀察乳糖和蔗糖發(fā)酵產(chǎn)酸或產(chǎn)酸產(chǎn)氣（變黃）；產(chǎn)生硫化氫（變黑）。葡萄糖被分解產(chǎn)酸可使斜面先變黃，但因量少，生成的少量酸，因接觸空氣而氧化，加之細菌利用培養(yǎng)基中含氮物質(zhì)，生成堿性產(chǎn)物，故使斜面后來又變紅，底部由于是在厭氧狀態(tài)下，酸類不被氧化，所以仍保持黃色。a.uninoculated

b.littlechange/alkaline/-/-

c.alkaline/acid/-/+

d.acid/acid/+/+

e.acid/acid/+/-

slantcolor/buttcolor/gasproduction/hydrogensulfideproduction第25頁/共44頁第26頁/共44頁制好的培養(yǎng)基對照管斜面紅色，底面黃色培養(yǎng)基全黃色斜面、底部黃色，并產(chǎn)生H2S斜面紅色，底部黑色，產(chǎn)生H2S底面黃色，并產(chǎn)生CO2第27頁/共44頁（1）斜面堿性（紅色-）底部酸性（黃色+）產(chǎn)氣或不產(chǎn)氣（產(chǎn)氣時會造成瓊脂裂開）：表示僅葡萄糖發(fā)酵。因微生物優(yōu)先分解葡萄糖產(chǎn)酸，使培養(yǎng)基變黃，但因葡萄糖含量低，于斜面產(chǎn)生之微量酸立即氧化而呈堿性反應(yīng)，同時培養(yǎng)基中的蛋白質(zhì)也隨之利用而產(chǎn)堿，培養(yǎng)基底部則因氧張力較小，且微生物生長較慢，故仍維持酸性反應(yīng)。（2）斜面酸性（黃色+）底部酸性（黃色+）產(chǎn)氣或不產(chǎn)氣：表示除了葡萄糖發(fā)酵外，乳糖與（或）蔗糖也發(fā)酵。由于乳糖與蔗糖濃度高，經(jīng)繼續(xù)發(fā)酵，可維持培養(yǎng)基斜面與底部保持酸性反應(yīng)。第28頁/共44頁（3）斜面堿性（紅色-）底部堿性（紅色-）或無變化（橘紅色）：表示無糖類發(fā)酵。而蛋白質(zhì)則于有氧或厭氧條件下進行代謝產(chǎn)生氨，而使培養(yǎng)基呈堿性反應(yīng)，如有氧與厭氧均發(fā)生蛋白質(zhì)分解，則斜面與底部均呈堿性反應(yīng)。

為使結(jié)果準(zhǔn)確，應(yīng)于接種培養(yǎng)18-24小時內(nèi)觀察結(jié)果，以確保糖類尚未用盡，且蛋白質(zhì)分解之堿性終產(chǎn)物尚未產(chǎn)生。第29頁/共44頁培養(yǎng)基變黑（4）三糖鐵瓊脂培養(yǎng)基中亦含有硫代硫酸鈉若微生物有硫化氫產(chǎn)生，會與亞鐵離子作用生成不溶性硫化亞鐵之沉淀，進而使培養(yǎng)基變黑。第30頁/共44頁腸桿菌科各屬在三糖鐵瓊脂內(nèi)的反應(yīng)結(jié)果

斜面底層產(chǎn)氣硫化氫可能的菌屬和種－＋＋/－＋沙門氏菌屬、弗勞地氏檸檬酸桿菌、變形桿菌屬、緩慢愛德華氏菌＋＋＋/－＋沙門氏菌Ⅲ、弗勞地氏檸檬酸桿菌、普通變形桿菌－＋＋－沙門氏菌屬、大腸埃希氏菌、蜂窩哈夫尼亞菌、摩根氏菌，普羅菲登斯菌屬－＋－－傷寒沙門氏菌，雞沙門氏菌、志賀氏菌屬、大腸埃希氏菌、蜂窩哈夫尼亞菌、摩根氏菌，普羅菲登斯菌屬＋＋＋/－－大腸埃希氏菌、腸桿菌屬、克雷伯氏菌屬、沙雷氏菌屬、弗勞地氏檸檬酸桿菌注：＋陽性；－陰性；＋/－多數(shù)陽性，少數(shù)陰性第31頁/共44頁腸桿菌科各屬生化反應(yīng)初步鑒別表

反應(yīng)序號硫化氫（H2S）靛基質(zhì)pH7.2尿素氰化鉀（KCN）賴氨酸脫羧酶判定結(jié)果A1＋－－－＋沙門氏菌屬A2＋＋－－＋沙門氏菌屬（少見）緩慢愛德華氏菌A3＋－＋＋－弗勞地氏檸檬酸桿菌、奇異變形桿菌A4＋＋＋＋－普通變形桿菌B1－－－－－－－－＋－沙門氏菌屬、大腸埃希氏菌、甲型副傷寒沙門氏菌大腸埃希氏菌、志賀氏菌屬B2－－＋＋－－－＋－大腸埃希氏菌大腸埃希氏菌、志賀氏菌屬B3－－－－＋/－＋＋＋＋－克雷伯氏菌族各屬陰溝腸桿菌、弗勞地氏檸檬酸桿菌B4－＋＋/－＋－摩根氏菌，普羅菲登斯菌屬注1：三糖鐵瓊脂底層均產(chǎn)酸，不產(chǎn)氣者可排除；斜面產(chǎn)酸與產(chǎn)氣與否均不限。注2：KCN和賴氨酸可選作其中一項，但不能判定結(jié)果時，仍需補做另一項。注3：＋表示陽性；－表示陰性；＋/－表示多數(shù)陽性，少數(shù)陰性。第32頁/共44頁2、靛基質(zhì)（吲哚）試驗陰性（液面黃）陽性（液面玫瑰紅）第33頁/共44頁3、尿素酶試驗陰性（黃）陽性（紅）第34頁/共44頁5、賴氨酸脫羧酶試驗對照陽性（紫）陰性（黃）

4、氰化鉀試驗“渾濁”為“+”第35頁/共44頁ONPG試驗陽性（黃）空白丙二酸鹽試驗陽性（蘭）陰性（不變）第36頁/共44頁沙門氏菌O多價血清凝集試驗

左為陽性

右為陰性對照3/3血清學(xué)試驗結(jié)果第37頁/共44頁結(jié)果報告凡血清學(xué)鑒定與生化反應(yīng)均符合沙門氏菌者報告：×××食品25g檢出沙門氏菌反之則報告：×××食品25g未檢出沙門氏菌第38頁/共44頁

出口食品沙門氏菌屬（包括亞利桑那菌）檢驗方法

肉類、蛋品緩沖胨水（BPW）四硫磺酸鹽煌綠（TTB）亞硒酸鹽胱氨酸（SC）37℃4hor20～24h直接選擇性增菌亞硒酸鹽胱氨酸（SC）四硫磺酸鹽煌綠（TTB）37℃24±2h

BS&DHL(亞利桑那菌瓊脂)

前增菌37℃24～48hTSI&賴氨酸脫羧酶TSI&尿素酶37℃24～48h生化試驗血清學(xué)試驗（“O”抗原，“Vi”抗原）42℃20±2h37℃24～48h結(jié)果判定檢驗檢疫行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)SN0170－92第39頁/共44頁

樣品（20類）25g225mL乳糖肉湯（LB）or胰酪胨大豆肉湯（TSB）or煌綠溶液（BG）or通用前增菌肉湯（UPB）or營養(yǎng)肉湯（NB）or再造脫脂奶粉or四硫酸鹽煌綠（TT）pH6.8±0.224±2h35℃RVTT

43±0.2℃or35±2.0℃24±2h

24±2h42±0.2℃BS&XLD&HE24±2h35℃TSI&LIA非沙門菌沙門菌非沙門菌LIA+LIA－TSIK/ALIA－TSIA/A&尿素酶，H抗原（多價H抗血清或Spicer-Edwardsflagellar(H)test），賴氨酸脫羧酶，酚紅衛(wèi)矛醇肉湯，色氨酸肉湯（KCN，丙二酸鹽，吲哚），O抗原酚紅乳糖肉湯，酚紅蔗糖肉湯，MR－VP,西蒙氏檸檬酸鹽5種商業(yè)生化鑒定系統(tǒng)（API20E,EnterotubeII,

EnterobacteriaceaeII,MICRO-ID,orVitekGNI）&O抗原&H抗原細菌學(xué)分析手冊（FDA/BAM）第五章沙門菌屬第40頁/共44頁肉、禽和蛋品中沙門菌的分離和鑒定USDA/FSISMLG4.02樣品BPWorBPW（含結(jié)晶紫）35±1℃20-24hBGS&DMLIAorXLT442±0.5℃22~24h0.5±0.05mL＋10mLTT0.1±0.02mL＋10mLmRV42±0.5℃22~24h35±1℃18~24h&48hTSI&LIA血清學(xué)試驗商業(yè)生化試劑盒或自動鑒定系統(tǒng)or傳統(tǒng)生化鑒定（AOACOfficialMethod967.27or"EdwardsandEwing'sIdentificationofEnterobacteriacea